用于实时荧光定量PCR的组合物及其应用

本发明涉及核酸或微生物的测定或检验，尤其涉及一种用于实时荧光定量pcr的组合物及其应用。

背景技术：

1、在现代生物学研究与临床诊断领域，核酸检测技术始终占据着举足轻重的地位。传统的pcr技术能够在体外快速扩增特定的dna片段，然而其只能在反应结束后对扩增产物进行定性分析，无法精确测定起始模板的拷贝数，并且在扩增后开盖检测的过程中，极易引发交叉污染，严重影响实验结果的准确性和可靠性。随着科技的不断进步，为了弥补传统pcr 的不足，实时荧光定量 pcr 技术应运而生。它巧妙地将荧光信号与pcr扩增相结合，在pcr反应进行的同时，对荧光信号进行实时监测。通过对荧光信号的动态变化进行分析，不仅能够准确地对起始模板进行定量，还能有效避免扩增后开盖检测带来的污染问题，显著提升了检测的灵敏度、准确性与重复性。

2、taqman探针法作为实时荧光定量pcr方法中的一种，其是在加入一对引物进行pcr扩增的同时加入一个特异性荧光探针，探针两端分别标记一个荧光基团和一个淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；pcr 扩增时，taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使荧光基团和淬灭基团分离，荧光监测系统可接收到荧光信号，荧光信号累积与pcr产物形成完全同步，根据荧光信号与扩增循环数之间的关系就可以得到实时扩增曲线，实现模板拷贝数的定量检测。

3、taqman探针法最大的优势在于其高通量和高敏感性，且无需在pcr后进行电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差。但是taqman探针的设计对序列有较高的要求，探针过短会造成探针tm过低而无法杂交到靶序列上，过长则会导致探针特异性降低；尤其对于同时检测多种病原体，引物之间的干扰会导致检测特异性降低，无法同时检测或区分多个型别；且使用taqman方法进行多重pcr体系构建时，通常会受限于仪器荧光通道数量；分管进行构建的话，也会增加试剂成本，操作也比较麻烦。

技术实现思路

1、本发明提供一种用于实时荧光定量pcr的组合物，可实现多重靶标检测。

2、第一方面，本发明提供一种用于实时荧光定量pcr的组合物，包括特异性正向引物、特异性反向引物和特异性探针，其中：

3、所述特异性正向引物和特异性反向引物用于扩增靶dna；

4、所述特异性反向引物3’端起第i个核苷酸和第（i+1）个核苷酸之间添加阻断基团，4≤i≤8，且i为正整数；

5、所述特异性探针满足如下条件：

6、1)所述特异性探针为单链核酸分子；

7、2)所述特异性探针的第一端的第1位核苷酸标记有荧光基团，所述特异性探针的第一端起第n个核苷酸标记有第一淬灭基团，所述特异性探针的第二端的第1位核苷酸标记有第二淬灭基团，9≤n≤30，n为正整数，且n小于所述特异性探针的核苷酸总数；

8、3)所述特异性探针的部分核苷酸序列与所述特异性反向引物3’端起第1个核苷酸至第i个核苷酸之间的核苷酸序列相同；

9、4)所述特异性探针不与所述特异性正向引物结合；

10、5)所述特异性探针不与所述特异性反向引物结合。

11、在本发明中，所述靶dna是指与靶核酸片段对应的dna片段，靶核酸片段可以为dna或rna，靶核酸片段是指存在于待检测病原体基因中特定区域的一段具有一定特异性的可以作为检测目标的核酸片段，该核酸片段可以与其他病原体或待检测样品自身基因序列有明显区别。对于遗传物质为dna的病原体，所述靶核酸片段为靶dna；对于遗传物质为rna的病原体，所述靶核酸片段逆转录后得到所述靶dna。

12、在本发明中，所述病原体是指能够引起宿主（如人类、动物、植物等）疾病的生物或物质，例如病毒、衣原体、立克次体、支原体、细菌、螺旋体和真菌等微生物和寄生虫等。在一种具体实施方式中，所述病原体为病毒。进一步地，所述病毒的遗传物质可以为dna。

