本发明涉及dna纳米，更具体地涉及一种采用可编程dna水凝胶包裹干细胞的方法及其应用。
背景技术：
1、干细胞因其分化为不同种类和功能细胞的能力，在发育生物学、肿瘤学、生殖医学和再生医学等领域具有广泛的应用价值。然而，在体外培养环境下，干细胞的活性与干性维持面临挑战。传统的二维培养环境（例如，塑料培养皿）很难提供细胞命运调控所需的复杂生化/生物物理线索（特别是机械环境）。虽然用饲养层细胞或特定培养基配方培养干细胞已被证明有利于维持其活性，但随着培养时间的延长，二维培养环境容易导致干细胞应激相关基因的上调，削弱其干性和自我更新能力，从而限制其临床应用。
2、天然的细胞外基质，例如动物来源的matrigel，可以为干细胞提供三维的机械环境，有利于其活性与干性的维持。但是其组分复杂，难以精准控制其结构与性质，存在较大的批间差异。并且，其复杂的异源动物成分也可能带来生物安全性和医学伦理问题，妨碍其应用转化。人工合成的水凝胶材料可以模仿细胞外基质提供的机械环境，并且成分明确可控，可以解决很多天然基质的问题。在细胞培养的生理条件原位生成水凝胶，用于可控地包裹和释放干细胞，并保持它们的活性与干性，仍然有一定难度。例如，一些聚合物水凝胶需要在非生理条件下（例如较高的温度、非生理的盐离子浓度、ph条件等）成胶；一些水凝胶（例如聚丙烯酰胺水凝胶）在制备过程中需要引入有毒试剂或会产生有毒的中间体。这些水凝胶需要在制备完成后进行纯化，无法用于原位包裹干细胞。很多聚合物水凝胶难以降解释放包裹的细胞。这些都限制了它们用于干细胞包裹的应用。
3、dna具有很好的生物相容性和可降解性。得益于dna纳米技术的发展，dna能够以可编程的方式在温和的生理环境原位生成微观结构与机械性质可控的水凝胶，并且能够可控降解。因此，构建具有可编程性的dna水凝胶，为干细胞应用提供可控的3d包裹，具有重要意义。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种采用可编程dna水凝胶包裹干细胞的方法及其应用，从而解决现有技术中传统二维培养环境和天然基质存在诸多缺陷，人工合成水凝胶也存在成胶条件苛刻、毒性、难降解等现象导致难以有效维持干细胞活性与干性的问题。
2、为了解决上述问题，本发明采用以下技术方案：
3、根据本发明的第一方面，提供一种采用可编程dna水凝胶包裹干细胞的方法，在等温生理条件下，通过引发链（i）与发卡结构dna的杂交链式反应形成三维dna水凝胶实现干细胞的可逆包裹与释放，所述发卡结构dna通过至少两种具有互补自组装域的dna单体构建块经变性-复性处理形成，所述水凝胶的机械刚度通过调控引发链（i）与dna单体构建块总量的摩尔比来实现；所述dna水凝胶能够可逆地包裹和释放干细胞，且被包裹的干细胞能够保持活性与干性，在被释放后恢复正常的增殖能力。
4、根据本发明的一个优选方案，所述方法包括以下步骤：1）将引发链（i）与dna单体构建块（h1、h2）分别溶于细胞基础培养基中；2）将dna单体构建块（h1、h2）的溶液分别通过加热变性退火处理，形成第一发卡结构和第二发卡结构；3）将第一发卡结构和第二发卡结构混合，加入干细胞悬液、引发链（i）及细胞粘附分子，混合后置于培养容器中，在等温生理条件下孵育形成dna水凝胶包裹干细胞的体系；4）利用核酸酶裂解dna水凝胶，释放干细胞。
5、优选的，dna水凝胶的储存模量范围为 200~2000 pa，通过调控引发链（i）与dna单体构建块（h1、h2）总量的摩尔比来实现。
6、优选的，所述引发链（i）与dna单体构建块（h1、h2）总量的摩尔比在1:50至1:20000之间。
7、根据本发明的研究发现，引发链比例越高，形成的 dna 构件块越小，水凝胶结构越松散；反之则结构更紧密，机械强度更高。
8、优选的，所述干细胞包括雌性生殖干细胞或间充质干细胞，所述细胞基础培养基为含 10% 胎牛血清、bfgf、egf、gdnf、lif 的 mem-α 培养基。
9、优选的，步骤3）中，所述细胞粘附分子为rgd聚合多肽。在本发明中，细胞粘附分子的作用是提供细胞与dna水凝胶的连接位点，从而提供必要的机械信号，调节细胞活性。根据本发明的研究发现，凡是带正电的多肽均可以通过静电吸附在dna凝胶骨架，因此从技术原理上来说除了rgd聚合多肽，其他带正电具有细胞粘附能力的多聚物或多肽均适用于本发明。
10、根据本发明的一个优选方案，所述细胞粘附分子为rgd聚合多肽，其序列为kkkkkk-（peg3）-grgds。
11、优选的，步骤3）中，在30~37℃下孵育1-5小时以形成dna水凝胶包裹干细胞的体系。
12、优选的，步骤4）中，所述核酸酶为dnase i，所述核酸酶浓度为 0.5-2 u/μl，裂解时间为 15-60 分钟。
