本发明涉及生物，特别是涉及一种凝血酶活性检测试剂盒及其应用。
背景技术：
1、随着心血管疾病发病率逐年攀升，凝血级联反应中关键蛋白的调控机制成为研究焦点。凝血酶作为凝血途径中不可或缺的关键酶，在生理止血与病理血栓形成过程中发挥着“双刃剑”作用，其活性异常升高是血栓性疾病发生发展的重要原因。此外，纤维蛋白原是凝血过程中的另一种关键蛋白，它是血浆中含量丰富的大分子糖蛋白，平时以可溶性形式循环于血液中。当血管壁受损时，凝血级联反应被激活，凝血酶快速切割纤维蛋白原使纤维蛋白原转变为纤维蛋白单体，并通过非共价相互作用形成纤维蛋白聚集体。这一生物聚集体会加速血栓的生长与固化，威胁心血管系统健康。传统的检测方法，包括凝血四项、影像学技术等，虽能提供宏观凝血指标，但难以实现凝血过程的原位、动态可视化监测。因此，监测纤维蛋白聚集及发现影响聚集的活性物质具有重要意义。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种凝血酶活性检测试剂盒及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明利用聚集诱导发光(aie)分子的独有特性，借助凝血酶水解纤维蛋白原产生纤维蛋白单体，单体进一步自聚合为纤维蛋白聚集体的反应过程，通过检测凝血体系中发光体的变化来监测凝血酶活性。基于这一原理，本发明建立了凝血酶活性检测方法，并建立了以固定化凝血酶为介质，对含潜在的凝血酶抑制剂活性成分的药物进行筛选、分离和评价的方法，能够成功筛选出凝血酶抑制剂并确定其抑制效果。为凝血酶活性的快速检测提供了新的方法，也为凝血酶抑制剂的筛选和评价提供了新的策略。
2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
3、本发明提供一种凝血酶活性检测试剂盒，所述凝血酶活性检测试剂盒中包括纤维蛋白原和3,6-双(苯并噻吩-2-基)吡咯并[3,4-d]嘧啶。
4、本发明还提供上述凝血酶活性检测试剂盒在非诊断目的的检测凝血酶活性中的应用。
5、本发明还提供一种上述凝血酶活性检测试剂盒的使用方法，将待测样本与纤维蛋白原溶液、3,6-双(苯并噻吩-2-基)吡咯并[3,4-d]嘧啶溶液混合，静置反应15-25min，反应结束后，紫外光下拍摄反应体系的图像，检测图像荧光面积，代入由标准凝血酶制作的标准曲线，计算得出所述待测样本中凝血酶的活性。
6、可选的，所述纤维蛋白原溶液由生理盐水配制而成，浓度为0.5-2mg/ml；所述3,6-双(苯并噻吩-2-基)吡咯并[3,4-d]嘧啶溶液由水配制而成，浓度为80-120μg/ml。
7、可选的，所述待测样本、纤维蛋白原溶液和3,6-双(苯并噻吩-2-基)吡咯并[3,4-d]嘧啶溶液的体积比为1:10:1。
8、本发明还提供一种用于筛选凝血酶抑制剂的试剂盒，所述试剂盒包括固定化酶、纤维蛋白原和3,6-双(苯并噻吩-2-基)吡咯并[3,4-d]嘧啶；
9、所述固定化酶是将凝血酶负载于碳纳米管上得到的。
10、本发明还提供上述试剂盒在筛选凝血酶抑制剂或评价凝血酶抑制剂抑制效果中的应用。
11、本发明还提供一种利用上述试剂盒评价凝血酶抑制剂抑制效果的方法，将固定化酶与待测抑制剂混合孵育20-40min后，再与纤维蛋白原溶液、3,6-双(苯并噻吩-2-基)吡咯并[3,4-d]嘧啶溶液混合，静置反应15-25min后，紫外光下拍摄反应体系的图像，检测图像荧光面积，代入由标准凝血酶制作的标准曲线，计算得出孵育后的碳纳米管中凝血酶的活性，与初始碳纳米管中的凝血酶活性比较分析所述待测抑制剂的抑制效果。
12、本发明还提供一种利用上述试剂盒筛选凝血酶抑制剂的方法，将固定化酶与待测活性物质混合孵育20-40min后，固液分离，将所得固体成分经乙腈水溶液洗脱后，收集洗脱液；采用高效液相色谱仪分析鉴定出所述洗脱液中的活性单体成分，采用上述方法评价所述活性单体成分的抑制效果。
13、本发明公开了以下技术效果：
14、本发明利用聚集诱导发光(aie)分子的独有特性，借助凝血酶水解纤维蛋白原产生纤维蛋白单体，单体进一步自聚合为纤维蛋白聚集体的反应过程，通过检测凝血体系中发光体的变化来监测凝血酶活性。潜在的凝血酶抑制剂可以抑制凝血酶活性，导致发光产物减少，进而可以筛选出含有潜在成分的样品。基于这一原理，本发明建立了凝血酶活性检测方法，并建立了以固定化凝血酶为介质，对含潜在的凝血酶抑制剂活性成分的药物进行筛选、分离和评价的方法，能够成功筛选出凝血酶抑制剂并确定其抑制效果。
15、本发明提供了一种操作简单、准确性高的凝血酶活性测定方法，为凝血酶活性的快速检测提供了新的方法，也为凝血酶抑制剂的筛选和评价提供了新的策略。
1.一种凝血酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述凝血酶活性检测试剂盒中包括纤维蛋白原和3,6-双(苯并噻吩-2-基)吡咯并[3,4-d]嘧啶。
2.权利要求1所述的凝血酶活性检测试剂盒在非诊断目的的检测凝血酶活性中的应用。
3.一种权利要求1所述的凝血酶活性检测试剂盒的使用方法，其特征在于，将待测样本与纤维蛋白原溶液、3,6-双(苯并噻吩-2-基)吡咯并[3,4-d]嘧啶溶液混合，静置反应15-25min，反应结束后，紫外光下拍摄反应体系的图像，检测图像荧光面积，代入由标准凝血酶制作的标准曲线，计算得出所述待测样本中凝血酶的活性。
4.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于，所述纤维蛋白原溶液由生理盐水配制而成，浓度为0.5-2mg/ml；所述3,6-双(苯并噻吩-2-基)吡咯并[3,4-d]嘧啶溶液由水配制而成，浓度为80-120μg/ml。
5.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于，所述待测样本、纤维蛋白原溶液和3,6-双(苯并噻吩-2-基)吡咯并[3,4-d]嘧啶溶液的体积比为1:10:1。
6.一种用于筛选凝血酶抑制剂的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括固定化酶、纤维蛋白原和3,6-双(苯并噻吩-2-基)吡咯并[3,4-d]嘧啶；
7.权利要求6所述的试剂盒在筛选凝血酶抑制剂或评价凝血酶抑制剂抑制效果中的应用。
8.一种利用权利要求6所述的试剂盒评价凝血酶抑制剂抑制效果的方法，其特征在于，将固定化酶与待测抑制剂混合孵育20-40min后，再与纤维蛋白原溶液、3,6-双(苯并噻吩-2-基)吡咯并[3,4-d]嘧啶溶液混合，静置反应15-25min后，紫外光下拍摄反应体系的图像，检测图像荧光面积，代入由标准凝血酶制作的标准曲线，计算得出孵育后的碳纳米管中凝血酶的活性，与初始碳纳米管中的凝血酶活性比较分析所述待测抑制剂的抑制效果。
9.一种利用权利要求6所述的试剂盒筛选凝血酶抑制剂的方法，其特征在于，将固定化酶与待测活性物质混合孵育20-40min后，固液分离，将所得固体成分经乙腈水溶液洗脱后，收集洗脱液；采用高效液相色谱仪分析鉴定出所述洗脱液中的活性单体成分，采用权利要求8所述的方法评价所述活性单体成分的抑制效果。