13、在本发明中，所述靶dna为双链dna，所述特异性正向引物能够与靶dna中的一条链特异结合，所述特异性反向引物能够与靶dna中的另一条链特异结合，在dna聚合酶的作用下以双链dna为模板进行延伸反应。所述特异性正向引物和特异性反向引物均为单链dna。

14、在本发明中，所述特异性正向引物和特异性反向引物的设计原则与本领域常规正向引物和反向引物的设计原则相同或相似，区别在于，本发明在所述特异性反向引物3’端起第i个核苷酸和第（i+1）个核苷酸之间添加阻断基团，4≤i≤8，且i为正整数（i为4、5、6、7、8中的一个），同时i小于所述特异性反向引物的核苷酸总数；当使用上述特异性正向引物和特异性反向引物对靶dna进行pcr扩增时，特异性正向引物与靶dna的模板链结合并进行延伸，遇到阻断基团后延伸停止，得到一条链长度小于另一条链的双链扩增产物。

15、进一步地，所述特异性反向引物的核苷酸总数可以为18-35个核苷酸。

16、在本发明中，所述特异性探针可以为单链dna分子。

17、在本发明中，所述第一端可以为特异性探针的5’末端，相应的，所述第二端即为所述特异性探针的3’末端；所述第一端还可以为特异性探针的3’末端，相应的，所述第二端即为所述特异性探针的5’末端。

18、在本发明中，n可以为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30中的任一种。

19、在本发明中，所述特异性探针的部分核苷酸序列与所述特异性反向引物3’端起第1个核苷酸至第i个核苷酸之间的核苷酸序列相同。进一步地，所述特异性探针中与所述特异性反向引物相同的核苷酸序列应当靠近所述特异性探针的两端，以便于和双链扩增产物中长度较短的dna链结合，提高结合率。更进一步地，所述特异性探针中与所述特异性反向引物相同的核苷酸序列靠近所述特异性探针的3’端，即位于所述特异性探针中被第一淬灭基团和第二淬灭基团修饰的核苷酸之间。

20、本发明中，上述结合是指特异性探针不会与特异性正向引物或特异性反向引物互为模板进行pcr扩增，即在不添加靶dna或者待检测样品不含有相应病原体的情况下，特异性探针保持卷曲状态，标记在所述特异性探针第一端的荧光基团所发出的荧光信号会被第一淬灭基团或/和第二淬灭基团吸收，进而无法检测到相应的荧光信号。当pcr体系中存在至少两种特异性正向引物和特异性反向引物时，特异性探针也不与靶向其他靶dna的特异性引物对结合。

21、本发明所涉及的原理如图1所示，具体地：当靶双链dna存在的情况下，本发明提供的特异性正向引物和特异性反向引物与靶dna特异性结合并延伸产生预扩增产物，预扩增产物包括一条长度较短的dna链和一条长度较长的dna链；同时，特异性探针可与预扩增产物中长度较短的dna链通过碱基互补配对结合，并沿该dna链5’到3’的方向继续进行pcr扩增，随着pcr扩增的进行，特异性探针结构发生改变（主要是荧光基团和淬灭基团之间距离的改变），使得荧光基团发出的荧光信号无法被第一淬灭基团和第二淬灭基团吸收，荧光信号可被仪器检测到。当靶双链dna不存在的情况下，特异性正向引物和特异性反向引物不与特异性探针互为模板链结合并延伸，特异性探针保持卷曲状态，荧光基团发出的荧光信号被第一淬灭基团或第二淬灭基团（主要是第一淬灭基团）吸收，荧光信号无法被检测。通过观察是否有荧光信号，即可判断是否有靶双链dna的存在，确定待检测样品是否含有待检测病原体，实现病原体的定性检测。

