生产靶物质的方法

专利名称:生产靶物质的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用细菌生产靶物质的方法。更特别地，本发明涉及一种利用细菌改进靶物质例如L-氨基酸、核酸、抗生素、维生素、生长因子或生理活性物质的生产的方法。
背景技术：
利用微生物发酵生产靶物质例如L-氨基酸的方法包括利用野生型微生物(野生型菌株)的方法、利用衍生自野生型菌株的营养缺陷型菌株的方法、利用衍生自野生型菌株的代谢调控突变体作为多种药物抗性突变体之一的方法、利用同时具有营养缺陷型菌株和代谢调控突变体特征的菌株的方法，等等。
近年来，重组DNA技术已经被用于靶物质的发酵生产。例如，微生物生产L-氨基酸的能力可以通过增强编码L-氨基酸生物合成酶的基因(US专利5168 056和5 776 736)，或增强碳源向L-氨基酸生物合成系统的流入(US专利5 906 925)来提高。
改进微生物中靶物质生产的方法包括修饰物质摄入或外排系统的方法。修饰摄入系统的方法例子包括一种通过删除用于把靶物质摄入细胞的系统或使该系统退化来改进靶物质生产能力的方法。特别地，现有技术中已经公开了一种删除gluABCD操纵子或其部分以消除L-谷氨酸摄入系统或使之退化(EP 1 038970 A1)的方法，一种削弱嘌呤核苷向细胞的摄入以增强嘌呤核苷生产能力的方法(EP 1 004 663 A1)，等等。
修饰微生物外排系统的方法包括用于增强靶物质的外排系统的方法以及删除或削弱靶物质的生物合成系统的中间物或底物的外排系统的方法。作为增强靶物质外排系统的方法，例如，已经公开了一种利用其中L-赖氨酸外排基因(lysE)被增强的棒杆菌(Corynebacterium)菌株生产L-赖氨酸的方法(WO97/23597)。至于后一种方法，已知一种生产靶物质L-谷氨酸的方法，其中通过突变或破坏α-酮戊二酸通透酶基因使靶物质中间体α-酮戊二酸的外排得以减少(WO 01/005959)。
此外，有人建议将编码与物质透过细胞膜有关的ATP结合盒超家族(ABC转运蛋白)的基因用于其中氨基酸穿膜运输被修饰的微生物的育种中(WO00/37647)。
此外，有人建议将编码蔗糖PTS酶II(一种涉及蔗糖向细胞内摄入的蛋白质)的基因用于棒状细菌中，从而繁育出氨基酸、核酸等的生产力得到改良的菌株(EP 1 197 555 A)。此外，还已知一种利用蔗糖PTS基因群或蔗糖非-PTS基因群来改进属于埃希氏菌(Escherichia)属的细菌L-氨基酸生产力的技术(美国专利申请号2001/0049126)。
已知一种通过删除或削弱副产物生物合成系统来降低靶物质副产物生产的技术(例如，“Amino Acid Fermentation”Gakkai Shuppan Center，p.4，1986)。然而，在该方法中，培养微生物时需要向培养基中添加微生物生长所需量的上述副产物。
Mtr(Heatwole，V.M等人，J.Bacteriol.，American Society for Microbiology，173，pp.108-115，1991年1月)和TnaB(Sarsero，J.P等人，J.Bacteriol.，AmericanSociety for Microbiology，173(10)，pp.3231-3234，1991年5月)已知为L-色氨酸特异性摄入系统，以及Arop(Mee-Len，C.等人，J.Bacteriol.，American Societyfor Microbiology，167(2)，pp.749-753，1986年8月)已知为芳香族氨基酸共有的摄入系统。然而，之前未曾描述过通过增强靶物质副产物的摄入系统来改进靶物质的生产力。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种利用微生物生产靶物质例如L-氨基酸、抗生素、维生素、生长因子或生理活性物质的方法，其中副产物的产量降低了，且优选靶物质的产量提高了。
本发明的进一步的目的是提供一种生产靶物质的方法，该方法包括培养能在培养基中生产靶物质的细菌以及从培养基中收集靶物质，其中所述细菌经过修饰以增强靶物质副产物或靶物质生物合成系统底物的细胞摄入系统。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述副产物选自所述靶物质的生物合成途径中的中间体、所述靶物质的生物合成途径中的底物、以及从所述途径中分支出来的另一生物合成途径的产物。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌(Escherichia)属。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述靶物质是L-苯丙氨酸以及所述副产物是L-色氨酸。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述副产物的摄入系统选自Mtr和TnaB。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述系统的活性通过选自以下的一种方法而得以提高增加mtr基因或tnaB基因的拷贝数，和修饰mtr基因或tnaB基因的表达调控序列。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述mtr基因含有选自以下的一种DNA序列编码SEQ ID No.2中所示的蛋白质序列的DNA序列，SEQ ID No.1中所示的DNA序列，以及编码SEQ ID No.2中所示的蛋白质序列并且经过了修饰的DNA序列，其中经过所述修饰，在一个或若干个位点上替换、删除、插入或添加了一个或若干个氨基酸残基，并且修饰后的序列与SEQ ID No.2中所示序列具有至少70％的同源性，其中所述mtr基因编码一种具有Mtr蛋白质活性的蛋白质。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述tnaB基因含有选自以下的一种DNA序列编码SEQ ID No.4中所示蛋白质序列的DNA序列，SEQ ID No.3中所示的DNA序列，以及编码SEQ ID No.4中所示的蛋白质序列并且经过了修饰的DNA序列，其中经过所述修饰，在一个或若干个位点上替换、删除、插入或添加了一个或若干个氨基酸残基，并且修饰后的序列与SEQ ID No.4中所示序列具有至少70％的同源性，其中所述tnaB基因编码一种具有TnaB蛋白质活性的蛋白质。
本发明的进一步的目的是提供一种属于埃希氏菌(Escherichia)属的细菌，其具有生产靶物质的能力并具有选自以下的一种改进靶物质副产物的细胞摄入系统的增强和靶物质生物合成系统的底物的细胞摄入系统的增强。
本发明的进一步的目的是提供一种如上所述的细菌，其中所述靶物质是L-苯丙氨酸，所述副产物是L-色氨酸，所述细胞摄入系统选自Mtr和TnaB。
本发明的进一步的目的是提供一种如上所述的细菌，其中所述Mtr或Tnaβ的活性通过选自以下的一种方式得以提高增加mtr基因或tnaB基因的拷贝数，和修饰mtr基因或tnaB基因的表达调控序列。
本发明的进一步的目的是提供一种如上所述的细菌或如上所述的方法，其中所述mtr基因含有选自下列的一种DNA序列编码SEQ ID No.2中所示蛋白质序列的DNA序列，SEQ ID No.1中所示的DNA序列，以及编码SEQ ID No.2所示的蛋白质序列并且经过了修饰的DNA序列，其中经过所述修饰，在一个或几个位点上替换、删除、插入或添加了一个或几个氨基酸残基，并且修饰后的序列与SEQ ID No.2所示序列具有至少70％的同源性，其中所述mtr基因编码一种具有Mtr蛋白质活性的蛋白质。
本发明的一个进一步的目的是提供一种如上所述的方法或细菌，其中所述tnaB基因含有选自下列的一种DNA序列编码SEQ ID No.4中所示的蛋白质序列的DNA序列、SEQ ID No.3中所示的DNA序列、以及编码SEQ ID No.4中所示的蛋白质序列并且经过了修饰的DNA序列，其中经过所述修饰，在一个或若干个位点上替换、删除、插入或添加了一个或若干个氨基酸残基，并且修饰后的序列与SEQ ID No.4中所示序列具有至少70％的同源性，其中所述tnaB基因编码一种具有TnaB蛋白质活性的蛋白质。
