本发明涉及酶工程，尤其是指α-1,2-岩藻糖基转移酶高通量筛选方法及筛选得到的突变体。
背景技术：
1、岩藻糖基转移酶(fucts)在生物体内扮演着重要的角色，它们参与多种生理和病理过程，包括炎症、细菌和病毒感染、肿瘤转移和遗传紊乱。这些酶通过催化l-岩藻糖从供体底物转移到各种糖受体底物，包括低聚糖、糖蛋白和糖脂，从而影响这些生物分子的功能。在疾病诊断和药物研发中，岩藻糖基转移酶也显示出其重要性，例如在某些癌症患者体内，岩藻糖基转移酶活性较高，可以通过检测该酶的活性来辅助肿瘤的诊断和疗效监测。其中，α-1,2岩藻糖基转移酶(futc)占有重要地位，因其能催化合成2’-岩藻糖基乳糖(2’-fl)，这是一种具有多种生理功能的化合物，包括抑制病原菌感染、调节肠道菌群和增强免疫力。2’-fl已被批准作为婴幼儿奶粉和特需食品中的营养成分。幽门螺旋杆菌(helicobacter pylori)来源的α-1,2岩藻糖基转移酶是目前2’-fl生物合成中使用最广泛的一种，但其在微生物表达系统中催化活性低，异源表达量差，这限制了2’-fl的合成效率。
2、为了提高α-1,2岩藻糖基转移酶的催化性能和表达量，定向进化成为一种有效的策略。定向进化通过模拟达尔文进化过程，通过随机突变和重组，人为制造大量突变，按照特定的需要和目的给予选择压力，筛选出具有期望特征的蛋白质。例如，通过半理性设计的位点饱和突变，可以提高幽门螺杆菌α-1,2-岩藻糖基转移酶的催化活性和热稳定性。这种策略对于解决futc的技术瓶颈和2’-fl的工业化应用具有重要意义。
3、在定向进化过程中，构建高通量筛选方法是不可或缺的。目前，研究人员开发了多种基于底物、产物或其对应衍生化合物具有的紫外或荧光特性而建立的光化学分析技术，这些方法已广泛应用于酶工程、代谢工程等领域。然而，对于筛选高活性α-1,2岩藻糖基转移酶，目前尚未有一种合理高效的高通量筛选方法，这限制了2’-岩藻糖基乳糖生物合成的发展。因此，开发新的高通量筛选方法对于发现和改进α-1,2岩藻糖基转移酶至关重要，这将有助于提高2’-fl的生产效率和降低成本，进一步推动其在食品和医药领域的应用。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种α-1,2-岩藻糖基转移酶高通量筛选方法，包括构建2’-岩藻糖基乳糖的指示菌株使荧光强度与2’-岩藻糖基乳糖呈正相关，在底盘菌株中表达β-半乳糖苷酶、l-岩藻糖激酶和α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体文库，将底盘菌株进行油包水液滴包埋并将其与指示菌株共培养，通过液滴微流控分选得到正向突变的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体。
2、本发明的第一个目的是提供一种α-1,2-岩藻糖基转移酶的高通量筛选方法，包括以下步骤：
3、步骤s1、构建2’-岩藻糖基乳糖的指示菌株，所述指示菌株包含第一表达载体和第二表达载体，所述第一表达载体包含α-l-岩藻糖苷酶编码基因，所述第二表达载体包含乳糖操纵子和荧光报告基因，α-l-岩藻糖苷酶将2’-岩藻糖基乳糖降解为乳糖，与乳糖操纵子结合调控荧光报告基因表达，使2’-岩藻糖基乳糖含量与荧光强度偶联；
4、步骤s2、构建底盘菌株，所述底盘菌株表达l-岩藻糖激酶编码基因和α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体文库；
5、步骤s3、对底盘菌株进行单细胞液滴包埋和液滴培养，得到液滴微流控芯片，所述液滴培养在包含岩藻糖和乳糖的培养基中进行；
6、步骤s4、使指示菌株菌悬液与液滴一对一融合，共同培养后根据融合液滴内荧光强度进行液滴微流控分选，得到包含α-1,2-岩藻糖基转移酶正向突变体的底盘菌株。
7、进一步地，步骤s1中，所述第一表达载体还包含信号肽male编码基因。
8、进一步地，步骤s2中，所述底盘菌株中还包括温控表达载体，所述温控表达载体调控β-半乳糖苷酶编码基因的表达。
9、进一步地，步骤s3中，先将液滴置于第一温度条件下培养，使底盘菌株将岩藻糖和乳糖转化为2’-岩藻糖基乳糖，之后将液滴置于第二温度条件下培养至底盘菌株将乳糖完全降解。
10、进一步地，所述温控表达载体为pbv220。
11、进一步地，步骤s2中，所述底盘菌株敲除udp-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaj。
12、进一步地，步骤s3中，所述液滴为油包水液滴。
13、进一步地，油相为2％pico-surf in novec 7500。
14、进一步地，步骤s4中，所述指示菌株菌悬液在600nm处的吸光值为10-12。
15、在本发明的一个实施例中，所述指示菌株菌悬液在600nm处的吸光值为10。
16、本发明的第二个目的是提供一种α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体，对氨基酸序列如seq id no.x所示的出发序列作出以下任一种改造：
17、(1)第93位缬氨酸突变为异亮氨酸；
18、(2)第50位谷氨酸突变为甘氨酸；
19、(3)第81位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第173缬氨酸突变为异亮氨酸；
20、(4)第102位赖氨酸突变为谷氨酸，第284位色氨酸突变为半胱氨酸。
21、本发明的第三个目的是提供编码上述α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的基因。
22、本发明的第四个目的是提供包含上述基因的表达载体。
23、本发明的第五个目的是提供包含上述α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体、上述基因或上述表达载体的宿主细胞。
24、进一步地，所述宿主细胞为细菌或真菌。
25、进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌。
26、在本发明的一个实施例中，所述宿主细胞为大肠杆菌k12 mg1655。
27、本发明的第六个目的是提供上述α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体、上述基因、上述表达载体或上述宿主细胞在生产2’-岩藻糖基乳糖中的应用。
28、本发明的第七个目的是提供一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌，所述大肠杆菌敲除β-半乳糖苷酶编码基因和udp-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因，异源表达l-岩藻糖激酶编码基因和权利要求9所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体。
29、本发明的第八个目的是提供包含上述大肠杆菌的微生物菌剂。
30、本发明的第九个目的是提供一种生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，包括采用权利要求14所述大肠杆菌或权利要求15所述微生物菌剂进行发酵生产的步骤。
31、本发明的有益效果：
32、本发明提供了一种高通量筛选α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的方法，通过构建2’-岩藻糖基乳糖指示菌株和底盘菌株，借助液滴微流控筛选技术，实现了对α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的快速筛选，提高了筛选效率。通过荧光报告基因的荧光强度与2’-岩藻糖基乳糖含量的正相关性，可以直观、快速地评估α-1,2-岩藻糖基转移酶的活性，从而筛选出高产2’-岩藻糖基乳糖的底盘菌株。通过温控表达载体，可以在不同的温度下控制β-半乳糖苷酶编码基因的转录，解决了底物乳糖可能造成的噪声干扰，进一步优化了筛选过程。使用本发明提供的方法筛选得到的突变体futcv93i的酶活为futc的2.31倍，提高了α-1,2-岩藻糖基转移酶的筛选效率和2’-岩藻糖基乳糖的生产效率，具有重要的工业应用前景，有利于2’-岩藻糖基乳糖的工业化生产及其在食品和医药等领域的大规模应用推广。