22、当需要对待检测样品中是否含有多种病原体进行多重pcr检测时，可通过改变特异性探针标记的荧光基团对不同靶标进行区分；当受限于荧光通道数量时，即在对特异性探针标记相同的荧光基团的情况下，通过改变各靶标pcr产物的熔解温度（tm值），在pcr扩增结束后，进行熔解曲线分析，结合特异性探针所携带的荧光基团类型与各靶标pcr产物的不同tm值，也可以实现多重靶标检测。

23、以hpv 18型为例对上述检测过程进行说明：本发明提供的用于检测hpv 18型的靶dna的核苷酸序列如seq id no:35所示；针对上述靶dna，本发明提供的特异性正向引物的核苷酸序列为5’-ggtgacactgtgcctcaatcct-3’（seq id no:21），特异性反向引物的核苷酸序列为5’- acacacagctgccaggtgaag-3’（前16个核苷酸序列为seq id no:22），且在5’端起第16位核苷酸（g）与第17位核苷酸（t）之间连接阻断基团，特异性探针的核苷酸序列为5’-actgccagtccatcaacctatctgtgcaatggctgacatcccctaatgctgaagcaggc -3’（seq id no:34），且5’端起第1位核苷酸（a）标记有荧光基团，第13位核苷酸（t）标记有第一淬灭基团，第59位核苷酸（c）上标记有第二淬灭基团。当使用上述特异性正向引物和特异性反向引物对靶dna进行pcr扩增后，得到的预扩增产物包括核苷酸序列为5’-ggtgacactgtgcctcaatccttatatattaaaggcacaggtatgcctgcttca-3’（seq id no:49）的dna链，该dna链3’端起第1位核苷酸至第5位核苷酸（如上述序列中下划线所示）与特异性探针5’端起第50位核苷酸至第54位核苷酸（如上述序列中下划线所示）通过互补配对结合，由于特异性探针的3’端标记有第二淬灭基团，无法引发dna聚合酶的延伸反应，因此，所述dna链充当引物的作用，以特异性探针为模板进行延伸发生二次pcr扩增，第二次扩增产物与特异性探针形成双链结构，荧光基团发出的荧光信号无法被淬灭基团吸收，荧光信号被检测，表明靶dna存在。

24、如上所述的组合物，所述特异性正向引物与特异性反向引物的摩尔比大于等于3：1，提高能够与特异性探针结合的扩增产物链。进一步地，所述特异性正向引物与特异性反向引物的摩尔比为3：1-10：1，具体可以为3：1、3.5：1、4：1、4.5：1、5：1、5.5：1、6：1、6.5：1、7：1、7.5：1、8：1、8.5：1、9：1、9.5：1、10：1或介于其中的任意两者组成的范围之内。更进一步地，所述特异性正向引物与特异性反向引物的摩尔比为10：1。

25、如上所述的组合物，所述特异性探针的长度为20-60nt；gc含量在40%-60%。

26、如上所述的组合物，所述阻断基团为c3 spacer、c6 spacer、c9 spacer、c12spacer中的至少一种。

27、如上所述的组合物，所述荧光基团选自fam（羧基荧光素）、joe（羧基二甲基荧光素）、tamra（四甲基罗丹明）、rox（罗丹明 x）、cy3、cy5、vic、hex（六氯荧光素）中的至少一种。