根据本发明，当利用细菌生产靶物质例如L-氨基酸时，可以降低副产物的产量。根据本发明的一种优选实施方式，可以提高靶物质的产量。
此外，培养细菌时不需要向培养基中添加生长所需的物质，而且，由于可以降低培养基中副产物的量，因此从培养基中纯化靶物质就变得容易。
优选实施方式的详细描述为了达到上述目的本发明的发明人进行了艰苦的研究。结果发现，当细菌被修饰后，靶物质的副产物的细胞摄入系统被增强，副产物的产量减少，因此完成了本发明。
本发明的细菌能生产靶物质并经修饰以使靶物质的副产物或靶物质的生物合成系统底物的细胞摄入系统得到增强。不特别限制本发明的细菌，只要它能生产靶物质且具有靶物质副产物或用于靶物质生物合成系统的底物的细胞摄入系统。此外，只要满足上述要求，也可将本发明应用于以前未曾在工业上使用的细菌。本发明的细菌可以天生具有生产靶物质的能力，或者也可以经突变、重组DNA技术或者类似方法育种来赋予该能力。
细菌的特定例子包括属于埃希氏菌属的细菌例如大肠杆菌(Escherichiacoli)、棒状细菌例如乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、属于芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、属于沙雷氏菌(Serratia)属的细菌例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，等等。然而，本发明的细菌并不限于这些例子。
措辞“生产靶物质”意指，当将本发明的细菌培养于培养基中时，细菌能够生产出足够量的靶物质以便可以从细菌细胞或培养基中收集这些靶物质。优选地，这意味着细菌具有能生产出比野生型或未修饰的细菌菌株更大数量的靶物质的能力。
不特别限制本发明所生产的靶物质，只要它是一种能被细菌生产的物质。其例子包括各种L-氨基酸如L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸。此外，靶物质可以是任何可以被细菌生物合成的物质包括核酸例如鸟苷酸和肌苷酸、维生素、抗生素、生长因子、生理活性物质等，只要在生物合成中存在中间体或底物的外排系统。此外，本发明可用于生产目前还没有利用细菌生产的物质，只要存在靶物质的副产物或靶物质的生物合成系统底物的细胞摄入系统。
生产L-苯丙氨酸的细菌的例子包括大肠杆菌AJ12741(FERM P-13000，参见日本专利号3225597)和AJ12604(FERM BP-3579，参见欧洲专利申请公开号488424)、乳发酵短杆菌AJ12637(FERM BP-4160，参见法国专利申请公开号2686898)，等等。此外，生产靶物质L-苏氨酸的细菌例子包括大肠杆菌VKPM B-3996(RIA 1867，参见美国专利号5175107)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corybacterium acetoacidophilum)AJ12318(FERM BP-1172，参见美国专利号5188949)，等等。生产L-赖氨酸的细菌的例子包括大肠杆菌AJ11442(NRRLB-12185，FERM BP-1543，参见美国专利号4346170)、乳发酵短杆菌AJ3990(ATCC 31269，参见美国专利号4066501)，等等。生产L-谷氨酸的细菌的例子包括大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853，参见法国专利申请公开号2680178)、大肠杆菌AJ13199(FERM P-15573，参见日本专利申请公开号7-203980)、乳发酵短杆菌AJ12475(FERM BP-2922，参见美国专利申请号5272067)，等等。生产L-亮氨酸的细菌的例子包括大肠杆菌AJ11478(FERMP-5274，参见日本专利公开(Kokoku)号62-34397)、乳发酵短杆菌AJ3718(FERMP-2516，参见美国专利申请号3970519)，等等。产L-异亮氨酸细菌的例子包括大肠杆菌KX141(VKPM B-4781，参见欧洲专利申请公开号519113)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)AJ12149(FERM BP-759，参见美国专利号4656135)等。生产L-缬氨酸的细菌的例子包括大肠杆菌VL1970(VKPM B-4411，参见欧洲专利申请公开号519113)、乳发酵短杆菌AJ12341(FERM BP-1763，参见美国专利号5188948)，等等。
本发明中，靶物质的“副产物”意指在靶物质的生产过程中作为副产物产生的除靶物质之外的物质。此外在本发明中，如果细菌没有经过使本发明摄入系统增强的修饰，则培养细菌时“副产物”和“靶物质的生物合成系统的底物”外排并积累于培养基中，且存在副产物或底物被摄入细菌或其它细菌内的系统。
术语“靶物质”和“副产物”是相对的概念，一种物质是靶物质还是副产物依赖于生产目的。例如，如果要生产L-苯丙氨酸，则L-苯丙氨酸是靶物质，L-苯丙氨酸生产中所产生的L-色氨酸是副产物。如果要生产L-色氨酸，则L-色氨酸是靶物质，且L-色氨酸生产中所产生的L-苯丙氨酸是副产物。
本发明中的特定副产物的例子包括靶物质生物合成途径的中间体、自该途径分支出来的另一生物合成途径的产物，等等。中间体或底物不限于该靶物质特有的生物合成系统中的中间体或底物，例如前体，它可以是其它物质的生物合成系统或代谢系统的中间体或底物，例如，当靶物质为一种L-氨基酸时，糖酵解系统的中间体或底物。下文中，前述“副产物”或“底物”可以笼统地称为副产物，且有关副产物的描述也类似地适用于底物。
本发明中，“用于细胞摄入的系统(细胞摄入系统)”是指一种涉及将前述已被排出细胞外的副产物摄入细胞内的蛋白质。该摄入系统可以由单一一种或两种或更多种蛋白质组成。此外，对于某一单一种副产物可能存在两种或更多种类型的摄入系统。
措辞“修饰以使摄入系统被增强”意指修饰细菌以使前述副产物的摄入量或摄入速率与未修饰的菌株如野生型细菌相比得到提高。例如，如果通过提高组成摄入系统的某种蛋白质的量或特异活性使其活性与野生型或未修饰菌株相比得到增强，则前述摄入系统得到增强。组成摄入系统的某种蛋白质的活性可用Sarsero，J.P.等人，J.Bacteriol.，177(2)，297-306，1995年所述的方法测定，例如，当蛋白质为Mtr、TnaB、TyrP、PheP或AroP时。衍生自大肠杆菌的NupC和NupG的活性可用J.Bacteriol.，183(16)，4900-4，2001年8月中所述的方法测定。衍生自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的GluABCD的活性可以用J.Bacteriol.，177(5)，1152-8，1995年3月中所述的方法测定。衍生自谷氨酸棒杆菌的BrnQ的活性可以用Arch.Microbiol.，169(4)，303-12，1998年4月中所述的方法测定。衍生自大肠杆菌的LivFGHJKM和LivK的活性可以用J.Biol.Chem.，15，265(20)，11436-43，1990年7月；J.Bacteriol.，116，1258-66，1973；和J.Bacteriol.，174(1)，108-15，1992年1月中所述的方法测定。衍生自大肠杆菌的LysP的活性可以用J.Bacteriol.，174(10)，3242-9，1992年5月中所述的方法测定。衍生自大肠杆菌的ArtPIQMJ的活性可以用Mol.Microbiol.，17(4)，675-86，1995年8月中所述的方法测定。
例如，就大肠杆菌来说，将要比较的一个野生型细菌的例子是大肠杆菌MG1655菌株。
靶物质、副产物或底物的组合在其生物合成系统及其摄入系统中的例子示于表1中。
