一种程序性死亡受体1的纳米抗体及其制备方法和应用与流程

本发明属于抗体，涉及一种程序性死亡受体1的纳米抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、程序性死亡分子1(pd-1)是一种重要的免疫抑制分子，属于免疫球蛋白超家族。pd-1在激活的t细胞和b细胞中表达，主要作用是抑制细胞的激活，这是免疫系统的一种正常的自稳机制，因为过度的t/b细胞激活会引起自身免疫病。pd-1与其配体pd-l1和pd-l2结合后，可以启动t细胞的程序性死亡，使肿瘤细胞获得免疫逃逸。在肿瘤微环境中，肿瘤细胞可能会高表达pd-l1和pd-l2，导致肿瘤微环境中pd-1通路持续激活，t细胞功能被抑制，无法杀伤肿瘤细胞。pd-1的抗体可以阻断这一通路，部分恢复t细胞的功能，使这些细胞能够继续杀伤肿瘤细胞，因此，抗程序性死亡分子1(pd-1)抗体具备开发防止肿瘤免疫逃逸药物的潜力。

2、抗pd-1抗体是一类靶向pd-1/pd-l1信号通路的免疫检查点抑制剂，通过阻断pd-1与其配体pd-l1的结合，恢复t细胞的活性，增强机体对肿瘤细胞的免疫应答。目前，全球已有多种pd-1/pd-l1抗体药物获批上市，用于治疗多种类型的癌症，如非小细胞肺癌、黑色素瘤等，pd-1抗体在临床上的应用已经取得了显著的治疗效果，但同时也存在一些问题和挑战，例如：疗效的个体差异：不同患者对pd-1抗体的治疗反应存在显著差异，只有部分患者能够获得长期疗效；耐药性问题：一些患者在接受pd-1抗体治疗后可能会出现耐药，导致治疗失效。

3、综上所述，开发新型的抗pd-1抗体，挖掘有效的免疫检查点抑制剂，对于肿瘤治疗领域具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种程序性死亡受体1的纳米抗体及其制备方法和应用，开发新型的程序性死亡受体1的纳米抗体，为pd-1/pd-l1通路的阻断提供新的治疗策略。

2、为达此目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种程序性死亡受体1的纳米抗体，所述纳米抗体包括重链可变区，所述重链可变区的cdr1的氨基酸序列包括seq id no.1所示的序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.2所示的序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.3所示的序列。

4、本发明利用pd-1蛋白免疫羊驼，构建抗体展示文库，筛选结合pd-1蛋白的抗体，获得具备高特异性和亲和力的程序性死亡受体1的纳米抗体，且具备阻断pd-1和pd-l1结合的能力，增强免疫细胞的功能。

5、优选地，所述程序性死亡受体1的纳米抗体的氨基酸序列包括seq id no.4所示的序列。

6、seq id no.1：anafskyd。

7、seq id no.2：lvaritsglst。

8、seq id no.3：nreirgssgiwypldy。

9、seq id no.4：

10、maavqlvdsggglvqpggslrlscaasanafskydvgwyrqapgkqr elvaritsglstnyadsvkgrftisrdnakntvylqmdslkpedtavyycnre irgssgiwypldywgqgtqvtvssahhsedpssaaasgheg。

11、第二方面，本发明提供一种重组程序性死亡受体1的纳米抗体，所述重组程序性死亡受体1的纳米抗体含有人源fc区和第一方面所述的程序性死亡受体1的纳米抗体。

12、优选地，所述人源fc区包括ig fc。

13、优选地，所述ig fc包括igg1、igg2、igg3或igg4的fc段中的任意一种。

14、优选地，所述igg1的fc段氨基酸序列包括seq id no.5所示的序列。

15、seq id no.5：

16、epkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。

17、优选地，所述重组程序性死亡受体1的纳米抗体的氨基酸序列包括seq id no.6所示的序列。

18、seq id no.6：

19、maavqlvdsggglvqpggslrlscaasanafskydvgwyrqapgkqrelvaritsglstnyadsvkgrftisrdnakntvylqmdslkpedtavyycnreirgssgiwypldywgqgtqvtvssahhsedpssaaasghegahhsedpssaaasgatkaepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。

20、第三方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的程序性死亡受体1的纳米抗体或第二方面所述的重组程序性死亡受体1的纳米抗体。

21、第四方面，本发明提供一种重组表达载体，所述重组表达载体含有第二方面所述的核酸分子。

22、第五方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞含有第三方面所述的核酸分子。

23、第六方面，本发明提供一种第一方面所述的程序性死亡受体1的纳米抗体或第二方面所述的重组程序性死亡受体1的纳米抗体的制备方法，所述制备方法包括：

24、将第一方面所述的程序性死亡受体1的纳米抗体或第二方面所述的重组程序性死亡受体1的纳米抗体的编码核酸插入表达载体，得到重组载体，将所述重组载体导入宿主细胞，或者，将第一方面所述的程序性死亡受体1的纳米抗体或第二方面所述的重组程序性死亡受体1的纳米抗体的编码核酸插入宿主细胞基因组；

25、得到重组细胞，培养重组细胞，进行抗体纯化。

26、优选地，所述宿主细胞包括哺乳动物细胞。

27、第七方面，本发明提供第一方面所述的程序性死亡受体1的纳米抗体、第二方面所述的重组程序性死亡受体1的纳米抗体、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的重组表达载体或第五方面所述的重组细胞在制备结合程序性死亡受体1的制剂中的应用。

28、本发明挖掘获得具备高特异性和亲和力的程序性死亡受体1的纳米抗体，且具备阻断pd-1和pd-l1结合的能力，增强免疫细胞的功能，可作为免疫检查点抑制剂，应用于肿瘤治疗等。

29、优选地，所述结合程序性死亡受体1的制剂包括治疗肿瘤的药物。

30、优选地，所述肿瘤包括肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、脑癌、胰腺癌、鼻咽癌、宫颈癌、淋巴瘤、卵巢癌、骨肿瘤、黑色素瘤、膀胱癌、前列腺癌或睾丸癌中至少一种。

31、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

32、本发明利用pd-1蛋白免疫羊驼，构建抗体展示文库，筛选结合pd-1蛋白的抗体，获得具备高特异性和亲和力的程序性死亡受体1的纳米抗体，且具备阻断pd-1和pd-l1结合的能力，可应用于开发肿瘤治疗药物，同时纳米抗体更容易进行改造，如人源化、多价性构建等，且生产成本低，适合大规模生产。