28、如上所述的组合物，所述淬灭基团选自bhq1、bhq2中的至少一种。

29、第二方面，本发明提供制备上述任一所述组合物的方法，包括：

30、s1、提供上述组合物中的特异性正向引物、特异性反向引物和特异性探针；

31、s2、将所述特异性正向引物、特异性反向引物和特异性探针组合得到所述组合物。

32、在本发明中，所述阻断基团、荧光基团和淬灭基团的修饰方法可根据本领域常规方法进行。

33、在本发明中，所述特异性正向引物、特异性反向引物和特异性探针可以单独包装，也可以混合在一起。

34、第三方面，本发明提供上述任一所述组合物的应用，所述应用为a1)-a4)中的至少一种：

35、a1)在实时荧光定量pcr分析中的应用；

36、a2)在制备实时荧光定量pcr分析产品中的应用；

37、a3)在检测病原体中的应用；

38、a4)在制备检测病原体的产品中的应用。

39、第四方面，本发明提供一种基于实时荧光定量pcr进行病原体检测的方法，包括：

40、d1、根据待检测病原体的靶核酸片段，提供如上所述的组合物；制备待检测样品的核酸；

41、d2、利用所述组合物对所述核酸进行实时荧光定量pcr，确定待检测样品是否含有所述待检测病原体。

42、如上所述的方法，所述待检测样品的核酸可以为双链dna。

43、如上所述的方法，本发明的方法适合任何病原体，如基因组是rna或dna的病原体。

44、如上所述的方法，所述方法的直接目的可为非疾病诊断和/或非疾病治疗目的。上述应用或方法为非疾病诊断的应用或方法。上述应用或方法不以获得有生命的人体或动物体的疾病诊断结果或健康状况为直接目的。

45、如上所述的方法，所述方法为非疾病治疗目的的应用或方法。上述方法不以使有生命的人体或者动物体恢复或获得健康或减少痛苦为直接目的。

46、如上所述的方法，所述待检测样品可为来自非有生命的人体或动物体的样品，如环境样品（如空气）、衣物或毛巾或作为食品的动物组织和/或器官等。

47、如上所述的方法，所述正向引物在反应体系中的摩尔浓度为90-1000nm，具体可以为90nm、100 nm、150 nm、200 nm、250 nm、300 nm、350 nm、400 nm、450 nm、500 nm、550 nm、600 nm、650 nm、700 nm、750 nm、800 nm、850 nm、900 nm、950 nm、1000 nm或介于其中的任意两者组成的范围之内。

48、如上所述的方法，所述反向引物在反应体系中的摩尔浓度为30-100 nm，具体可以为30nm、35nm、40nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm或介于其中的任意两者组成的范围之内。

49、如上所述的方法，所述探针在反应体系中的摩尔浓度为100-1000 nm，具体可以为100 nm、150 nm、200 nm、250 nm、300 nm、350 nm、400 nm、450 nm、500 nm、550 nm、600 nm、650 nm、700 nm、750 nm、800 nm、850 nm、900 nm、950 nm、1000 nm或介于其中的任意两者组成的范围之内。

50、如上所述的方法，d2中，可以通过检测荧光信号确定待检测样品是否含有待检测病原体，例如，如果检测到相应的荧光信号，则说明待检测样品中含有待检测病原体，如果未检测到相应的荧光信号，则说明待检测样品中不含有待检测病原体或者含有低于检测限的病原体；此外，针对多重pcr检测，也可以通过检测荧光信号和tm值确定待检测样品中是否含有待检测病原体，例如，如果存在相同的荧光信号，通过熔解曲线分析tm值，进而确定待检测病原体的种类或分型，实现多重靶标检测。

51、可以理解的是，本发明提供的组合物适用于多种病原体检测，本领域技术人员可以根据本发明公开的内容提供针对不同病原体的组合物并进行多重pcr检测。在一种具体实施方式中，待检测的病原体的种类不低于两种，可以为病原体的多种分型，也可以为多种不同类型的病原体。进一步地，待检测的病原体的种类不低于三种。更进一步地，待检测的病原体的种类不低于四种。

52、第五方面，本发明提供用于检测人乳头瘤病毒的组合物，包括用于检测hpv 58型的第一组合物、用于检测hpv 56型的第二组合物、用于检测hpv 52型的第三组合物、用于检测hpv 59型的第四组合物、用于检测hpv 39型的第五组合物、用于检测hpv 68型的第六组合物、用于检测hpv 16型的第七组合物、用于检测hpv 33型的第八组合物、用于检测hpv 31型的第九组合物、用于检测hpv 45型的第十组合物、用于检测hpv 18型的第十一组合物、用于检测hpv 66型的第十二组合物、用于检测hpv 35型的第十三组合物和用于检测hpv 51型的第十四组合物中的至少一种；