表1细菌 靶物质 副产物 摄入系统基因大肠杆菌 L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，等 L-色氨酸 mtr，tnaB大肠杆菌 L-苯丙氨酸，L-色氨酸，等 L-酪氨酸 tyrP大肠杆菌 L-酪氨酸，L-色氨酸，等 L-苯丙氨酸 pheP大肠杆菌 除芳香族氨基酸之外的物质 芳香族氨基酸 aroP，pheP，tyrP大肠杆菌 除带枝链的氨基酸之外的物质 带枝链的氨基酸 brnQ，livFGHJKM大肠杆菌 除L-赖氨酸之外的物质 L-赖氨酸 lysP大肠杆菌 除L-苏氨酸，L-丝氨酸之外的物质 L-苏氨酸，L-丝氨酸 tdcC，sdaC大肠杆菌 除L-精氨酸之外的物质 L-精氨酸 artIJMPQ除L-亮氨酸之外的物质，例如L-异大肠杆菌 亮氨酸、L-缬氨酸，等 L-亮氨酸 livK大肠杆菌 除尿嘧啶之外的物质 尿嘧啶 uraA大肠杆菌 除核苷之外的物质 核苷 nupC，nupG除L-谷氨酸之外的物质，例如L-谷棒杆菌 氨酰胺，等 L-谷氨酸 gluABCD棒杆菌 除L-赖氨酸之外的物质 L-赖氨酸 lysl
本发明的一个特别优选的靶物质的例子是L-苯丙氨酸。比外，其副产物的例子是L-色氨酸。
优选的生产L-苯丙氨酸的属于埃希氏菌属的细菌例子是大肠杆菌AJ12741菌株。该菌株是通过将质粒pMGAL1导入有tyrR和tyrA基因(W3110(tyrR，tyrA)/pMGAL1，日本专利号3225597)缺陷的大肠杆菌K-12 W3110菌株中构建而成的。质粒pMGAL1包含编码反馈抑制被脱敏化的3-脱氧-D-阿拉伯糖基庚酮酸-7-磷酸合成酶(DS)、反馈抑制被脱敏化的分支酸变位酶/预苯酸盐脱氢酶(CM-PD)、以及莽草酸盐激酶的基因。该菌株于1992年6月11日保藏于国家生命科学和人类技术研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology)、工业科技署(Agency of Industrial Science and Technology)、国际贸易和工业部(Ministry of International Trade and Industry，现在是独立的管理机构，国家高等工业科技研究所(National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)，是国际专利微生物保藏单位，位于Tsukuba Central 6，1-1，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan)，收到的保藏编号为FERMP-13000。之后，根据布达佩斯条约的规定于1994年9月14将其转为国际保藏，收到的保藏编号为FERM BP-4796。
此外，前述大肠杆菌菌株AJ12604也是生产L-苯丙氨酸细菌的一个优选例子。该菌株是通过将包含编码反馈抑制被脱敏化的DS的基因的质粒pBR-aroG4和包含编码反馈抑制被脱敏化的CM-PD的基因的质粒pACMAB导入具有tyrA基因(欧洲专利申请公开号488424)缺陷的大肠杆菌K-12 W3110菌株中构建而成的。该菌株于1991年1月28保藏于工业科技署、国家生命科学和人类技术研究所、国际贸易和工业部(现在是独立的管理机构，国家高级工业科技研究所，是国际专利微生物保藏单位)，收到的保藏编号为FERMP-11975。之后，根据布达佩斯条约的规定于1991年9月26将其转为国际保藏，收到的保藏为编号FERM BP-3579。
L-色氨酸摄入系统的例子包括Mtr和TnaB。已经报道了编码大肠杆菌Mtr的基因(mtr)和TnaB的基因(tnaB)(Heatwole，V.M.，J.Bacteriol.，173，108-115，1991；Sarsero，J.P.，J.Bacteriol.，173(10)，3231-3234，1991)。这些基因可通过，例如，利用大肠杆菌染色体DNA为模板进行PCR(聚合酶链式反应)(参见White，T.J.等人，Trends Genet.5,185,1989)而获得。mtr扩增引物的例子包括具有SEQ ID NO5和6的核苷酸序列的寡核苷酸。tnaB扩增引物的例子包括具有SEQ ID NO7和8的核苷酸序列的寡核苷酸。前述染色体DNA的来源的例子包括大肠杆菌的野生型菌株，例如，W3110菌株(ATCC39936)。对于tnaB，由于IS(插入序列)插入W3110菌株的tnaB中，该基因编码的TnaB没有活性(Kamath，A.V.等人，J.Bacteriol.，176(5)，1546-1547，1994)，因此使用其它包含能发挥作用的TnaB的细菌菌株。获得tnaB的来源的例子包括大肠杆菌MG1655菌株(ATCC700926)、JM109菌株等。W3110菌株和MG1655菌株可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，10801University Boulevard，Manassas，VA.，20110-2209，U.S.A)获得。JM109菌株可从Takara Shuzo Co.，Ltd.等以商业方式获得。
mtr的核苷酸序列及该基因所编码的Mtr的氨基酸序列示于SEQ ID NO1和2中。tnaB的核苷酸序列及该基因所编码的TnaB的氨基酸序列示于SEQ IDNO3和4中。
本发明中所使用的mtr和tnaB可以分别编码在一个或若干个位点上替换、删除、插入或添加了一个或若干个氨基酸残基的Mtr和TnaB，只要不消除所编码蛋白质Mtr和TnaB的活性。此处所用的“几个”氨基酸残基的数目依据氨基酸残基在蛋白质三维结构中的位置以及氨基酸残基的类型而变化。然而，该数目特别为2～30，优选为2～20，更优选为2～10。
编码基本上等同于前述Mtr和TnaB蛋白的DNA可通过修饰mtr和tnaB的核苷酸序列而获得。例如，可用定点突变在特异位点产生氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或倒位。此外，如上所述的修饰的DNA也可经已知的常规的突变处理获得。突变处理的例子包括，在体外突变处理之前用羟胺或其类似物处理DNA的方法和处理微生物如属于埃希氏菌属细菌的方法，该微生物含有在用紫外线照射或诱变处理中常用的诱变剂例如N-甲基-N′-硝基-亚硝基胍(NTG)、EMS等进行突变处理前的DNA。
编码基本上等同于Mtr和TnaB蛋白的DNA可通过在适宜细胞中表达包含任一前述突变的DNA并检测表达产物的活性而获得。此外，例如，能与具有SEQ ID NO1的第181至1425位核苷酸(编码Mtr的区域)的核苷酸序列的探针杂交的、或能与具有SEQ ID NO3第91至1338位核苷酸的核苷酸序列的探针杂交的、或在严紧条件下能与这些序列的一部分杂交的并编码具有与Mtr和TnaB相同活性的蛋白质的DNA可以从编码具有突变的Mtr和TnaB的DNA或包含这一DNA的细胞获得。此处引用的“严紧条件”定义为这样的条件，即在该条件下形成所谓的特异杂交体而不形成非特异杂交体。该条件难以用任何数值进行表述。然而，严紧条件包括，例如，具70％或更高、优选80％或更高、更优选90％或更高、最优选95％或更高同源性的DNA之间相互杂交，但低于上述同源性的DNA之间不能相互杂交的条件。作为选择，严紧条件例如是指在与典型的Southern杂交的洗涤条件一致的盐浓度下DNA能相互杂交的条件，即60℃时，1×SSC、0.1％SDS，优选0.1×SSC、0.1％SDS。
核苷酸序列SEQ ID NO1或3的部分序列也可用作探针。可通过PCR使用基于核苷酸序列SEQ ID NO1或3制备的寡核苷酸为引物并使用包含核苷酸序列SEQ ID NO1或3的DNA片段作为模板来生产这样的探针。若以长度大约为300bp的DNA片段为探针，则杂交的洗涤条件可以是50℃，2×SSC、0.1％SDS。
编码基本上等同于Mtr蛋白的特定DNA的例子包括，编码优选与氨基酸序列SEQ ID NO2具有70％或更高、更优选80％或更高、进一步优选90％或更高、最优选95％或更高的同源性并具有与Mtr相当活性的蛋白质的DNA。此外，编码基本上等同于TnaB蛋白的特定DNA的例子包括，编码优选与氨基酸序列SEQ ID NO2具有70％或更高、更优选80％或更高、进一步优选90％或更高、最优选95％或更高的同源性并具有与TnaB相当程度的活性的蛋白质的DNA。
