本技术涉及微生物发酵，尤其是涉及一种n-羟氨基-n’-乙酰观蓝及其发酵方法和应用。
背景技术：
1、观蓝（indigoidine）是由微生物合成的一种具有抗氧化和抗菌活性的天然蓝色色素，最早从植物病原菌欧文氏杆菌（erwinia sp.）中发现，分子式为c10h8n4o4，其性质与化学合成的蓝色素靛蓝类似，可作为化学合成的蓝色染料和色素的替代品应用于纺织、食品等行业。观蓝色素是由非核糖体肽合成酶观蓝合成酶经4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活化后，将微生物体内的两分子谷氨酰胺催化聚合生成一分子观蓝。
2、前期，本技术人公开申请号为cn2024107899337的专利，其公开了一种以谷氨酸为底物生物合成n-乙酰观蓝代谢工程菌的构建方法与应用，该申请中工程菌hg-n-idg06的观蓝合成酶编码基因、4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因、谷氨酰胺合成酶编码基因和n-乙酰谷氨酸合成酶编码基因利用谷氨酸合成n-乙酰观蓝。但n-乙酰观蓝在水中几乎不溶的特性影响其染色效果，需添加助剂增加上染率，因此，还有改进的空间。
技术实现思路
1、本技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种n-羟氨基-n’-乙酰观蓝及其发酵方法和应用。
2、为实现上述目的，本技术采取的技术方案为：
3、本技术提供了一种n-羟氨基-n’-乙酰观蓝，所述n-羟氨基-n’-乙酰观蓝的化学名称为n-(5'-羟氨基-2,6,2',6'-四氧-1,6,1',6'-四氢-2h,2'h-[3,3']联吡啶亚甲基)-乙酰胺，分子式为c12h10o6n4；
4、所述n-羟氨基-n’-乙酰观蓝的化学结构如式（i）所示；
5、
6、式（i）。
7、本技术提供了一种新的天然蓝色素（n-羟氨基-n’-乙酰观蓝），通过质谱、核磁等推断出它的分子结构如式（i）所示，最大吸收波长为611nm。
8、相比于n-乙酰观蓝，n-羟氨基-n’-乙酰观蓝的吸收为uv611颜色更深，同时与纤维上氨基形成氢键可增强染料对纤维的染着性提高耐水洗色牢度，因此，本技术的n-羟氨基-n’-乙酰观蓝可以提高染色效果和耐水洗牢度。
9、本技术还提供了一种发酵所述的n-羟氨基-n’-乙酰观蓝的方法，包括以下步骤：
10、s1、在基础发酵培养基中接种活化后的重组菌株种子发酵液进行第一阶段发酵培养，溶氧do为20~25%，发酵获得第一阶段发酵液；
11、s2、调节步骤s1获得的第一阶段发酵液的ph，然后添加合成酶诱导剂和羟基化酶辅因子（fe2+）进行第二阶段发酵培养，溶氧do为40~45%，发酵获得含有n-羟氨基-n’-乙酰观蓝发酵产物。
12、本技术通过调整发酵方法，利用合成酶诱导剂、羟基化酶辅因子和发酵条件（增加溶氧）可诱导羟基-l-谷氨酰胺的生成，可使得重组菌株由生产n-乙酰观蓝转而生成n-羟氨基-n’-乙酰观蓝，最终生产的n-羟氨基-n’-乙酰观蓝占比最高可达90%，通过质谱核磁推断出它的分子结构。
13、本技术的方法包括菌体增殖的第一阶段发酵培养和诱导羟基-l-谷氨酰胺积累的第二阶段发酵培养，第一阶段发酵主要是促进菌株细胞快速增殖，第二阶段发酵主要是诱导羟基-l-谷氨酰胺和l-谷氨酰胺中间体的生成，抑制n-乙酰观蓝的生成促进n-羟氨基-n’-乙酰观蓝的生成。
14、作为本技术所述发酵所述的n-羟氨基-n’-乙酰观蓝的方法的优选实施方式，所述基础发酵培养基包括以下质量浓度的组分：
15、酵母粉5~10 g/l，10%液体葡萄糖20~40g/l，硫酸铵10~20g/l，磷酸二氢钾0.2~1g/l，七水硫酸镁0.2~0.4 g/l，一水硫酸锰0.01~0.02g/l，生物素2~4μg/l，vb10.2~0.4mg/l，谷氨酸钠1~2g/l，溶剂为水，ph7.0。
