本发明涉及分子生物学检测领域，具体地，本发明涉及一种mirna检测方法。更具体地，本发明提供了一种基于茎区靶mirna相关的逆转录引物对mirna进行检测的方法，并提供了实施所述方法的逆转录引物以及扩增引物，以及设计mirna检测引物的方法。
背景技术：
1、microrna(mirna)是一种短链(约22个核苷酸组成)非编码rna，广泛存在于动物、植物、线虫等真核生物中，是基因表达的重要转录后调控因子，通常与信使rna结合介导直接剪切或间接抑制翻译(bartel,d.p.(2004)."micrornas:genomics,biogenesis,mechanism,and function."cell 116(2):281-297；he,l.and g.j.hannon(2004)."micrornas:small rnas with a big role in gene regulation."nat rev genet 5(7):522-531)。研究表明mirna在细胞的分化、增殖、凋亡、个体生长发育以及器官形成等过程中都发挥着重要作用。生物体内存在mirna表达的精细调控机制，遵循严格的时空特异性。此外，有研究发现血液中存在循环mirna而且非常稳定(chen,x.,et al(2008)."characterization of micrornas in serum:a novel class of biomarkers fordiagnosis of cancer and other diseases."cell res 18(10):997-1006)，更为重要是，循环mirna的表达异常与许多疾病的发生发展密切相关(cortez,m.a.,et al(2011)."micrornas in body fluids--the mix of hormones and biomarkers."nat rev clinoncol 8(8):467-477；kawaguchi,t.,et al(2016)."circulating micrornas:a next-generation clinical biomarker for digestive system cancers."int j mol sci 17(9):1459)，提示mirna可以作为癌症等重大疾病早期诊断和预后评估的液体活检生物标记物。
2、长期以来，基于逆转录实时荧光定量pcr(rt-qpcr)的检测技术一直都被认为是最灵敏和有效的定量rna物质的方法。但是由于mirna的序列短，传统的针对长链rna设计的定量检测方案并不适用。chen等开发的基于taqman探针的rt-qpcr检测法(chen,c.,et al(2005)."real-time quantification of micrornas by stem-loop rt-pcr."nucleicacids res 33(20):e179)，采用mirna特异的逆转录茎环引物，增强了mirna和dna(逆转录茎环引物)杂化双链的热稳定性，使得逆转录具有较高的灵敏性；同时茎环引物所产生的空间约束，使得逆转录具有较高的特异性，有利于成熟mirna和mirna前体的区分。然而，由于额外的探针水解步骤，基于taqman探针的rt-qpcr检测法与快速热循环方案检测mirna的相容性需要进一步优化。此外，针对每一个mirna设计特异性的taqman探针不仅成本过高而且在技术上也具有挑战性并且面临实际应用困难。为了解决这一问题，虽然已经有研究通过使用通用的或共同的反向pcr引物和/或荧光探针以扩增和检测多种mirna(varkonyi-gasic,e.,et al(2007)."protocol:a highly sensitive rt-pcr method for detectionand quantification of micrornas."plant methods 3:12；yang,h.,et al(2009)."anovel real-time polymerase chain reaction method for high throughputquantification of small regulatory rnas."plant biotechnol j 7(7):621-630)。这种策略避免了针对不同mirna设计不同特异性探针的复杂性和降低了检测成本，但是这种策略的实时pcr的特异性仅通过正向pcr引物实现，这不足以区分许多种同源mirna。