其它细菌的mtr和tnaB类似物可通过与前述大肠杆菌的mtr和tnaB所用相同的方式获得。此外，编码除mtr和tnaB之外的摄入系统的基因也可利用熟知的常规的获取基因的方法经PCR从细菌的染色体DNA获得。
染色体DNA可以从作为DNA供体的细菌来制备，例如，通过Saitohe和Miura的方法(参见Saitohe H.和Miura K.，Biochem.Biophys.Acta，72，619，1963；Seibutsu Kogaku Jikkensho(生物工程试验教材)，日本生物科学和生物工程社(Society of Bioscience and Bioengineering)编辑)或者类似方法制备。
如果重组DNA是通过将所获基因与可在大肠杆菌和/或目标细菌中自主复制的载体DNA连接并导入大肠杆菌得到的，则随后的操作就会简单些。可在大肠杆菌细胞中自主复制的载体例子包括pSTV29、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pBR322、pACYC184、pMW219等等。
为了通过将所获基因与在目标细菌中有功能的载体连接以制备重组DNA，可以使用能够提供与前述基因的末端匹配的消化末端的限制性酶来消化载体，可用连接酶例如T4 DNA连接酶将前述基因与载体连接。
可通过增强编码作为摄入系统一部分的蛋白质的基因表达来增强靶物质副产物的摄入系统。基因的表达量可通过增加基因拷贝数来提高。例如，可以把前述基因片段与在细菌中有功能的载体优选多拷贝型载体连接，以制备重组DNA，后者可用来转化生产靶物质的宿主。此外，可将前述重组DNA导入野生型菌株以获得转化体菌株，从而赋予转化体菌株生产靶物质的能力。
可用迄今已报道的任何已知的转化方法将重组DNA导入细菌。例如，已知一种用氯化钙处理受体细菌细胞以提高细胞对DNA通透性的方法并已被报道用于大肠杆菌K-12(Mandel，M.And Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159，1970)，还已知一种从处于生长阶段的细胞制备感受态细胞然后把DNA导入细胞的方法，该方法已被报道用于枯草芽孢杆菌(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Young，F.E.，Gene，1，153，1977)。此外，还已知一种已用于枯草芽孢杆菌、放线菌和酵母的将DNA受体细胞制成易于摄取重组DNA的原生质体或原生质球的方法，随后将重组DNA导入DNA受体细胞的方法(Chang，S.和Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet，168，111，1979；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，Nature，274，398，1978；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，75，1929，1978)。也可用电脉冲方法完成微生物的转化(日本专利公开号2-207791)。
可通过允许多个基因拷贝存在于细菌染色体DNA中来增加基因拷贝数。为了向染色体DNA中导入多个基因拷贝，可以使用以多拷贝数存在于染色体DNA上的序列作为靶进行同源性重组。作为以多拷贝数存在于染色体DNA上的序列，可以使用存在于转座因子末端的重复DNA或反向重复序列。作为选择，如日本专利公开号2-109985所公开的，可通过将所要的基因的多个拷贝掺进转座子并将其转化来将所要的基因的多个拷贝导入染色体DNA。
除前述基因扩增外，还可通过用更强的表达调控序列替换在染色体DNA或质粒上编码摄入系统的基因的表达调控序列例如启动子来增强摄入系统。例如，lac启动子、trp启动子，trc启动子等等已知为强启动子。此外，如国际专利申请WO 0018935所公开的，还可通过把几个核苷酸替换到基因的启动子区域中而将启动子修饰为更强的启动子。前述对启动子的替换或修饰增强了编码摄入系统的基因的表达并因此增强了摄入系统。表达调控序列的修饰可以与基因拷贝数的提高结合进行。
可以通过例如以与基因替换中相同的方式使用温度敏感质粒来完成表达调控序列的替换。具有大肠杆菌温度敏感的复制原点的载体例子包括，例如，国际公开WO 99/03988中所述的质粒pMAN997等。此外，也可以通过利用λ噬菌体的红色重组酶(Datsenko，K.A.，PNAS，97(12)，6640-6645，2000)的方法来完成表达调控序列的替换。
此外，如实施例部分中所示，表达调控序列的替换也可以通过把利用λ噬菌体的红色重组酶的系统和之后的P1转导组合起来的方法进行。首先，通过使用λ噬菌体的红色重组酶的方法把通过PCR得到的表达调控序列导入用作供体的衍生自大肠杆菌W3110菌株的一种菌株中。然后，通过P1转导把表达调控序列从供体菌株转导到受体菌株中。对供体菌株没有限制，只要它衍生自W3110菌株并且具有经过替换的表面调控序列。
此外，在本发明的细菌中，可以将用于把靶物质摄入细胞中的系统删除或削弱。此外，可以增强靶物质的外排系统。
可通过在培养基中培养如上所述获得的本发明的细菌，从而在培养基中积累靶物质并从培养基中收集靶物质来有效地生产靶物质。
除了使用本发明的细菌之外，可用与通常生产靶物质的方式相同的方式来生产本发明的靶物质。可根据细菌的不同来选择适宜的培养条件。
例如，培养基可以是包含碳源、氮源、无机离子和其它所需的有机成分的典型培养基。糖类例如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、木糖、海藻糖、核糖和淀粉水解产物，醇类例如甘油、甘露醇和山梨醇，以及有机酸例如葡萄糖酸、反丁烯二酸、柠檬酸和琥珀酸。无机铵盐例如硫酸铵、氯化铵和磷酸铵可被用作碳源，有机氮例如大豆水解产物、氨气、氨水等，可被用作氮源。至于有机痕量营养物，优选适量添加所需的物质，例如，维生素如维生素B1、核酸如腺嘌呤和RNA、酵母提取物等。除这些物质外，根据需要添加小量的磷酸钙、硫酸镁、铁离子、镁离子等。如果本发明的细菌是tyrA基因缺陷的，则要向培养基中添加生长所需的L-酪氨酸。
例如对于大肠杆菌，优选在有氧条件下培养大约16至72小时。培养期间，培养温度控制在30～45℃，pH控制在5～8。可以用无机或有机、酸性或碱性物质以及氨气等来调节pH。
可以使用已知方法的组合从培养基收集靶物质。这类方法典型地使用离子交换树脂、沉淀以及其它方法，取决于靶物质。
实施例参照以下非限制性实施例对本发明作更详尽的阐述。
实施例1<1>携带mtr基因的质粒和携带tnaB基因的质粒的构建(1)携带mtr基因的质粒的构建以大肠杆菌W3110菌染色体DNA为模板、以具有核苷酸序列SEQ ID NO5和6的寡核苷酸为引物进行PCR。使用LATaq(Takara Shuzo)进行PCR，循环程序是在94℃下两分钟(一个循环)，之后进行在94℃下30秒、在55℃下30秒、在72℃下1分钟30秒的循环30次。获得包括启动子和mtr ORF，约1.5kb的扩增片段。
用MicroSpinsTMS400HR柱(Amarsham Pharmacia Biotech Inc.)纯化上述扩增片段，之后用SacI和KpnI消化，并与同样经过SacI和KpnI消化的pSTV28和pSTV29连接(Takara Shuzo)。用该反应混合物转化大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Shuzo)。在含有氯霉素、IPTG和X-Gal的LB平板上培养转化体。选择白色的菌落。从选择出的转化体获得携带mtr的质粒pSTV28mtr和pSTV29mtr。
在pSTV28mtr中，mtr基因的插入方向与乳糖启动子相同。另一方面，在pSTV29mtr中，mtr基因的插入方向与乳糖启动子相反。
(2)携带tnaB基因的质粒的构建以大肠杆菌MG1655菌株的染色体DNA为模板、以具有核苷酸序列SEQ IDNO7和8的寡核苷酸为引物进行PCR。用LATaq(Takara Shuzo)进行PCR，循环程序是94℃两分钟(一个循环)，之后进行94℃下30秒、55℃30秒、72℃1分钟30秒的循环30次。获得包含tnaB ORF的约1.5kb的扩增片段。tnaB与tnaA形成操纵子，在紧邻tnaB的上游处不存在启动子。