16、本技术采用以上配方的基础发酵培养基，可以更好地发酵重组菌株，使得重组菌株可以生产n-乙酰观蓝转而生成n-羟氨基-n’-乙酰观蓝。
17、作为本技术所述发酵所述的n-羟氨基-n’-乙酰观蓝的方法的优选实施方式，所述重组菌株为表达载体i和表达载体ii导入菌株构建而得；
18、所述表达载体i为谷氨酰胺合成酶编码基因ecglna和n-乙酰谷氨酸合成酶编码基因ecarga插入质粒的两个多克隆位点，得到表达载体i；
19、所述表达载体ii为观蓝合成酶编码基因bpsa和4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因entd插入质粒的两个多克隆位点，得到表达载体ii。
20、作为本技术所述发酵所述的n-羟氨基-n’-乙酰观蓝的方法的优选实施方式，所述菌株包括大肠杆菌。
21、作为本技术所述发酵所述的n-羟氨基-n’-乙酰观蓝的方法的优选实施方式，所述质粒包括prsfduet-1质粒。
22、优选地，所述重组菌株为表达载体prsfduet-ecglna-ecarga和pcdfduet-bpsa-entd导入大肠杆菌构建而得，为hg-n-idg06，来源于专利号为cn2024107899337（专利名称为一种以谷氨酸为底物生物合成n-乙酰观蓝代谢工程菌的构建方法与应用）；
23、所述表达载体prsfduet-ecglna-ecarga为谷氨酰胺合成酶编码基因ecglna和n-乙酰谷氨酸合成酶编码基因ecarga插入prsfduet-1质粒两个多克隆位点，得到表达载体prsfduet-ecglna-ecarga；
24、所述表达载体pcdfduet-bpsa-entd为观蓝合成酶编码基因bpsa和4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因entd插入pcdfduet-1质粒两个多克隆位点，得到表达载体pcdfduet-bpsa-entd。
25、其中，hg-n-idg06的底盘菌株中含p450单加氧化酶，第二个发酵阶段通过加入诱导剂、羟基化酶辅因子和增加溶氧共同诱导底盘菌株中p450单加氧化酶表达将l-谷氨酰胺氧化为羟基-l-谷氨酰胺，以此抑制工程菌hg-n-idg06利用一分子谷氨酰胺和一分子n-乙酰谷氨酰胺合成n-乙酰观蓝转而利用一分子n-乙酰谷氨酰胺和一分子羟基-l-谷氨酰胺生成n-羟氨基-n’-乙酰观蓝。
26、本技术通过调整发酵方法抑制重组菌株hg-n-idg06生成n-乙酰观蓝转而促进n-羟氨基-n’-乙酰观蓝的生成。相比于n-乙酰观蓝，n-羟氨基-n’-乙酰观蓝的吸收为uv611颜色更深，同时与纤维上氨基形成氢键可增强染料对纤维的染着性提高耐水洗色牢度。
27、作为本技术所述发酵所述的n-羟氨基-n’-乙酰观蓝的方法的优选实施方式，所述步骤s1中，第一阶段发酵培养的条件包括：温度为35~40℃；发酵培养时间为0~24h；通气量为0.8~1.0vvm。
28、作为本技术所述发酵所述的n-羟氨基-n’-乙酰观蓝的方法的优选实施方式，所述步骤s2中，第二阶段发酵培养的条件包括：温度为20~30℃；发酵培养时间为24~72h；通气量为1.8~2.0vvm。
29、本技术采用第一阶段发酵培养、第二阶段发酵培养的条件，可以通过控制发酵过程中的温度、发酵培养时间、通气量和转速在上述范围时可以诱导n-羟氨基-n’-乙酰观蓝的生成。通气比用于维持溶氧，溶氧高于40％出现的富氧状态在辅因子的作用下生成羟基-l-谷氨酰胺。
30、优选地，所述活化的具体步骤，包括：