wan等使用脱氧尿苷内嵌的寡核苷酸和半嵌套引物新方法对mirna进行定量检测(wan,g.,et al(2010)."high-performance quantification of mature micrornas by real-time rt-pcr using deoxyuridine-incorporated oligonucleotides and hemi-nestedprimers."rna 16(7):1436-1445)，通过降低/消除rt引物对于pcr扩增的干扰、三引物特异性扩增以及与染料法检测相结合，不仅提高了mirna检测的特异性，而且极大的降低了多种mirna检测时的成本。然而，染料法检测在本质上无法区分扩增过程中引物二聚体(dimer)带来的非特异性荧光信号和待检靶标扩增的特异性荧光信号，非特异性信号可能会导致mirna定量准确性降低从而掩盖低浓度模板时的特异性荧光信号或者使得定量检测结果偏离真实水平，特别是当进行多重mirna检测时，反应体系中核苷酸序列的数量增加后，生成dimer的概率也进一步增加。
3、mirna是癌症等重大疾病早期诊断和预后评估有希望的液体活检生物标志物，然而当前mirna检测存在上述提及的一些问题可能是限制其进入临床应用的原因之一，因此，有必要开发能够解决这些问题的性能更好的mirna检测替代方法，为mirna检测进入临床应用铺平道路。
技术实现思路
1、本发明提供了一种新的检测生物样本中成熟mirna的方法，该方法特异性好、灵敏性高，可广泛用于成熟mirna的定量检测。
2、检测方法
3、因此，在第一方面，本技术提供了一种检测待测样品中目标mirna(microrna)的存在和/或其含量的方法，其包括以下步骤：
4、(1)提供逆转录引物和待测样品，在允许逆转录的条件下，使所述逆转录引物与所述待测样品接触，并进行逆转录反应；
5、其中，所述逆转录引物的5’端包含茎环结构，所述茎环结构的环区包含标签序列(ts序列)，所述茎环结构的茎区包含由茎序列(ss序列)以及其互补序列(ssc序列)退火形成的局部双链结构，其中，所述ss序列位于所述ssc序列的下游；
6、所述逆转录引物的3’端包含能与所述目标mirna退火的捕获序列(cs序列)并能起始延伸反应；
7、(2)在允许核酸扩增的条件下，使第一引物和第二引物与前一步骤获得的产物接触，并进行核酸扩增反应；
8、其中，所述第一引物从5’至3’的方向上包含第一区域以及第二区域，或由其组成；所述第一区域包含所述ts序列，所述第二区域能与所述目标mirna的cdna序列退火并起始延伸反应；
9、所述第二引物从5’至3’的方向上包含第一区域，第二区域以及第三区域，或由其组成；所述第一区域包含所述ts序列，所述第二区域包含所述ss序列，所述第三区域能与所述目标mirna的cdna序列的互补序列退火并起始延伸反应；
10、(3)根据步骤(2)中核酸扩增产物的存在和/或其含量，评估所述目标mirna在所述待测样品中的存在和/或其含量。
11、在某些实施方案中，所述待测样品含有核酸。在某些实施方案中，步骤(1)中，使所述逆转录引物与所述待测样品中的核酸接触。
12、在某些实施方案中，所述待测样品被怀疑含有目标mirna。
13、本领域技术人员易于理解，所述ss序列与所述ssc序列可以具有完全的互补性(也即，所述ss序列中的每一个核酸碱基均能与所述ssc序列中的核酸碱基形成沃森-克里克碱基配对)，也可以具有部分的互补性，只要所述ss序列与所述ssc序列可以彼此退火形成链内局部双链结构即可。
14、在某些实施方案中，所述第一引物的第一区域包含所述ts序列以及额外的核苷酸序列，或者，所述第一引物的第一区域由所述ts序列组成。
15、在某些实施方案中，所述第二引物的第一区域包含所述ts序列以及额外的核苷酸序列，或者，所述第二引物的第一区域由所述ts序列组成。
16、在某些实施方案中，所述第二引物的第二区域包含所述ss序列以及额外的核苷酸序列，或者，所述第二引物的第二区域由所述ss序列组成。
17、在某些实施方案中，所述第一引物的第二区域能与所述目标mirna的cdna序列的3’端(例如，3’末端)退火。
18、在某些实施方案中，所述第一引物的第二区域与所述目标mirna的cdna序列的3’端(例如，3’末端)序列互补。