用MicroSpinsTMS400HR柱(Amarsham Pharmacia Biotech Inc.)纯化上述扩增片段，之后用SacI和KpnI消化并与同样经过SalI和PstI消化的pSTV28和pSTV29连接(Takara Shuzo)。用该反应混合物转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(Takara Shuzo)。在含有氯霉素、IPTG和X-Gal的LB平板上培养转化体。选择白色的菌落。从选择出的转化体获得携带tnaB的质粒pSTV28tnaB和pSTV29tnaB。
在pSTV28tnaB中，tnaB基因的插入方向与乳糖启动子相同。另一方面，在pSTV29tnaB中，tnaB基因的插入方向与乳糖启动子相反。
<2>mtr和tnaB增强的菌株的构建以及L-苯丙氨酸的生产(1)用常规方法将前述质粒pSTV28mtr、pSTV29mtr、pSTV28tnaB、pSTV29tnaB导入生产L-苯丙氨酸的细菌，大肠杆菌AJ12741菌株(参见日本专利号3225597，以下也称为“R/GAL菌株”)中以获得R/GAL/pSTV28mtr、R/GAL/pSTV29mtr、R/GAL/pSTV28tnaB和R/GAL/pSTV29tnaB。然后评估这些转化体和R/GAL菌株生产L-苯丙氨酸的能力。
将20ml具有以下组成的培养基加入Sakaguchi瓶(500ml)，接种各细菌菌株并于37℃下培养直到消耗完所有的葡萄糖。培养后测定培养基中积累的L-苯丙氨酸(L-Phe)和L-色氨酸(L-Trp)的量。结果示于表2中。
培养基的组成(pH7.0)葡萄糖 40g/L七水硫酸镁 1g/L硫酸铵 16g/L磷酸二氢钾 1g/L酵母提取物 2g/L七水硫酸亚铁 10mg/L四水或五水硫酸镁 8mg/LL-酪氨酸 125mg/L氨苄青霉素 50mg/L氯霉素(对于R/GAL菌株不加) 50mg/L碳酸钙 30g/L
表2细菌菌株 L-Phe(g/L) L-Trp(mg/L)R/GAL 6.8 60R/GAL/pSTV28mtr 6.6 ＜1.5R/GAL/pSTV29mtr 6.7 ＜1.5R/GAL/pSTV28tnaB 6.6 ＜1.5R/GAL/pSTV29tnaB 6.7 ＜1.5如表2中所示，R/GAL菌株生产副产物L-色氨酸。然而，mtr增强的菌株和tnaB增强的菌株不生产副产物L-色氨酸，且能够导致L-苯丙氨酸的积累，积累量与用R/GAL菌株获得的相当。
实施例2<1>mtr基因启动子增强的菌株和tnaB基因启动子增强的菌株的构建通过利用将采用λ噬菌体的红色重组酶(Datsenko，K.A.，PNAS，97(12)，6640-6645，2000)的系统和P1转导组合的方法，将λ噬菌体的PL启动子插入大肠杆菌的染色体上的mtr基因和tnaB基因的编码区以构建mtr基因启动子增强的菌株和tnaB基因启动子增强的菌株。
首先，分别通过PCR扩增λ噬菌体衍生的attR序列(1)、Tn9衍生的cat基因(2)、T7噬菌体衍生的Pa2启动子序列(3)、pBR322衍生的tet基因序列(部分序列)(4)、λ噬菌体衍生的attL序列(5)。以λDNA为模板、以(1)f(SEQ ID NO9)和(1)r(SEQ ID NO10)为引物来扩增片段(1)。以具有Tn9的大肠杆菌例如GM2159和GM2150的染色体DNA为模板、以(2)f(SEQ ID NO11)和(2)r(SEQ ID NO12)为引物来扩增片段(2)。以T7噬菌体DNA为模板、以(3)f(SEQ ID NO13)和(3)r(SEQ ID NO14)为引物来扩增片段(3)。以pBR322为模板、以(4)f(SEQ ID NO15)和(4)r(SEQ ID NO16)为引物来扩增片段(4)。以λDNA为模板、以(5)f(SEQ ID NO17)和(5)r(SEQ ID NO18)为引物来扩增片段(5)。前述GM2159和GM2150可获自大肠杆菌遗传保存中心(E.Coli Genetic Stock Center)(Yale Uiversity，Dept.Biology，Osborn MemorialLabs.，P.O.Box 6666，New Heven，CT，U.S.A.，06511-7444)。
此外，通过将合成的DNA(6)f(SEQ ID NO19)与(6)r(SEQ ID NO20)退火而得到thr操纵子终止子序列(58bp)(6)。
用如表3所示的所得片段的每个进行交换PCR以得到与片段(1)、(6)、(2)、(3)、(4)和(5)连接的DNA片段(下文称作“片段A”)。
表3模板 引物 所得片段(1)和(6) (1)f和(6)r2 (1)+(6)(2)和(3) (2)f和(3)r (2)+(3)(4)和(5) (4)f和(5)r (4)+(5)(1)+(6)和(2)+(3) (1)f和(3)r (1)+(6)+(2)+(3)(1)+(6)+(2)+(3)和(4)+(5) (1)f和(5)r (1)+(6)+(2)+(3)+(4)+(5)随后，以λDNA为模板、以P1(SEQ ID NO21)和P2mtr(包括36bp的mtr ORF序列，SEQ ID NO22)或P2tnab(包括36bp的tnaB ORF序列，SEQ ID NO23)为引物通过PCR扩增PL启动子序列(添加位于lacZ的上游的SD序列)。使用该扩增片段和片段A作为模板以及使用一种包括mtr基因的或tnaB的基因ORF的上游区域的序列(36bp)的引物(1)fmtr(SEQ ID NO24)或(1)ftnab(SEQ ID NO25)和引物P2mtr或P2tnab来完成交换PCR。各扩增片段两端都包含mtr基因或tnaB基因的上游区域的序列和ORF的内部序列。这些DNA片段的核苷酸序列示于SEQ ID NO26和27中。这些DNA片段的结构示于表4中。
表4


用常规方法将上述各DNA片段导入已事先导入了辅助质粒pKD46的衍生自大肠杆菌K-12W3110的TD-18菌株中。已知pKD46表达红色重组酶(PNAS，97(12)，6640-6645，2000)。发生基因替换后，从转化体中删去质粒pKD46。
由于转化的菌株表现出氯霉素抗性，因此可利用该特征有效地选择所需要的mtr基因和tnaB基因启动子增强的菌株。
然后，用P1噬菌体感染上述mtr基因或tnaB基因启动子增强的菌侏。使用每个P1噬菌体感染的菌株作为供体用于P1转导，通过利用氯霉素抗性作为指标，经过P1转导用PL启动子替换生产L-苯丙氨酸的细菌AJ12741(R/GAL菌株)的mtr基因或tnaB基因ORF的上游区域。经PCR证实，所要的基因替换已经发生了。
通过用前述方法将各扩增的DNA片段导入作为宿主的生产L-苯丙氨酸的细菌AJ12741菌株(R/GAL菌株)中，可以得到其中mtr基因或tnaB基因ORF的上游区域被PL启动子取代的细菌菌株。
<2>利用mtr基因启动子增强的菌株和tnaB基因启动子增强的菌株生产L-苯丙氨酸按照与上述相同的方法获得其中mtr基因ORF的上游区域被PL启动子替换的R/GAL菌株(RM11)，和其中tnaB基因ORF的上游区域被PL启动子替换的R/GAL菌株(Rtp32)。用与实施例1中相同的方法培养这些细菌菌株以生产L-苯丙氨酸，测定培养基中L-苯丙氨酸和L-色氨酸的含量。结果示于表5中。
表5细菌菌株 L-Phe(g/L) L-Trp(mg/L)R/GAL 6.8 60RM11 6.9 ＜1.5Rtp22 7.1 ＜1.5如表5所示，R/GAL菌株生产副产物L-色氨酸。然而，mtr基因启动子增强的菌株RM11和tnaB基因启动子增强的菌株Rtp32不产生副产物L-色氨酸，并且积累的L-苯丙氨酸的量与获自R/GAL菌株的相当。
尽管参考优选的实施方式对本发明作了详细描述，但是显然对于本领域技术人员来说可以做各种变化并使用等价物，而不会脱离本发明范围。在此全文引入前述各文献以及外国优先权文本JP2003-161181作为参考。
序列表<110>Ajinomoto Co.，Inc.