53、所述第一组合物包括用于检测hpv 58型的第一正向引物、第一反向引物和第一探针；所述第二组合物包括用于检测hpv 56型的第二正向引物、第二反向引物和第一探针；所述第三组合物包括用于检测hpv 52型的第三正向引物、第三反向引物和第二探针；所述第四组合物包括用于检测hpv 59型的第四正向引物、第四反向引物和第二探针；所述第五组合物包括用于检测hpv 39型的第五正向引物、第五反向引物和第二探针；所述第六组合物包括用于检测hpv 68型的第六正向引物、第六反向引物和第二探针；所述第七组合物包括用于检测hpv 16型的第七正向引物、第七反向引物和第三探针；所述第八组合物包括用于检测hpv 33型的第八正向引物、第八反向引物和第三探针；所述第九组合物包括用于检测hpv 31型的第九正向引物、第九反向引物和第三探针；所述第十组合物包括用于检测hpv45型的第十正向引物、第十反向引物和第三探针；所述第十一组合物包括用于检测hpv 18型的第十一正向引物、第十一反向引物和第四探针；所述第十二组合物包括用于检测hpv66型的第十二正向引物、第十二反向引物和第四探针；所述第十三组合物包括用于检测hpv35型的第十三正向引物、第十三反向引物和第四探针；所述第十四组合物包括用于检测hpv51型的第十四正向引物、第十四反向引物和第四探针；

54、所述第一正向引物是核苷酸序列为seq id no:1所示的单链dna；

55、所述第二正向引物是核苷酸序列为seq id no:3所示的单链dna；

56、所述第三正向引物是核苷酸序列为seq id no:5所示的单链dna；

57、所述第四正向引物是核苷酸序列为seq id no:7所示的单链dna；

58、所述第五正向引物是核苷酸序列为seq id no:9所示的单链dna；

59、所述第六正向引物是核苷酸序列为seq id no:11所示的单链dna；

60、所述第七正向引物是核苷酸序列为seq id no:13所示的单链dna；

61、所述第八正向引物是核苷酸序列为seq id no:15所示的单链dna；

62、所述第九正向引物是核苷酸序列为seq id no:17所示的单链dna；

63、所述第十正向引物是核苷酸序列为seq id no:19所示的单链dna；

64、所述第十一正向引物是核苷酸序列为seq id no:21所示的单链dna；

65、所述第十二正向引物是核苷酸序列为seq id no:23所示的单链dna；

66、所述第十三正向引物是核苷酸序列为seq id no:25所示的单链dna；

67、所述第十四正向引物是核苷酸序列为seq id no:27所示的单链dna；

68、所述反向引物的结构通式如式1所示：

69、5’-n(a)-y-n(b)-3’ 式1

70、式1中，n(a)、n(b)为核苷酸序列不同的多核苷酸片段，y为阻断基团；

71、所述第一反向引物中，n(a)的核苷酸序列为seq id no:2,n(b)的核苷酸序列为ggacc；

72、所述第二反向引物中，n(a)的核苷酸序列为seq id no:4,n(b)的核苷酸序列为tctac；

73、所述第三反向引物中，n(a)的核苷酸序列为seq id no:6,n(b)的核苷酸序列为tttcc；

74、所述第四反向引物中，n(a)的核苷酸序列为seq id no:8,n(b)的核苷酸序列为ggtag；

75、所述第五反向引物中，n(a)的核苷酸序列为seq id no:10,n(b)的核苷酸序列为tccaa；

76、所述第六反向引物中，n(a)的核苷酸序列为seq id no:12,n(b)的核苷酸序列为cccag；

77、所述第七反向引物中，n(a)的核苷酸序列为seq id no:14,n(b)的核苷酸序列为ggatg；

78、所述第八反向引物中，n(a)的核苷酸序列为seq id no:16,n(b)的核苷酸序列为atgcc；

79、所述第九反向引物中，n(a)的核苷酸序列为seq id no:18,n(b)的核苷酸序列为catct；

80、所述第十反向引物中，n(a)的核苷酸序列为seq id no:20,n(b)的核苷酸序列为gcatg；

81、所述第十一反向引物中，n(a)的核苷酸序列为seq id no:22,n(b)的核苷酸序列为tgaag；

82、所述第十二反向引物中，n(a)的核苷酸序列为seq id no:24,n(b)的核苷酸序列为tccc；

83、所述第十三反向引物中，n(a)的核苷酸序列为seq id no:26,n(b)的核苷酸序列为caatg；

84、所述第十四反向引物中，n(a)的核苷酸序列为seq id no:28,n(b)的核苷酸序列为caacc；

85、所述第一探针是核苷酸序列为seq id no:31的单链dna，且seq id no:31的第1位核苷酸标记有第一荧光基团，第13位核苷酸标记有第一淬灭基团，第49位核苷酸标记有第二淬灭基团；

86、所述第二探针是核苷酸序列为seq id no:32的单链dna，且seq id no:32的第1位核苷酸标记有第二荧光基团，第12位核苷酸标记有第三淬灭基团，第57位核苷酸标记有第四淬灭基团；

87、所述第三探针是核苷酸序列为seq id no:33的单链dna，且seq id no:33的第1位核苷酸标记有第三荧光基团，第12位核苷酸标记有第五淬灭基团，第57位核苷酸标记有第六淬灭基团；

88、所述第四探针是核苷酸序列为seq id no:34的单链dna，且seq id no:34的第1位核苷酸标记有第四荧光基团，第13位核苷酸标记有第七淬灭基团，第59位核苷酸标记有第八淬灭基团。

89、如上所述的组合物，还包括用于检测内参基因的组合物。在一种具体实施方式中，所述内参基因可以为人β-肌动蛋白（beta-actin, β-actin ）对应的靶标dna。进一步地，用于检测人β-肌动蛋白对应靶标dna的组合物包括第十五正向引物、第十五反向引物和所述第一探针；

90、所述第十五正向引物是核苷酸序列为seq id no:29所示的单链dna；

91、所述第十五反向引物的结构通式如式1所示，且n(a)的核苷酸序列为seq id no:30,n(b)的核苷酸序列为tctcg。

92、如上所述的组合物，所述阻断基团为c3 spacer、c6 spacer、c9 spacer、c12spacer中的至少一种。

93、如上所述的组合物，所述第一荧光基团、第二荧光基团、第三荧光基团、第四荧光基团独立地选自fam、joe、tamra、rox、cy3、cy5、vic、hex中的一种，且所述第一荧光基团、第二荧光基团、第三荧光基团、第四荧光基团中的任意两个均不相同。

94、如上所述的组合物，所述第一淬灭基团、第二淬灭基团、第三淬灭基团、第四淬灭基团、第五淬灭基团、第六淬灭基团、第七淬灭基团、第八淬灭基团独立地选自bhq1、bhq2中的一种。

95、第六方面，本发明提供用于检测人乳头瘤病毒的试剂盒，包括上述任一所述组合物。

96、第七方面，本发明提供一种基于实时荧光定量pcr进行人乳头瘤病毒检测的方法，包括：

97、制备待检测样品的核酸；

98、利用上述任一所述的组合物对所述核酸进行实时荧光定量pcr，确定待检测样品是否含有人乳头瘤病毒。

99、在本发明中，所述待检测样品可以为宫颈脱落细胞样品或者环境样品。

100、在本发明中，所述核酸可以为待检测样品的dna。

101、本发明提供一种新的用于实时荧光定量pcr用的特异性正向引物、特异性反向引物和特异性探针，使用上述组合物进行实时荧光定量pcr过程中，通过特异性探针与扩增产物互补配对并继续进行pcr扩增，使得特异性探针上的荧光信号发生变化，可被仪器检测到。结合特异性探针所携带的荧光基团类型与各靶标的pcr产物的不同熔解温度，实现多重靶标检测。