19、在某些实施方案中，所述ss序列包含所述第一引物的第二区域的序列或其部分序列(例如，所述第一引物的第二区域的5’端部分序列)，并且，与所述第一引物的第二区域的序列或其部分序列(例如，所述第一引物的第二区域的5’端部分序列)相比，所述ss序列具有一个或多个(例如，1-4个，1个、2个、3个或4个)核苷酸残基的置换突变。
20、在某些实施方案中，所述ss序列包含与所述目标mirna 5’端(例如，5’末端)序列相同的dna序列，并且，与所述dna序列相比，所述ss序列具有一个或多个(例如，1-4个，1个、2个、3个或4个)核苷酸残基的置换突变。
21、本领域技术人员易于理解，所述与目标mirna 5’端序列相同的dna序列意指，将所述目标mirna5’端序列中的核糖核苷酸残基替换为相应的脱氧核糖核苷酸残基，并将其中的尿嘧啶核糖核苷酸残基替换为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸残基所形成的dna序列。
22、在某些实施方案中，所述第二引物包含的ss序列具有如上所定义的置换突变。
23、在某些实施方案中，所述第二引物中，由最接近第二引物5’末端的含有所述置换突变的核苷酸残基的上游序列组成所述第二引物的区段i，由最接近第二引物3’末端的含有所述置换突变的核苷酸残基的下游序列组成所述第二引物的区段ii；并且，所述第二引物具备选自以下特征的一项或多项：
24、(1)所述区段ii的tm值大于或等于30℃；
25、(2)所述区段ii的tm值与所述区段i的tm值相差不超过10℃；
26、(3)所述区段ii的tm值大于或等于所述区段i的tm值。
27、在某些实施方案中，所述逆转录引物的环区进一步包含通用序列(us序列)。
28、在某些实施方案中，所述us序列位于所述ts序列的上游。
29、在某些实施方案中，所述us序列的长度为0-6nt(例如，1-6nt、2-6nt、3-6nt、4-6nt、1-5nt、2-5nt、3-5nt、4-5nt、4nt)。
30、在某些实施方案中，所述第二引物的第三区域能与所述目标mirna的cdna序列的互补序列的3’端退火。
31、在某些实施方案中，所述第二引物的第三区域包含与所述目标mirna的3’端(例如，3’末端)序列互补的序列。
32、在某些实施方案中，所述第二引物的第三区域包含所述逆转录引物的cs序列或其部分序列。
33、在某些实施方案中，所述方法具备选自以下特征的一项或多项：
34、(1)所述ts序列的长度为3-15nt(例如，4-15nt、5-15nt、3-12nt、4-12nt、5-12nt、3-10nt、4-10nt、5-10nt、5nt、10nt)；
35、(2)所述ss序列的长度为6-15nt(例如，8-15nt、6-12nt、8-12nt、6-9nt、8nt)；
36、(3)所述逆转录引物的cs序列能够与所述目标mirna的3’端(例如，3’末端)退火；例如，所述逆转录引物的cs序列与所述目标mirna的3’端(例如，3’末端)序列互补；
37、(4)所述逆转录引物的cs序列的长度为4-10nt(例如，5-10nt、6-10nt、7-10nt、4-8nt、5-8nt、6-8nt、7-8nt、7nt)；
38、(5)所述第一引物的第二区域的长度为10-30nt(例如，12-30nt、15-30nt、10-25nt、12-25nt、15-25nt、10-20nt、12-20nt、15-20nt)；
39、(6)所述第二引物的第三区域的长度为4-10nt(例如，5-10nt、6-10nt、7-10nt、4-8nt、5-8nt、6-8nt、7-8nt、7nt)；
40、(7)所述目标mirna为成熟mirna。
41、在某些实施方案中，所述目标mirna以单链形式存在。
42、在某些实施方案中，所述方法用于检测待测样品中一种或多种目标mirna的存在和/或其含量。
43、在某些实施方案中，所述方法用于检测待测样品中多种目标mirna的存在和/或其含量；
44、其中，所述方法步骤(1)中，提供多种分别针对不同种目标mirna的所述逆转录引物，在允许逆转录的条件下，使所述多种逆转录引物与所述待测样品中的核酸接触，并进行逆转录反应；并且，
45、步骤(2)中，提供多种分别针对不同种目标mirna的所述第一引物以及所述第二引物；
46、在允许核酸扩增的条件下，在不同的反应体系中，分别使针对特定种类的目标mirna的所述第一引物和所述第二引物与前一步骤获得的产物接触，并进行核酸扩增反应。