<120>生产靶物质的方法<130>OP-C4047<150>JP 2003-161181<151>2003-06-05<160>27<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1550<212>DNA<213>大肠杆菌<220>
<221>CDS<222>(181)..(1425)<400>1cgtcgtcgtt tcggtggtga tgcgtaatca tcgctgaaca gcgaacacaa tctgtaaaat 60aatatataca gccccgattt ttaccatcgg ggcttttttt ctgtcttttg tactcgtgta 120ctggtacagt gcaatgcata acaacgcagt cgcactattt ttcactggag agaagccctc 180atg gca aca cta acc acc acc caa acg tca ccg tcg ctg ctt ggc ggc 228Met Ala Thr Leu Thr Thr Thr Gln Thr Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly1 5 10 15gtg gtg att atc ggc ggc acc att att ggc gca ggg atg ttt tct ctg 276Val Val Ile Ile Gly Gly Thr Ile Ile Gly Ala Gly Met Phe Ser Leu20 25 30cca gtg gtc atg tcc ggg gcg tgg ttt ttc tgg tca atg gcg gcg ctg 324Pro Val Val Met Ser Gly Ala Trp Phe Phe Trp Ser Met Ala Ala Leu35 40 45atc ttt acc tgg ttc tgt atg ctg cat tcc ggc ttg atg att ctg gaa 372Ile Phe Thr Trp Phe Cys Met Leu His Ser Gly Leu Met Ile Leu Glu50 55 60gct aac ctg aat tac aga atc ggt tcg agt ttt gac acc atc acc aaa 420Ala Asn Leu Asn Tyr Arg Ile Gly Ser Ser Phe Asp Thr Ile Thr Lys65 70 75 80gat ttg ctg ggc aaa ggc tgg aac gtg gtc aac ggc att tcc att gcc 468
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<221>CDS
<222>(91)..(1338)<400>3ttaatactac agagtggcta taaggatgtt agccactctc ttaccctaca tcctcaataa 60caaaaatagc cttcctctaa aggtggcatc atg act gat caa gct gaa aaa aag 114Met Thr Asp Gln Ala Glu Lys Lys1 5cac tct gca ttt tgg ggt gtt atg gtt ata gca ggt aca gta att ggt 162His Ser Ala Phe Trp Gly Val Met Val Ile Ala Gly Thr Val Ile Gly10 15 20gga ggt atg ttt gct tta cct gtt gat ctt gcc ggt gcc tgg ttt ttc 210Gly Gly Met Phe Ala Leu Pro Val Asp Leu Ala Gly Ala Trp Phe Phe25 30 35 40tgg ggt gcc ttt atc ctt atc att gcc tgg ttt tca atg ctt cat tcc 258Trp Gly Ala Phe Ile Leu Ile Ile Ala Trp Phe Ser Met Leu His Ser45 50 55ggg tta ttg tta tta gaa gca aat tta aat tat ccc gtc ggc tcc agt 306Gly Leu Leu Leu Leu Glu Ala Asn Leu Asn Tyr Pro Val Gly Ser Ser60 65 70ttt aac acc atc acc aaa gat tta atc ggt aac acc tgg aac att atc 354Phe Asn Thr Ile Thr Lys Asp Leu Ile Gly Asn Thr Trp Asn Ile Ile75 80 85agc ggt att acc gtt gcc ttc gtt ctc tat atc ctc act tat gcc tat 402Ser Gly Ile Thr Val Ala Phe Val Leu Tyr Ile Leu Thr Tyr Ala Tyr90 95 100atc tct gct aat ggt gcg atc att agt gaa acg ata tca atg aat ttg 450Ile Ser Ala Asn Gly Ala Ile Ile Ser Glu Thr Ile Ser Met Asn Leu105 110 115 120ggt tat cac gct aat cca cgt att gtc ggg atc tgc aca gcc att ttc 498Gly Tyr His Ala Asn Pro Arg Ile Val Gly Ile Cys Thr Ala Ile Phe125 130 135gtt gcc agc gta ttg tgg tta agt tcg tta gcc gcc agt cgt att acc 546Val Ala Ser Val Leu Trp Leu Ser Ser Leu Ala Ala Ser Arg Ile Thr140 145 150tca ttg ttc ctc ggg ctg aag att atc tcc ttt gtg atc gtg ttt ggt 594Ser Leu Phe Leu Gly Leu Lys Ile Ile Ser Phe Val Ile Val Phe Gly155 160 165tct ttt ttc ttc cag gtc gat tac tcc att ctg cgc gac gcc acc agc 642Ser Phe Phe Phe Gln Val Asp Tyr Ser Ile Leu Arg Asp Ala Thr Ser170 175 180tcc act gcg gga acg tct tac ttc ccg tat atc ttt atg gct ttg ccg 690Ser Thr Ala Gly Thr Ser Tyr Phe Pro Tyr Ile Phe Met Ala Leu Pro185 190 195 200gtg tgt ctg gcg tca ttt ggt ttc cac ggc aat att ccc agc ctg att 738
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<210>4<211>415<212>PRT<213>大肠杆菌<400>4Met Thr Asp Gln Ala Glu Lys Lys His Ser Ala Phe Trp Gly Val Met1 5 10 15Val Ile Ala Gly Thr Val Ile Gly Gly Gly Met Phe Ala Leu Pro Val20 25 30Asp Leu Ala Gly Ala Trp Phe Phe Trp Gly Ala Phe Ile Leu Ile Ile35 40 45Ala Trp Phe Ser Met Leu His Ser Gly Leu Leu Leu Leu Glu Ala Asn50 55 60Leu Asn Tyr Pro Val Gly Ser Ser Phe Asn Thr Ile Thr Lys Asp Leu65 70 75 80Ile Gly Asn Thr Trp Asn Ile Ile Ser Gly Ile Thr Val Ala Phe Val85 90 95Leu Tyr Ile Leu Thr Tyr Ala Tyr Ile Ser Ala Asn Gly Ala Ile Ile100 105 110Ser Glu Thr Ile Ser Met Asn Leu Gly Tyr His Ala Asn Pro Arg Ile115 120 125Val Gly Ile Cys Thr Ala Ile Phe Val Ala Ser Val Leu Trp Leu Ser130 135 140Ser Leu Ala Ala Ser Arg Ile Thr Ser Leu Phe Leu Gly Leu Lys Ile145 150 155 160Ile Ser Phe Val Ile Val Phe Gly Ser Phe Phe Phe Gln Val Asp Tyr165 170 175Ser Ile Leu Arg Asp Ala Thr Ser Ser Thr Ala Gly Thr Ser Tyr Phe180 185 190Pro Tyr Ile Phe Met Ala Leu Pro Val Cys Leu Ala Ser Phe Gly Phe195 200 205His Gly Asn Ile Pro Ser Leu Ile Ile Cys Tyr Gly Lys Arg Lys Asp210 215 220Lys Leu Ile Lys Ser Val Val Phe Gly Ser Leu Leu Ala Leu Val Ile225 230 235 240Tyr Leu Phe Trp Leu Tyr Cys Thr Met Gly Asn Ile Pro Arg Glu Ser245 250 255Phe Lys Ala Ile Ile Ser Ser Gly Gly Asn Val Asp Ser Leu Val Lys260 265 270Ser Phe Leu Gly Thr Lys Gln His Gly Ile Ile Glu Phe Cys Leu Leu275 280 285Val Phe Ser Asn Leu Ala Val Ala Ser Ser Phe Phe Gly Val Thr Leu290 295 300
Gly Leu Phe Asp Tyr Leu Ala Asp Leu Phe Lys Ile Asp Asn Ser His305 310 315 320Gly Gly Arg Phe Lys Thr Val Leu Leu Thr Phe Leu Pro Pro Ala Leu325 330 335Leu Tyr Leu Ile Phe Pro Asn Gly Phe Ile Tyr Gly Ile Gly Gly Ala340 345 350Gly Leu Cys Ala Thr Ile Trp Ala Val Ile Ile Pro Ala Val Leu Ala355 360 365Ile Lys Ala Arg Lys Lys Phe Pro Asn Gln Met Phe Thr Val Trp Gly370 375 380Gly Asn Leu Ile Pro Ala Ile Val Ile Leu Phe Gly Ile Thr Val Ile385 390 395 400Leu Cys Trp Phe Gly Asn Val Phe Asn Val Leu Pro Lys Phe Gly405 410 415<210>5<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>5gggagctcgt cgtttcggtg gtgatgcgta 30<210>6<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>6ggggtaccga tagtgtgtct taacgcggga 30<210>7<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物
<400>7gggtcgacgt tagccactct cttaccctac 30<210>8<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>8ggctgcagcg caaagcatac gtggtgaagg 30<210>9<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物(1)f<400>9cgctcaagtt agtataaa 18<210>10<211>54<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物(1)r<400>10cctgacagtg cgggcttttt ttttcgacca ctgcagtctg ttacaggtca ctaa 54<210>11<211>54<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物(2)f