13、根据本发明的第二方面，提供一种所述方法在制备干细胞三维培养体系中的应用，通过调控引发链（i）与dna单体构建块（h1、h2）总量的摩尔比来形成不同储存模量的dna水凝胶，维持干细胞活性≥95% 且干性标志物表达稳定，用于体外大规模扩增干细胞。
14、根据本发明的第三方面，提供一种所述方法在再生医学领域作为干细胞移植载体的应用。
15、应当理解的是，本发明方法并不仅限于实施例中所采用的dna序列，其基本设计原则是：1）dna形成不同发卡结构，不同发卡结构之间可以进行连续的链置换反应形成组装体；2）多个发夹结构的茎部与环部序列需严格避免交叉反应，确保级联反应仅由特定引发剂触发；3）发卡结构反应延伸方向为三维方向。任何本领域技术人员均可根据该原则进行dna序列的设计。
16、还应当理解的是，步骤1）中，除了采用两种发卡结构，还可以是三种发卡或更多种发卡结构。
17、以两种dna单体构建块（h1和h2）和一种催化型引发链（i）为例，对本发明的作用原理说明如下：本发明设计了一种类似催组装的等温三维分层组织方法，将dna组装为具有可调机械强度的dna水凝胶。两个基本的 dna 发夹结构h1和h2，作为超分子共聚的两个亚稳单体。这两个单体的发夹结构域会在引发链i（trigger）的触发下通过支点介导的杂交链式反应打开，并在随后的共聚过程中诱导互补序列的相互杂交。高浓度dna水凝胶的宏观尺度组装受反应的位阻调控。引发链i作为“催化核心”，催化周围h1和h2的动态共聚合。由于聚合过程中形成的结构域限制作用，催化位点i越多，反应形成的dna超分子的分子量越小。这些超分子充当“dna构件块”，并进一步交联形成具有不同建筑结构的dna水凝胶，从而具有可调控的机械性能。在保持h1和h2的总浓度和序列不变的情况下，引发链i越多，形成的一级dna构件块越小，导致所形成的dna水凝胶结构越松散。相比之下，减少i的数量会导致形成的dna构件块更大，导致最终形成的dna水凝胶具有更紧密的结构。
18、应当理解的是，本发明所述方法适用于多种哺乳动物干细胞，包括但不限于雌性生殖干细胞、间充质干细胞等。
19、本发明的核心发明点在于利用可编程 dna 水凝胶实现干细胞的三维包裹与调控，解决了传统培养环境和现有水凝胶材料在干细胞培养中的多项技术难题。其一，通过引发链（i）与发卡结构 dna（h1、h2）的杂交链式反应（hcr），在 37℃等生理条件下原位形成三维 dna 水凝胶，无需高温、极端 ph 或有毒试剂，避免对干细胞的损伤。其二，利用至少两种具有互补自组装域的 dna 单体构建块（h1、h2），经变性 - 复性处理形成发卡结构，通过引发链触发级联杂交反应，实现水凝胶网络的可编程构建。设计原则确保发卡结构仅由特定引发剂触发，避免交叉反应，保证组装的特异性和可控性。其三，在于水凝胶性能与干细胞调控的双重优化。通过调节引发链（i）与 dna 单体构建块（h1、h2）的摩尔比（1:50 至 1:20000），实现水凝胶储存模量在 200~2000 pa 范围内可调，模拟不同组织的机械微环境。其四，dna 水凝胶可通过核酸酶（如 dnase i）快速裂解（15-60 分钟），释放干细胞，且释放后的干细胞活性≥95%，干性标志物表达稳定，能恢复正常增殖能力（如 ki67 和edu阳性率与未处理细胞无差异）。相比天然基质（如 matrigel）难以降解或人工合成水凝胶降解条件苛刻，本发明方法实现了包裹-释放过程的可逆性和可控性。其五，dna 水凝胶成分明确（仅含 dna 和细胞粘附分子），无动物源性成分，避免异源物质引发的免疫激活（如 tnf-α、il-6 等促炎因子水平与对照组无差异）。
20、根据本发明提供的一种采用可编程dna水凝胶包裹干细胞的方法及其应用，相比现有技术具有以下优点：
21、1）dna水凝胶的成胶反应条件温和，能够在正常细胞培养的条件下原位发生dna的聚合组装，形成对干细胞的3d包裹；
22、2）dna水凝胶在细胞正常培养条件下具有可控的降解能力，能够在核酸酶的作用下快速降解并释放包裹的细胞；
23、3）该dna水凝胶具有良好的生物相容性，被包裹的干细胞能够保持活性与干性，没有明显的免疫激活效应（免疫毒性），并且能在被释放以后恢复细胞增殖能力，与未被包裹的干细胞增殖能力相当。因此，该体系可为干细胞的体外培养和工程化应用提供新的工具。
24、综上所述，本发明提供一种采用可编程dna水凝胶包裹干细胞的方法及其应用，通过可编程dna水凝胶在等温生理条件下原位形成3d网络，可逆地包裹和释放干细胞。该方法显著地保持了干细胞的活性与干性，没有明显的免疫激活，并且干细胞在被释放后可恢复正常的增殖能力。该方法为干细胞体外培养与工程化应用提供了全新的工具，具有显著的创新性和实用性。