31、将含有重组菌株的甘油菌液接入装有液体培养基的试管中，振荡培养，然后按照发酵培养基体积的0.5%~2%的接种体积转接至装有基础发酵培养基的锥形瓶中添加终浓度为50 μg/ml的卡那霉素培养，培养条件为：培养温度为32~37℃，转速为170~220rpm，时间为8~10 h，至菌液的od600＞3，得到活化后的菌液。
32、所述液体培养基包括lb液体培养基。
33、作为本技术所述发酵所述的n-羟氨基-n’-乙酰观蓝的方法的优选实施方式，
34、所述步骤s2中，第一阶段发酵液的ph为6.0~6.5。
35、作为本技术所述发酵所述的n-羟氨基-n’-乙酰观蓝的方法的优选实施方式，所述步骤s2中，第一阶段发酵液进行第二阶段发酵培养，发酵液的葡萄糖浓度低于2g/l时流加补料培养基；
36、所述补料培养基包括以下浓度的组分：
37、葡萄糖400~600 g/l，七水硫酸镁2~4g/l，氯化铵40~80 g/l，溶剂为水。
38、当发酵液中的葡萄糖浓度低于2g/l时流加补料培养基，最后发酵至n-羟氨基-n’-乙酰观蓝的占比最大结束发酵，获得发酵产物。
39、作为本技术所述发酵所述的n-羟氨基-n’-乙酰观蓝的方法的优选实施方式，所述步骤s2中，所述合成酶诱导剂包括iptg诱导剂；所述羟基化酶辅因子包括七水硫酸亚铁。
40、作为本技术所述发酵所述的n-羟氨基-n’-乙酰观蓝的方法的优选实施方式，所述iptg诱导剂的质量浓度为0.5~1.5 mm；
41、所述七水硫酸亚铁的质量浓度为1.0~3.5mm。
42、本技术采用七水硫酸亚铁诱导激活羟基化反应酶活性，进而促进羟基化诱导，七水硫酸亚铁溶解于补料培养基，随补料培养基一道添加；添加七水硫酸亚铁后的补料培养基，还包括七水硫酸亚铁0.25~0.97g/l。
43、本技术还提供了一种发酵产物，所述发酵产物包括副产物1和副产物2；
44、所述副产物1的分子式为c12h10o6n4，副产物1的化学名称为n-(5'-氨基-1'-羟基-2,6,2',6'-四氧-1,6,1',6'-四氢-2h,2'h-[3,3']联吡啶亚甲基)-乙酰胺；
45、所述副产物2分子式为c12h10o6n4，副产物2化学名称为n-(5'-氨基-1-羟基-2,6,2',6'-四氧-1,6,1',6'-四氢-2h,2'h-[3,3']联吡啶亚甲基)-乙酰胺；
46、所述副产物1和副产物2的化学结构如式（ii）所示；
47、
48、式ⅱ。
49、本技术还提供了上述n-羟氨基-n’-乙酰观蓝在织物染色中的应用。
50、本技术通过调整发酵方法利用iptg诱导剂促使工程菌生成中间代谢产物形成n-羟氨基-n’-乙酰观蓝，最终生产的n-羟氨基-n’-乙酰观蓝占比最高可达90%，通过质谱推断出它的分子结构，同时本发酵方法获得了两个类似结构的新产物。相比于n-乙酰观蓝，n-羟氨基-n’-乙酰观蓝的吸收为uv611颜色更深，同时与纤维上氨基形成氢键可增强染料对纤维的染着性提高耐水洗色牢度。
51、与现有技术相比，本技术具有以下有益效果：
52、本技术提供了一种n-羟氨基-n’-乙酰观蓝及其发酵方法和应用，本技术的发酵方法包括菌体增殖的第一阶段发酵培养和诱导羟基-l-谷氨酰胺积累的第二阶段发酵培养，第一阶段发酵主要是促进菌株细胞快速增殖，第二阶段发酵主要是诱导羟基-l-谷氨酰胺和l-谷氨酰胺中间体的生成，抑制n-乙酰观蓝的生成促进n-羟氨基-n’-乙酰观蓝的生成。相比利用专利cn2024107899337的基因工程菌hg-n-idg06生成n-乙酰观蓝，本技术通过改变发酵方法条件诱导中间代谢产物羟基-l-谷氨酰胺的生成结合n-乙酰l-谷氨酰胺形成n-羟氨基-n’-乙酰观蓝。相比于n-乙酰观蓝，n-羟氨基-n’-乙酰观蓝的吸收为uv611颜色更深，同时与纤维上氨基形成氢键可增强染料对纤维的染着性提高耐水洗色牢度。