<400>11cccgcactgt caggtgcggg cttttttctg tgttaagctt cgacgaattt ctgc 54<210>12<211>54<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物(2)r<400>12gcagcgtcaa ccgggcgctc tagctagata tcggatccga gattttcagg agct 54<210>13<211>54<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物(3)f<400>13agctcctgaa aatctcggat ccgatatcta gctagagcgc ccggttgacg ctgc 54<210>14<211>54<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物(3)r<400>14ctacgcgatc atggcgacca cacccgtcct gtggatctcc ggataagtag acag 54<210>15<211>54<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物(4)f
<400>15ttcgtgcgac ttatcaggct gtctacttat ccggagatcc acaggacggg tgtg 54<210>16<211>54<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物(4)r<400>16cgaattctca tgtttgacag cttatcatcg ataagcttta atgcggtagt ttat 54<210>17<211>54<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物(5)f<400>17ttagcaattt aactgtgata aactaccgca ttaaagctta tcgatgataa gctg 54<210>18<211>54<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物(5)r<400>18ttttgcaggg gggcattgtt tggtaggtga agatcttgaa gcctgctttt ttat 54<210>19<211>58<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成的DNA(6)f
<400>19ctgcagtggt cgaaaaaaaa agcccgcact gtcaggtgcg ggcttttttc tgtgttaa 58<210>20<211>58<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成的DNA(6)r<400>20ttaacacaga aaaaagcccg cacctgacag tgcgggcttt ttttttcgac cactgcag 58<210>21<211>54<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P1<400>21tgccaactta gtataaaaaa gcaggcttca agatcttcac ctaccaaaca atgc 54<210>22<211>72<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P2mtr<400>22cgacggtgac gtttgggtgg tggttagtgt tgccatagcc tgtttccttc tagacggcca 60atgcttcgtt tc 72<210>23<211>72<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P2tnab<400>23aaatgcagag tgcttttttt cagcttgatc agtcatagcc tgtttccttc tagacggcca 60atgcttcgtt tc 72<210>24<211>54<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物(1)fmtr<400>24gcgaacacaa tctgtaaaat aatatataca gccccgcgct caagttagta taaa 54<210>25<211>54<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物(1)ftnab<400>25tcctcaataa caaaaatagc cttcctctaa aggtggcgct caagttagta taaa 54<210>26<211>3178<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>融合基因<400>26gcgaacacaa tctgtaaaat aatatataca gccccgcgct caagttagta taaaaaagct 60gaacgagaaa cgtaaaatga tataaatatc aatatattaa attagatttt gcataaaaaa 120cagactacat aatactgtaa aacacaacat atgcagtcac tatgaatcaa ctacttagat 180ggtattagtg acctgtaaca gactgcagtg gtcgaaaaaa aaagcccgca ctgtcaggtg 240cgggcttttt tctgtgttaa gcttcgacga atttctgcca ttcatccgct tattatcact 300tattcaggcg tagcaccagg cgtttaaggg caccaataac tgccttaaaa aaattacgcc 360ccgccctgcc actcatcgca gtactgttgt aattcattaa gcattctgcc gacatggaag 420
ccatcacaga cggcatgatg aacctgaatc gccagcggca tcagcacctt gtcgccttgc 480gtataatatt tgcccatggt gaaaacgggg gcgaagaagt tgtccatatt ggccacgttt 540aaatcaaaac tggtgaaact cacccaggga ttggctgaga cgaaaaacat attctcaata 600aaccctttag ggaaataggc caggttttca ccgtaacacg ccacatcttg cgaatatatg 660tgtagaaact gccggaaatc gtcgtggtat tcactccaga gcgatgaaaa cgtttcagtt 720tgctcatgga aaacggtgta acaagggtga acactatccc atatcaccag ctcaccgtct 780ttcattgcca tacggaattc cggatgagca ttcatcaggc gggcaagaat gtgaataaag 840gccggataaa acttgtgctt atttttcttt acggtcttta aaaaggccgt aatatccagc 900tgaacggtct ggttataggt acattgagca actgactgaa atgcctcaaa atgttcttta 960cgatgccatt gggatatatc aacggtggta tatccagtga tttttttctc cattttagct 1020tccttagctc ctgaaaatct cggatccgat atctagctag agcgcccggt tgacgctgct 1080agtgttacct agcgatttgt atcttactgc atgttacttc atgttgtcaa tacctgtttt 1140tcgtgcgact tatcaggctg tctacttatc cggagatcca caggacgggt gtggtcgcca 1200tgatcgcgta gtcgatagtg gctccaagta gcgaagcgag caggactggg cggcggccaa 1260agcggtcgga cagtgctccg agaacgggtg cgcatagaaa ttgcatcaac gcatatagcg 1320ctagcagcac gccatagtga ctggcgatgc tgtcggaatg gacgatatcc cgcaagaggc 1380ccggcagtac cggcataacc aagcctatgc ctacagcatc cagggtgacg gtgccgagga 1440tgacgatgag cgcattgtta gatttcatac acggtgcctg actgcgttag caatttaact 1500gtgataaact accgcattaa agcttatcga tgataagctg tcaaacatga gaattcgaaa 1560tcaaataatg attttatttt gactgatagt gacctgttcg ttgcaacaaa ttgataagca 1620atgctttttt ataatgccaa cttagtataa aaaagcaggc ttcaagatct tcacctacca 1680aacaatgccc ccctgcaaaa aataaattca tataaaaaac atacagataa ccatctgcgg 1740tgataaatta tctctggcgg tgttgacata aataccactg gcggtgatac tgagcacatc 1800agcaggacgc actgaccacc atgaaggtga cgctcttaaa aattaagccc tgaagaaggg 1860cagcattcaa agcagaaggc tttggggtgt gtgatacgaa acgaagcatt ggccgtctag 1920aaggaaacag gctatggcaa cactaaccac cacccaaacg tcaccgtcgc tgcttggcgg 1980cgtggtgatt atcggcggca ccattattgg cgcagggatg ttttctctgc cagtggtcat 2040gtccggggcg tggtttttct ggtcaatggc ggcgctgatc tttacctggt tctgtatgct 2100gcattccggc ttgatgattc tggaagctaa cctgaattac agaatcggtt cgagttttga 2160caccatcacc aaagatttgc tgggcaaagg ctggaacgtg gtcaacggca tttccattgc 2220ctttgtgctc tatatcctga cctatgccta tatttctgcc agtggttcga ttctgcatca 2280caccttcgca gagatgtcac taaacgtccc ggcacgggcg gcgggttttg gttttgcatt 2340gctggtagcg tttgtggtgt ggttgagcac taaagccgtc agtcgcatga cagcgattgt 2400gctgggggcg aaagtcatta ccttcttcct cacctttggt agcctgctgg ggcatgtgca 2460gcctgcgaca ttgttcaacg tcgccgaaag caatgcgtct tatgcaccgt atctgttgat 2520gaccctgccg ttctgtctgg catcgtttgg ttatcacggt aacgtgccaa gcctgatgaa 2580gtattacggc aaagatccga aaaccatcgt gaaatgtctg gtgtacggta cgctgatggc 2640gctggcgctg tataccatct ggttgctggc gacgatgggt aacatcccgc gtccggagtt 2700tatcggtatt gcagagaagg gcggtaatat tgatgtgctg gtacaggcgt taagcggcgt 2760actgaacagc cgtagtctgg atctgctgct ggtcgtgttc tcaaactttg cggtagcgag 2820ttcgttcctc ggcgtaacgc tgggtttgtt tgactatctg gcagatctgt ttggtttcga 2880cgactcggct gtgggccgct tgaaaacggc attgctgacc tttgccccgc cagttgtggg 2940ggggctgttg ttcccgaacg gattcctgta cgccattggt tatgctggtt tagcggctac 3000catctgggcg gcaattgttc cggcgctgtt agcccgtgca tcgcgtaaac gctttggcag 3060