47、在某些实施方案中，步骤(3)中，根据步骤(2)各反应体系中核酸扩增产物的存在和/或其含量，评估所述多种目标mirna各自在所述待测样品中的存在和/或其含量。
48、在某些实施方案中，步骤(2)中，所述核酸扩增反应为荧光定量pcr或等温扩增。
49、在某些实施方案中，步骤(3)中，通过荧光定量pcr或等温扩增的扩增产物的存在和/或其含量判断所述待测样品中目标mirna的存在和/或其含量。
50、在某些实施方案中，步骤(3)中，所述方法还包括将目标mirna标准品的扩增产物的含量与步骤(2)的待测样品的扩增产物的含量进行比较，以评估所述目标mirna在所述待测样品中的存在和/或其含量。
51、在某些实施方案中，所述目标mirna标准品为包含已知浓度或拷贝数的所述目标mirna的样品(例如，纯化样品)。
52、在某些实施方案中，所述第一引物修饰有第一基团，所述第二引物修饰有第二基团；
53、其中，所述第一基团为第一荧光基团，所述第二基团为第二荧光基团；或者，所述第一基团为荧光基团，所述第二基团为荧光猝灭基团；或者，所述第一基团为荧光猝灭基团，所述第二基团为荧光基团；
54、并且，所述第一基团与第二基团在扩增过程中能够实现荧光共振能量转移。
55、在某些实施方案中，同一个扩增产物分子中的所述第一基团和所述第二基团能够实现荧光共振能量转移。
56、在某些实施方案中，所述第一基团与所述第一引物的3’末端距离6-9个(例如，6个、7个、8个、9个)核苷酸残基；和/或，所述第二基团与所述第二引物的3’末端距离6-9个(例如，6个、7个、8个、9个)核苷酸残基。
57、在某些实施方案中，所述第一基团为第一荧光基团，所述第二基团为第二荧光基团，并且，所述第一荧光基团和第二荧光基团的组合选自：
58、tamra与fam、cy3与cy5、fam与dabcyl、fam与light cycler red 610、fam与lightcycler red 640、fam与light cycler red 670、fam与light cycler red705、fam与tamra、cy5与cy3、dabcyl与fam、light cycler red 610与fam、light cycler red 640与fam、light cycler red 670与fam、light cycler red 705与fam。
59、在某些实施方案中，所述第一基团为荧光基团，所述第二基团为荧光猝灭基团；或者，所述第一基团为荧光猝灭基团，所述第二基团为荧光基团；
60、并且，所述荧光基团选自fam、tamra、hex、rox、cy3、cy5、tet、vic、ned、joe、texasred、cy5.5及其任意组合；所述荧光猝灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcyl、eclipse、mgb及其任意组合。
61、在某些实施方案中，所述荧光基团与荧光猝灭基团的组合选自：fam与bhq1、tet与bhq1、joe与bhq1、vic与bhq1、hex与bhq1、cy3与bhq2、ned与bhq2、tamra与bhq2、rox与bhq2、texas red与bhq2、cy5与bhq2/bhq3、cy5.5与bhq2/bhq3、fam与dabcyl、tet与dabcyl、joe与dabcyl、vic与dabcyl、hex与dabcyl、fam与eclipse、tamra与eclipse、rox与eclipse、joe与eclipse、fam与mgb、tet与mgb、joe与mgb、vic与mgb、hex与mgb。
62、不受理论限制，本方面提供的方法可以用于检测任意来源的目标mirna。例如，所述目标mirna可以来源于体液样品、细胞样品、经提取的样品或其任意组合。例如，所述方法步骤(1)中，所述待测样品是细胞样品，所述方法还包括裂解细胞以释放细胞中的核酸分子，从而使所述待测样品中的核酸分子与所述逆转录引物接触。
63、本领域技术人员易于理解，本方面的方法并不受限于特定种类的mirna的检测，其可以用于检测任意种类的mirna(例如，序列已知的任意种类的mirna)。例如，对于任意的具有给定序列的mirna，基于本方面的方法均能设计并提供针对所述mirna的逆转录引物和第一引物及第二引物，并能通过本方面的方法实现所述mirna的特异性检测。
64、在某些实施方案中，所述目标mirna选自hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-25-3p及其任意组合。
65、在某些实施方案中，所述目标mirna为hsa-mir-92a-3p，并且，所述第一引物具有如seq id no:37所示的序列，所述第二引物具有如seq id no:39-41、43任一项所示的序列。
66、在某些实施方案中，所述目标mirna为hsa-mir-92a-3p，并且，所述第一引物具有如seq id no:81所示的序列，所述第二引物具有如seq id no:80所示的序列。
67、在某些实施方案中，所述目标mirna为hsa-mir-92a-3p，并且，所述逆转录引物具有如seq id no:76-79任一项所示的序列(例如，所述逆转录引物具有如seq id no:77-79任一项所示的序列；例如，所述逆转录引物具有如seq id no:78所示的序列)，所述第一引物具有seq id no:81所示的序列，和/或，所述第二引物具有seq id no:80所示的序列。
68、在某些实施方案中，所述目标mirna为hsa-mir-25-3p，并且，所述第一引物具有如seq id no:45所示的序列，所述第二引物具有如seq id no:48-49、51-52、54任一项所示的序列。
69、在某些实施方案中，所述方法用于诊断目的。
70、在某些实施方案中，所述方法用于非诊断目的。
71、试剂盒
72、在第二方面，本技术提供了试剂盒，其包含用于检测目标mirna的逆转录引物以及第一引物和第二引物；
73、其中，所述逆转录引物的5’端包含茎环结构，所述茎环结构的环区包含标签序列(ts序列)，所述茎环结构的茎区包含由茎序列(ss序列)以及其互补序列(ssc序列)退火形成的局部双链结构，其中，所述ss序列位于所述ssc序列的下游；
74、所述逆转录引物的3’端包含能与所述目标mirna退火的捕获序列(cs序列)并能起始延伸反应；
75、所述第一引物从5’至3’的方向上包含第一区域以及第二区域，或由其组成；所述第一区域包含所述ts序列，所述第二区域能与所述目标mirna的cdna序列退火并起始延伸反应；
76、所述第二引物从5’至3’的方向上包含第一区域，第二区域以及第三区域，或由其组成；所述第一区域包含所述ts序列，所述第二区域包含所述ss序列，所述第三区域能与所述目标mirna的cdna序列的互补序列退火并起始延伸反应。
77、本领域技术人员易于理解，所述ss序列与所述ssc序列可以具有完全的互补性(也即，所述ss序列中的每一个核酸碱基均能与所述ssc序列中的核酸碱基形成沃森-克里克碱基配对)，也可以具有部分的互补性，只要所述ss序列与所述ssc序列可以彼此退火形成链内局部双链结构即可。
78、在某些实施方案中，所述第一引物的第一区域包含所述ts序列以及额外的核苷酸序列，或者，所述第一引物的第一区域由所述ts序列组成。
79、在某些实施方案中，所述第二引物的第一区域包含所述ts序列以及额外的核苷酸序列，或者，所述第二引物的第一区域由所述ts序列组成。
80、在某些实施方案中，所述第二引物的第二区域包含所述ss序列以及额外的核苷酸序列，或者，所述第二引物的第二区域由所述ss序列组成。
81、在某些实施方案中，所述第一引物的第二区域能与所述目标mirna的cdna序列的3’端(例如，3’末端)退火。
82、在某些实施方案中，所述第一引物的第二区域与所述目标mirna的cdna序列的3’端(例如，3’末端)序列互补。
83、在某些实施方案中，所述ss序列包含所述第一引物的第二区域的序列或其部分序列(例如，所述第一引物的第二区域的5’端部分序列)，并且，与所述第一引物的第二区域的序列或其部分序列(例如，所述第一引物的第二区域的5’端部分序列)相比，所述ss序列具有一个或多个(例如，1-4个，1个、2个、3个或4个)核苷酸残基的置换突变。
84、在某些实施方案中，所述ss序列包含与所述目标mirna5’端(例如，5’末端)序列相同的dna序列，并且，与所述dna序列相比，所述ss序列具有一个或多个(例如，1-4个，1个、2个、3个或4个)核苷酸残基的置换突变。
85、本领域技术人员易于理解，所述与目标mirna5’端序列相同的dna序列意指，将所述目标mirna5’端序列中的核糖核苷酸残基替换为相应的脱氧核糖核苷酸残基，并将其中的尿嘧啶核糖核苷酸残基替换为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸残基所形成的dna序列。
86、在某些实施方案中，所述第二引物包含的ss序列具有如上所定义的置换突变。
87、在某些实施方案中，所述第二引物中，由最接近第二引物5’末端的含有所述置换突变的核苷酸残基的上游序列组成所述第二引物的区段i，由最接近第二引物3’末端的含有所述置换突变的核苷酸残基的下游序列组成所述第二引物的区段ii；并且，所述第二引物具备选自以下特征的一项或多项：
88、(1)所述区段ii的tm值大于或等于30℃；
89、(2)所述区段ii的tm值与所述区段i的tm值相差不超过10℃；
90、(3)所述区段ii的tm值大于或等于所述区段i的tm值。
91、在某些实施方案中，所述逆转录引物的环区进一步包含通用序列(us序列)。
92、在某些实施方案中，所述us序列位于所述ts序列的上游。
93、在某些实施方案中，所述us序列的长度为0-6nt(例如，1-6nt、2-6nt、3-6nt、4-6nt、1-5nt、2-5nt、3-5nt、4-5nt、4nt)。
94、在某些实施方案中，所述第二引物的第三区域能与所述目标mirna的cdna序列的互补序列的3’端退火。
95、在某些实施方案中，所述第二引物的第三区域包含与所述目标mirna的3’端(例如，3’末端)序列互补的序列。
96、在某些实施方案中，所述第二引物的第三区域包含所述逆转录引物的cs序列或其部分序列。
97、在某些实施方案中，所述试剂盒具备选自以下特征的一项或多项：
98、(1)所述ts序列的长度为3-15nt(例如，4-15nt、5-15nt、3-12nt、4-12nt、5-12nt、3-10nt、4-10nt、5-10nt、5nt、10nt)；
99、(2)所述ss序列的长度为6-15nt(例如，8-15nt、6-12nt、8-12nt、6-9nt、8nt)；
100、(3)所述逆转录引物的cs序列能够与所述目标mirna的3’端(例如，3’末端)退火；例如，所述逆转录引物的cs序列与所述目标mirna的3’端(例如，3’末端)序列互补；
101、(4)所述逆转录引物的cs序列的长度为4-10nt(例如，5-10nt、6-10nt、7-10nt、4-8nt、5-8nt、6-8nt、7-8nt、7nt)；
102、(5)所述第一引物的第二区域的长度为10-30nt(例如，12-30nt、15-30nt、10-25nt、12-25nt、15-25nt、10-20nt、12-20nt、15-20nt)；
103、(6)所述第二引物的第三区域的长度为4-10nt(例如，5-10nt、6-10nt、7-10nt、4-8nt、5-8nt、6-8nt、7-8nt、7nt)；
104、(7)所述目标mirna为成熟mirna。
105、在某些实施方案中，所述目标mirna以单链形式存在。
106、在某些实施方案中，所述试剂盒包含针对一种或多种目标mirna的所述逆转录引物，所述第一引物以及所述第二引物。
107、在某些实施方案中，所述第一引物修饰有第一基团，所述第二引物修饰有第二基团；
108、其中，所述第一基团为第一荧光基团，所述第二基团为第二荧光基团；或者，所述第一基团为荧光基团，所述第二基团为荧光猝灭基团；或者，所述第一基团为荧光猝灭基团，所述第二基团为荧光基团；
109、并且，所述第一基团与第二基团在扩增过程中能够实现荧光共振能量转移。
110、在某些实施方案中，同一个扩增产物分子中的所述第一基团和所述第二基团能够实现荧光共振能量转移。
111、在某些实施方案中，所述第一基团与所述第一引物的3’末端距离6-9个(例如，6个、7个、8个、9个)核苷酸残基；和/或，所述第二基团与所述第二引物的3’末端距离6-9个(例如，6个、7个、8个、9个)核苷酸残基。
112、在某些实施方案中，所述第一基团为第一荧光基团，所述第二基团为第二荧光基团，并且，所述第一荧光基团和第二荧光基团的组合选自：
113、tamra与fam、cy3与cy5、fam与dabcyl、fam与light cycler red 610、fam与lightcycler red 640、fam与light cycler red 670、fam与light cycler red705、fam与tamra、cy5与cy3、dabcyl与fam、light cycler red 610与fam、light cycler red 640与fam、light cycler red 670与fam、light cycler red 705与fam。
114、在某些实施方案中，所述第一基团为荧光基团，所述第二基团为荧光猝灭基团；或者，所述第一基团为荧光猝灭基团，所述第二基团为荧光基团；
115、并且，所述荧光基团选自fam、tamra、hex、rox、cy3、cy5、tet、vic、ned、joe、texasred、cy5.5及其任意组合；所述荧光猝灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcyl、eclipse、mgb及其任意组合。
116、在某些实施方案中，所述荧光基团与荧光猝灭基团的组合选自：fam与bhq1、tet与bhq1、joe与bhq1、vic与bhq1、hex与bhq1、cy3与bhq2、ned与bhq2、tamra与bhq2、rox与bhq2、texas red与bhq2、cy5与bhq2/bhq3、cy5.5与bhq2/bhq3、fam与dabcyl、tet与dabcyl、joe与dabcyl、vic与dabcyl、hex与dabcyl、fam与eclipse、tamra与eclipse、rox与eclipse、joe与eclipse、fam与mgb、tet与mgb、joe与mgb、vic与mgb、hex与mgb。
117、不受理论限制，本方面提供的试剂盒可以用于检测任意来源的目标mirna。例如，所述目标mirna可以来源于体液样品、细胞样品、经提取的样品或其任意组合。
118、本领域技术人员易于理解，本方面的试剂盒可以用于检测任意种类的mirna(例如，序列已知的任意种类的mirna)。例如，对于任意的具有给定序列的mirna，本方面的试剂盒均能提供针对所述mirna的逆转录引物和第一引物及第二引物。
119、在某些实施方案中，所述目标mirna选自hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-25-3p及其任意组合。
120、在某些实施方案中，所述目标mirna为hsa-mir-92a-3p，并且，所述第一引物具有如seq id no:37所示的序列，所述第二引物具有如seq id no:39-41、43任一项所示的序列。
121、在某些实施方案中，所述目标mirna为hsa-mir-92a-3p，并且，所述第一引物具有如seq id no:81所示的序列，所述第二引物具有如seq id no:80所示的序列。
122、在某些实施方案中，所述目标mirna为hsa-mir-92a-3p，并且，所述逆转录引物具有如seq id no:76-79任一项所示的序列(例如，所述逆转录引物具有如seq id no:77-79任一项所示的序列；例如，所述逆转录引物具有如seq id no:78所示的序列)，所述第一引物具有seq id no:81所示的序列，和/或，所述第二引物具有seq id no:80所示的序列。
123、在某些实施方案中，所述目标mirna为hsa-mir-25-3p，并且，所述第一引物具有如seq id no:45所示的序列，所述第二引物具有如seq id no:48-49、51-52、54任一项所示的序列。
124、引物设计方法
125、在第三方面，本技术提供了mirna检测引物的设计方法，其包括以下步骤：
126、s1：提供目标mirna序列；
127、s2：根据所述目标mirna序列设计逆转录引物、第一引物和/或第二引物；
128、其中，所述逆转录引物、所述第一引物以及所述第二引物如上文所定义。
129、在某些实施方案中，所述方法为mirna检测引物序列的设计方法。
130、在第四方面，本技术提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现第三方面的方法的步骤。
131、在第五方面，本技术提供了一种电子设备，其包括：第四方面的计算机可读存储介质；以及
132、一个或者多个处理器，用于执行所述计算机可读存储介质中的程序。
133、用途
134、在第六方面，本技术提供了第二方面的试剂盒、第三方面的方法、第四方面的计算机可读存储介质或第五方面的电子设备，在检测mirna中的用途。
135、在第七方面，本技术提供了第二方面的试剂盒在制备用于检测mirna的检测试剂中的用途。
136、术语定义
137、在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的病毒学、生物化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
138、当本文使用术语“例如”、“如”、“诸如”、“包括”、“包含”或其变体时，这些术语将不被认为是限制性术语，而将被解释为表示“但不限于”或“不限于”。
139、除非本文另外指明或根据上下文明显矛盾，否则术语“一个”和“一种”以及“该”和类似指称物在描述本发明的上下文中(尤其在以下权利要求的上下文中)应被解释成覆盖单数和复数。
140、如本文中所使用的，术语“上游”用于描述两条核酸序列(或两个核酸分子)的相对位置关系，并且具有本领域技术人员通常理解的含义。例如，表述“一条核酸序列位于另一条核酸序列的上游”意指，当以5'至3'方向排列时，与后者相比，前者位于更靠前的位置(即，更接近5'端的位置)。如本文中所使用的，术语“下游”具有与“上游”相反的含义。
141、出于多种原因，本发明的核酸或多核苷酸(例如“逆转录引物”、“第一引物”、“第二引物”等)可包括一种或多种修饰的核酸碱基、糖部分或核苷间连接。例如，使用包含修饰的碱基、糖部分或核苷间连接的核酸或多核苷酸的一些原因包括但不限于：(1)tm的改变；(2)改变多核苷酸对一种或多种核酸酶的易感性；(3)提供用于连接标记的部分；(4)提供标记或标记猝灭剂；或(5)提供用于连接溶液中或结合于表面的另一种分子的部分。
142、如本文所用，术语“发生退火”、“进行退火”、“退火”、“使杂交”或“杂交”等是指，具有经由沃森-克里克碱基配对形成复合物的充分互补性的核苷酸序列之间形成复合物。就本发明来说，彼此之间“对其互补”或“与之互补”或与其“杂交”或“退火”的核酸序列应该能形成或形成服务于预定目的的足够稳定的“杂交体”或“复合物”。不要求由一个核酸分子显示的序列内的每个核酸碱基能够与由第二核酸分子显示的序列内的每个核酸碱基进行碱基配对或配对或复合，以便这两个核酸分子或其中显示的相应序列与彼此“互补”或“退火”或“杂交”。如本文所述，在提及按碱基配对法则联系的核苷酸的序列时使用术语“互补的”或“互补性”。例如，序列5’-a-g-t-3’与序列3’-t-c-a-5’互补。互补性可以是“部分的”，其中核酸碱基中只有一些根据碱基配对法则匹配。或者，在核酸之间可具有“完全的”或“全部的”互补性。
143、如本文所使用的，术语“荧光共振能量转移”(fluorescence resonance energytransfer,fret)具有本领域技术人员所通常理解的含义，其为一种在两个分子之间通过非辐射机制转移能量的过程。这个术语通常用于描述在荧光分子(供体，donor)和另一个能够接收能量的分子(受体，acceptor)之间发生的特定类型的相互作用。供体(donor)：通常是一个荧光分子，它在吸收光能后会处于激发态，并能够以光的形式释放能量。受体(acceptor)：一个能够接受供体能量的分子，通常是另一个荧光分子或具有吸收光谱与供体的发射光谱重叠的非荧光分子(例如，荧光猝灭基团)。
144、如本文所使用的，术语“成熟mirna“具有本领域技术人员所通常理解的含义，其为一类小分子非编码rna，通常由约21-25个核苷酸组成，一般在细胞内参与基因表达的调控。生物体内存在的或源自生物样本的成熟mirna一般通过一个多步过程从较长的初级mirna(pri-mirna)或前体mirna(pre-mirna)生成。
145、发明的有益效果
146、(1)本发明方法检测体系自身特异性良好，在检测无模板阴性水样本时无非特异性扩增。一方面，本发明方法中，通过第一扩增引物和第二扩增引物或第一扩增引物和rt引物非特异性互补配对时能够生成热稳定的茎环结构dimer扩增子，在后续扩增过程中能够阻碍dimer的进一步扩增和累积。另一方面，与染料法mirna检测相比，在某些实施方案中，本发明方法一方面通过第一扩增引物和第二扩增引物对靶标mirna特异性扩增时荧光共振能量转移的方式进行荧光信号输出，避免染料法中其他非特异性扩增或dimer荧光信号的积累对于检测的影响。
147、(2)本发明方法具有较高的灵敏性，检测范围可以跨越多个浓度梯度，对于mirna定量检测具有较高的准确度和精确度。
148、(3)本发明方法具有良好的定量准确性，与染料法相比定量检测结果不易受非特异性扩增产物或dimer的影响。
149、(4)本发明方法可与商品化荧光定量pcr仪适配，且与快速热循环方案检测mirna相兼容。
150、下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。