cccgaaattc cgcgtctggg gtggcaagcc gatgattgcg ctgattctgg tgtttggcgt 3120cggcaacgca ctggtgcata ttttatcgag ctttaattta ctgccggtgt atcagtaa 3178<210>27<211>3181<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>融合基因<400>27tcctcaataa caaaaatagc cttcctctaa aggtggcgct caagttagta taaaaaagct 60gaacgagaaa cgtaaaatga tataaatatc aatatattaa attagatttt gcataaaaaa 120cagactacat aatactgtaa aacacaacat atgcagtcac tatgaatcaa ctacttagat 180ggtattagtg acctgtaaca gactgcagtg gtcgaaaaaa aaagcccgca ctgtcaggtg 240cgggcttttt tctgtgttaa gcttcgacga atttctgcca ttcatccgct tattatcact 300tattcaggcg tagcaccagg cgtttaaggg caccaataac tgccttaaaa aaattacgcc 360ccgccctgcc actcatcgca gtactgttgt aattcattaa gcattctgcc gacatggaag 420ccatcacaga cggcatgatg aacctgaatc gccagcggca tcagcacctt gtcgccttgc 480gtataatatt tgcccatggt gaaaacgggg gcgaagaagt tgtccatatt ggccacgttt 540aaatcaaaac tggtgaaact cacccaggga ttggctgaga cgaaaaacat attctcaata 600aaccctttag ggaaataggc caggttttca ccgtaacacg ccacatcttg cgaatatatg 660tgtagaaact gccggaaatc gtcgtggtat tcactccaga gcgatgaaaa cgtttcagtt 720tgctcatgga aaacggtgta acaagggtga acactatccc atatcaccag ctcaccgtct 780ttcattgcca tacggaattc cggatgagca ttcatcaggc gggcaagaat gtgaataaag 840gccggataaa acttgtgctt atttttcttt acggtcttta aaaaggccgt aatatccagc 900tgaacggtct ggttataggt acattgagca actgactgaa atgcctcaaa atgttcttta 960cgatgccatt gggatatatc aacggtggta tatccagtga tttttttctc cattttagct 1020tccttagctc ctgaaaatct cggatccgat atctagctag agcgcccggt tgacgctgct 1080agtgttacct agcgatttgt atcttactgc atgttacttc atgttgtcaa tacctgtttt 1140tcgtgcgact tatcaggctg tctacttatc cggagatcca caggacgggt gtggtcgcca 1200tgatcgcgta gtcgatagtg gctccaagta gcgaagcgag caggactggg cggcggccaa 1260agcggtcgga cagtgctccg agaacgggtg cgcatagaaa ttgcatcaac gcatatagcg 1320ctagcagcac gccatagtga ctggcgatgc tgtcggaatg gacgatatcc cgcaagaggc 1380ccggcagtac cggcataacc aagcctatgc ctacagcatc cagggtgacg gtgccgagga 1440tgacgatgag cgcattgtta gatttcatac acggtgcctg actgcgttag caatttaact 1500gtgataaact accgcattaa agcttatcga tgataagctg tcaaacatga gaattcgaaa 1560tcaaataatg attttatttt gactgatagt gacctgttcg ttgcaacaaa ttgataagca 1620atgctttttt ataatgccaa cttagtataa aaaagcaggc ttcaagatct tcacctacca 1680aacaatgccc ccctgcaaaa aataaattca tataaaaaac atacagataa ccatctgcgg 1740tgataaatta tctctggcgg tgttgacata aataccactg gcggtgatac tgagcacatc 1800agcaggacgc actgaccacc atgaaggtga cgctcttaaa aattaagccc tgaagaaggg 1860cagcattcaa agcagaaggc tttggggtgt gtgatacgaa acgaagcatt ggccgtctag 1920
aaggaaacag gctatgactg atcaagctga aaaaaagcac tctgcatttt ggggtgttat 1980ggttatagca ggtacagtaa ttggtggagg tatgtttgct ttacctgttg atcttgccgg 2040tgcctggttt ttctggggtg cctttatcct tatcattgcc tggttttcaa tgcttcattc 2100cgggttattg ttattagaag caaatttaaa ttatcccgtc ggctccagtt ttaacaccat 2160caccaaagat ttaatcggta acacctggaa cattatcagc ggtattaccg ttgccttcgt 2220tctctatatc ctcacttatg cctatatctc tgctaatggt gcgatcatta gtgaaacgat 2280atcaatgaat ttgggttatc acgctaatcc acgtattgtc gggatctgca cagccatttt 2340cgttgccagc gtattgtggt taagttcgtt agccgccagt cgtattacct cattgttcct 2400cgggctgaag attatctcct ttgtgatcgt gtttggttct tttttcttcc aggtcgatta 2460ctccattctg cgcgacgcca ccagctccac tgcgggaacg tcttacttcc cgtatatctt 2520tatggctttg ccggtgtgtc tggcgtcatt tggtttccac ggcaatattc ccagcctgat 2580tatttgctat ggaaaacgca aagataagtt aatcaaaagc gtggtatttg gttcgctgct 2640ggcgctggtg atttatctct tctggctcta ttgcaccatg gggaatattc cgcgagaaag 2700ctttaaggcg attatctcct caggcggcaa cgttgattcg ctggtgaaat cgttcctcgg 2760caccaaacag cacggcatta tcgagttttg cctgctggtg ttctctaact tagctgttgc 2820cagttcgttc tttggtgtca cgctggggtt gttcgattat ctggcggacc tgtttaagat 2880tgataactcc cacggcgggc gtttcaaaac cgtgctgtta accttcctgc cacctgcgtt 2940gttgtatctg atcttcccga acggctttat ttacgggatc ggcggtgccg ggctgtgcgc 3000caccatctgg gcggtcatta ttcccgcagt gcttgcaatc aaagctcgca agaagtttcc 3060caatcagatg ttcacggtct ggggcggcaa tcttattccg gcgattgtca ttctctttgg 3120tataaccgtg attttgtgct ggttcggcaa cgtctttaac gtgttaccta aatttggcta 3180a 3181
权利要求
1.一种生产靶物质的方法，包括(a)在培养基中培养具有靶物质生产能力的细菌，和(b)从培养基中收集靶物质，其中所述细菌经过修饰，使得靶物质的副产物或靶物质的生物合成系统的底物的细胞摄入系统得到增强。
2.根据权利要求
1的方法，其中所述副产物选自所述靶物质的生物合成途径中的中间体、所述靶物质的生物合成途径中的底物以及从所述途径分支出来的另一生物合成途径的产物。
3.根据权利要求
1的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属。
4.根据权利要求
1的方法，其中所述靶物质是L-苯丙氨酸，所述副产物是L-色氨酸。
5.根据权利要求
1的方法，其中所述副产物的摄入系统选自Mtr和TnaB。
6.根据权利要求
5的方法，其中所述系统的活性可通过选自下列的一种方法而得到提高(a)增加mtr基因或tnaB基因的拷贝数，和(b)修饰mtr基因或tnaB基因的表达调控序列。
7.根据权利要求
6的方法，其中所述mtr基因含有选自下列的一种DNA序列(a)编码SEQ ID No.2中所示的蛋白质序列的DNA序列，(b)SEQ ID No.1中所示的DNA序列，和(c)编码SEQ ID No.2中所示的蛋白质序列并且经过了修饰的DNA序列，其中经过所述修饰，在一个或几个位点上替换、删除、插入或添加了一个或几个氨基酸残基，修饰后的序列与SEQ ID No.2中所示序列具有至少70％的同源性，其中所述mtr基因编码一种具有Mtr蛋白质活性的蛋白质。
8.根据权利要求
6的方法，其中所述tnaB基因含有选自下列的一种DNA序列(a)编码SEQ ID No.4中所示的蛋白质序列的DNA序列，(b)SEQ ID No.3中所示的DNA序列，和(c)编码SEQ ID No.4中所示的蛋白质序列并且经过了修饰的DNA序列，其中经过所述修饰，在一个或几个位点上替换、删除、插入或添加了一个或几个氨基酸残基，并且修饰后的序列与SEQ ID No.4中所示的序列具有至少70％的同源性，其中所述的tnaB基因编码一种具有TnaB蛋白质活性的蛋白质。
9.一种属于埃希氏菌(Escherichia)属的细菌，其具有生产靶物质的能力并发生了选自以下的一种修饰(a)增强靶物质副产物的细胞摄入系统，和(b)增强靶物质生物合成系统底物的细胞摄入系统。
10.根据权利要求
9的方法，其中所述靶物质是L-苯丙氨酸，所述副产物是L-色氨酸，以及所述的细胞摄入系统选自Mtr和TnaB。
11.根据权利要求
10的方法，其中所述Mtr或TnaB的活性可以通过选自下列的一种方法而得到提高(a)增加mtr基因或tnaB基因的拷贝数，和(b)修饰mtr基因或tnaB基因的表达调控序列。
12.根据权利要求
11的细菌，其中所述的mtr基因含有选自下列的一种DNA序列(a)编码SEQ ID No.2中所示的蛋白质序列的DNA序列，(b)SEQ ID No.1中所示的DNA序列，和(c)编码SEQ ID No.2中所示的蛋白质序列并且经过了修饰的DNA序列，其中经过所述修饰，在一个或几个位点上替换、删除、插入或添加了一个或几个氨基酸残基，并且修饰后的序列与SEQ ID No.2中所示的序列具有至少70％的同源性，其中所述mtr基因编码一种具有Mtr蛋白质活性的蛋白质。
13.根据权利要求
11的细菌，其中所述tnaB基因含有选自下列的一种DNA序列(a)编码SEQ ID No.4中所示的蛋白质序列的DNA序列，(b)SEQ ID No.3中所示的DNA序列，和编码SEQ ID No.4中所示的蛋白质序列并且经过了修饰的DNA序列，其中经过所述修饰是在一个或几个位点上替换、删除、插入或添加了一个或几个氨基酸残基，并且修饰后的序列与SEQ ID No.4中所示的序列具有至少70％的同源性，其中所述的tnaB基因编码一种具有TnaB蛋白质活性的蛋白质。
专利摘要
通过在培养基中培养具有靶物质生产能力的细菌使所述靶物质在培养基中累积并从培养基中收集该靶物质来生产靶物质，其中所述细菌经过修饰，使得靶物质的副产物或靶物质的生物合成系统的底物被细菌细胞摄入的系统得到增强。
文档编号C12N15/67GKCN1572868SQ200410063189
公开日2005年2月2日 申请日期2004年6月4日
发明者山本洋子, 伊藤久生 申请人:味之素株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan