专利名称:编码具耐盐特性多肽的dna序列、耐盐多肽sing－22及表达载体的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程领域，具体涉及编码具耐盐特性的多肽的DNA序列、其表达多肽及表达载体。
背景技术：
干旱、盐渍、土壤沙化是影响农业生产与生态环境的重要因素。干旱、土壤沙化以及频繁发生的扬沙天气，严重破坏了人类赖以生存的生态环境。在人口不断增加、耕地面积减少和淡水资源不足，以及生态环境恶化的严重压力下，增加粮食产量，改善生态环境，促进可持续发展，已成为科学家、社会和国家政府关心的问题。随着对植物抗旱耐盐机制研究的深入和转基因技术的日趋完善，克隆抗旱耐盐基因，提高抗旱耐盐基因的抗逆性功能，培育抗逆植物新品种，为解决上述诸多问题提供了可能。
干旱和高浓度的盐以及低温胁迫将引起细胞脱水，造成高渗胁迫及离子失衡，导致细胞生长缓慢、发育不良，严重将使细胞和生物体死亡。植物在长期进化过程中，已发展出多种机制来适应或抵抗环境胁迫和失水反应。迄今为止，科学家们已获得了一些可表达耐盐、耐旱蛋白质的基因，如甜菜碱醛脱氢酶基因(陈受宜等人，中国专利公开号CN1221034A)，大麦HVA基因(Xu De-ping等，Plant Physiol，1996，110249-257)，Na+/H+反向转运蛋白基因GhNHX(郑成超，中国发明专利公开号CN1425675A)，1-磷酸甘露糖醇脱氢酶(Tarczynski，Science，1993，259508-510)，Δ′-二氢吡咯-5-羧酸还原酶(D5CR)(Kishol，P.B.K，PlantPhysical，1995，1081387-1394)等。目前人们获得的抗旱耐盐基因数目不多，这使得实施抗逆遗传育种工程受到了限制。
为了更好地提高转基因植物的抗旱耐盐能力，人们正努力获得更多的耐旱耐盐基因，特别是那些起重要作用的关键基因。然而，获得关键的耐旱耐盐基因并不是很容易的事情，需要大量的实验工作做基础。因此，研究植物耐旱耐盐基因结构和功能，不仅可揭示植物耐旱耐盐的机制，也可以利用这些基因序列中起耐旱耐盐的功能区序列，为进一步实施抗逆遗传育种提供基因资源。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种编码具耐盐特性的多肽的DNA序列及其表达的具耐盐特性的多肽。
本发明的第二个目的在于提供含有本发明的编码具耐盐特性多肽的DNA序列的表达载体。
本发明的第三个目的在于把本发明的编码具耐盐特性多肽的DNA序列应用于培育耐盐、耐旱、耐低温植物新品种。
本发明的目的是这样实现的本发明提供的DNA序列具有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列或可在严谨条件下与SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列具体如下GCCACGGACA ACAACAACAA CAAAACCGGT TCCAAGGTCG GAGAGTACGC AGATTACGCT 60TCTCAGAAGG CCAAGGAAAC AAAAGATGCA ACGATGGAAA AAGCTGGAGA GTACACGGAT 120
TATGCTTCGC AGAAAGCGAA GGAAGCGAAG AAGACGACCA TGGAGAAGGG TGGAGAATAC 180AAGGATTACT CTGCGGAGAA AGCTAAGGAG AGAAAAGATG CTACTGTGAA TAAGATGGGA 240GAGTATAAGG ACTATGCTGC GGAGAAAGCC AAAGAGGGGA AAGATGCTAC TGTGAATAAA 300ATGGGAGAGT ATAAGGACTA TGCTGCGGAG AAAACGAAAG AGGGGAAAGA TGCCACTGTG 360AATAAGATGG GAGAGTATAA GGATTACACT GCGGAGAAGG CGAAAGAGGG GAAAGATACG 420ACGTTGGGG 429序列表中SEQ ID NO.1所述的DNA序列来源于大豆GmPM2基因(GenBank NoM80664)阅读框架的部分序列，其长度为429bp，本申请人将该DNA片段命名为SING-22。本发明人推测DNA序列SING-22编码的蛋白质产物SING-22可形成亲水的α-螺旋结构。为了制备该DNA片段，本发明人根据该DNA序列设计特异性引物，用PCR方法扩增出该片段。
本发明提供的具耐盐特性的多肽SING-22由DNA序列SING-22编码，多肽SING-22具有序列表中SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列，具体如下Ala Thr Asp Asn Asn Asn Asn Lys Thr Gly Ser Lys Val Gly Glu Tyr1 5 10 15Ala Asp Tyr Ala Ser Gln Lys Ala Lys Glu Thr Lys Asp Ala Thr Met20 25 30Glu Lys Ala Gly Glu Tyr Thr Asp Tyr Ala Ser Gln Lys Ala Lys Glu35 40 45Ala Lys Lys Thr Thr Met Glu Lys Gly Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ser50 55 60Ala Glu Lys Ala Lys Glu Arg Lys Asp Ala Thr Val Asn Lys Met Gly65 70 75 80Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Lys Ala Lys Glu Gly Lys Asp Ala85 90 95Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Lys Thr100 105 110Lys Glu Gly Lys Asp Ala Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys Asp115 120 125
Tyr Thr Ala Glu Lys Ala Lys Glu Gly Lys Asp Thr Thr Leu Gly130 135 140多肽SING-22具有17.0KD的分子量。
本发明提供了含有DNA序列SING-22或可在严谨条件下与DNA序列SING-22杂交的核苷酸序列的重组载体。用PCR方法扩增本发明的DNA序列时，可在DNA序列的5’端和3’端加上可连接到载体上的限制性酶切位点，例如，在5’端可加有EcoRI位点，在3’端可加有HindIII位点。为了构建本发明的重组载体，本发明人把扩增出的DNA片段回收后，酶切，连接至表达载体，即获得含DNA序列SING-22或可在严谨条件下与DNA序列SING-22杂交的核苷酸序列的重组载体，例如本发明实施例所述的重组质粒pET28a∷SING-22。
把获得的重组载体转化宿主，如大肠杆菌TOP10，获得转化子。从转化子中提取重组载体进行PCR反应和酶切分析，将重组载体再转化宿主，例如大肠杆菌BL21 STAR，获得转化子，例如实施例中所述的工程菌BL21/pET28a∷SING-22。
将扩繁后的工程菌BL21/pET28a∷SING-22进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导，诱导产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。经考马斯亮兰染色后，电泳板上出现一条特异的蛋白质条带。将此蛋白条带切下、酶解后用三氟乙酸洗脱。洗脱液经液质联用-电喷雾质谱(安捷伦公司)鉴定，证明此蛋白条带确为多肽SING-22。
通过本发明人的实验证明，本发明提供的多肽SING-22具有亲水性、热稳定性和耐盐特性。
本发明提供的DNA序列SING-22或可在严谨条件下与DNA序列SING-22杂交的核苷酸序列可应用于培育耐盐、耐旱、耐低温植物新品种设计一对分别带有翻译起始位点ATG和终止密码子TGA的特异性引物，从工程菌pET28a∷SING-22中扩增出SING-22基因。将其连接至植物表达载体中。将带有SING-22基因的表达载体转化植物组织或细胞。从转化后的植株叶片中提取基因组DNA，进行SING-22基因的PCR鉴定。将带有SING-22基因的转基因植株栽入含盐培养基中培养。培养15-25天后可以看出，转基因植株的生长状态明显好于不含SING-22基因的对照植株。此结果表明转基因植株的耐盐性优于后者。
本发明的耐盐DNA序列及其耐盐基因是从大豆未成熟种子中克隆，其编码的产物应属于储藏蛋白质部分，因此，本发明的DNA序列及相应的基因，不涉及对环境、生态和食品的安全性问题。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是本发明实施例二中重组质粒pET28a∷SING-22的构建流程图。
具体实施方式
实施例一编码多肽SING-22的DNA序列SING-22的制备。
1.大豆未成熟种子cDNA的制备实验所用大豆种子取自吉林省白城市农业科学研究所。
利用Promega公司的(RNAgents)RNA提取试剂盒(Total RNAIsolation System)，按照试剂盒的说明书操作，提取大豆未成熟种子的mRNA。以提取的mRNA为模板，寡核苷酸(olig)dT为引物，利用反转录试剂盒(购自Takara公司)，进行反转录(RT)反应，获得大豆未成熟种子cDNA。
反转录反应体系为10×RNA PCR缓冲液 2μlMgCl2(25mM) 4μldNTP混合物(各10mM) 2μlAMV反转录酶XL(5U/μl) 1μlRNase抑制剂(40U/μl) 0.5μl寡核苷酸dT(2.5μM) 1μl大豆未成熟种子mRNA 1μldH2O 8.5μl总共 20μl反转录(RT-PCR)反应进行的条件是将装有上述反应体系的离心管置于PCR仪内，采用以下反应条件进行反转录反应即30℃，10分钟；45～60℃，20分钟 95℃，5分钟。即得到大豆未成熟种子cDNA。
2.DNA序列SING-22的制备根据DNA序列SING-22(429bp)设计一对特异性的引物，引物序列见序列表中SEQ ID NO3和SEQ ID NO4，具体如下上游引物CACCGAATTCGCCACGGACAACAACAACAAC，下游引物GTCCAAGCTTCCCCAACGTCGTATCTTT，上述引物序列的5’端含EcoRI酶切位点，3’端含HindIII的酶切位点。将上一步反转录制得的大豆未成熟种子cDNA作PCR反应的模板，采用上述特异性引物序列，经PCR反应，扩增出DNA序列SING-22，该PCR反应体系如下10×Ex Taq缓冲液(加Mg2+) 10μlTaKaRa Ex Taq酶(5U/μl) 0.5μl上游特异性PCR引物(20μM) 1μl下游特异性PCR引物(20μM) 1μl大豆未成熟种子cDNA 20μldH2O 67.5μl总体积 100μl该PCR反应条件如下将装有上述反应体系的离心管置于PCR仪内，采用以下反应条件进行30个循环94℃，30秒；45～55℃，30秒；72℃，1分钟。即得到了DNA片段SING-22。
实施例二DNA序列SING-22的表达载体的构建把实施例一扩增出的DNA片段SING-22经回收后，用EcoRI和HindIII双酶切，连接至经相同酶切处理的质粒pET28a(购自Novagen公司)，获得重组质粒pET28a∷SING-22，构建过程如图1所示。将重组质粒pET28a∷SING-22转化大肠杆菌TOP10(购自Novagen公司)，获得大肠杆菌转化子TOP/pET28a∷SING-22。从大肠杆菌转化子TOP/pET28a∷SING-22中提取重组质粒，将重组质粒转化大肠杆菌BL21STAR菌株(购自Novagen公司)，得到大肠杆菌转化子，将此工程菌命名为BL21/pET28a∷SING-22。
实施例三大肠杆菌转化子BL21/pET28a∷SING-22中SING-22多肽的表达及鉴定。
1.大肠杆菌转化子BL21/pET28a∷SING-22中SING-22多肽的表达及质谱鉴定。
(1)大肠杆菌转化子BL21/pET28a∷SING-22中SING-22多肽的表达及电泳分析。
挑取工程菌BL21/pET28a∷SING-22的单克隆，接种至含50ug/ml卡那的LB培养基中，培养10-15h后，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达，4h后，离心收集菌体。菌体经沸水煮5min后离心，取上清液进行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳。结果显示，与对照菌相比，工程菌BL21/pET28a∷SING-22在20～22kD处有一条较浓的特异条带，此蛋白条带与预期的多肽SING-22的分子量大小接近。
(2)大肠杆菌转化子BL21/pET28a∷SING-22中多肽SING-22的质谱分析。
从SDS-PAGE电泳板上切取该特异的蛋白条带。将蛋白进行胰蛋白酶消化，再利用三氟乙酸(TFA)将蛋白质从凝胶中洗脱出来。洗脱液经液质联用-电喷雾质谱(安捷伦)鉴定，结果测得的肽段序列与推测的耐盐多肽SING-22的序列一致，表明工程菌BL21/pET28a∷SING-22可表达多肽SING-22。
2.多肽SING-22的亲水性和热稳定性分析。
将大肠杆菌转化子BL21/pET28a∷SING-22裂解后离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳。结果显示上清液中存在SING-22多肽，表明工程菌中SING-22多肽以水溶性的形式存在。
大肠杆菌转化子BL21/pET28a∷SING-22热稳定蛋白的提取方法是菌液经85℃热处理10min后，以15000rpm离心10min，取上清液进行SDS-PAGE电泳。电泳结果显示，几乎所有的大肠杆菌蛋白条带均消失，而工程菌BL21/pET28a∷SING-22经IPTG诱导表达的特异性SING-22条带仍明显存在，表明多肽SING-22具有良好的热稳定性。
实施例四可表达多肽SING-22的大肠杆菌转化子的耐盐功能分析。
我们将pET28a载体转化大肠杆菌BL21，获得工程菌(菌株BL21/pET28a。为确定SING-22片段的抗逆活性，我们以上述工程菌(菌株BL21/pET28a)作为对照组，以含DNA序列SING-22的工程菌(菌株BL21/pET28a∷SING-22)作为实验组。采用平板计数法，通过观察上述两种菌株在高盐固体培养基上的生长状况，研究含SING-22基因的菌株对高盐的耐受能力。
具体做法是分别将异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4h的菌液作为细菌原液，并依次做梯度稀释，并将其涂至LB固体平板、以及含有700mM NaCl和500mM KCl的高盐平板上，37℃倒置培养2～3天后，统计平板上生长的菌落数目。
统计结果显示与对照组(菌株BL21/pET28a)相比较，含DNA序列SING-22的实验菌(菌株BL21/pET28a∷SING-22)在700mMNaCl平板培养基上的存活率比前者高1.76倍，在500mMKCl平板培养基上的存活率比前者高1.66倍。由此可见，由SING-22基因编码的多肽SING-22对大肠杆菌的繁殖未造成不良影响，相反，多肽SING-22的表达赋予重组子菌株(BL21/pET28a∷SING-22)以高耐盐特性。
实施例五含SING-22基因的植物表达载体的构建。
在DNA序列SING-22的5’端设计带有翻译起始位点ATG及BamHI酶切位点的引物，3’端设计带有终止密码子TGA及SacI酶切位点的引物，以pET28a∷SING-22质粒为模板进行扩增。引物序列见序列表中SEQ ID NO5和SEQ ID NO6，具体如下上游引物CTGTGGATCCATGGCCACGGACAACAACA下游引物CATCGAGCTCACTAGTGCCCCAACGTCGT扩增产物经BamHI和SacI双酶切后，被连接至经相同酶切处理的植物双元表达载体pBI121，获得含有SING-22基因的pBI121∷SING-22质粒。将pBI121∷SING-22质粒转化至农杆菌LBA4404(购自CAMBIA公司)中，获得含SING-22基因表达载体的农杆菌LBA4404/pBI121∷SING-22。
实施例六含SING-22基因表达载体的农杆菌LBA4404/pBI121∷SING-22向烟草植株的转化。
将无菌的烟草叶盘放入上述农杆菌(LBA4404/pBI121∷SING-22)菌液中侵染。暗培养3天后，将侵染后的烟草叶盘转移至含有卡那霉素和头孢霉素的分化培养基中。培养20天，在烟草叶盘的边缘分化出具有卡那霉素抗性的幼芽。此时即得到待鉴定的转SING-22基因的烟草幼苗。
实施例七SING-22基因在转基因植物中的分子生物学鉴定。
从上述幼苗叶片提取烟草叶片基因组DNA。以此为模板，分别以SING-22基因和卡那霉素基因的引物进行PCR反应。电泳检测，扩增产物以出现两条特异DNA条带，分别为SING-22基因和卡那霉素基因，为双阳性反应。由此证明目的基因SING-22已经整合到烟草植株的基因组中。
实施例八转SING-22基因植物的耐盐功能分析。
我们将pBI121载体转化农杆菌LBA4404，获得工程菌(菌株LBA4404/pBI121)。利用此工程菌侵染烟草叶盘，获得的抗卡那霉素的烟草植株作为耐盐功能鉴定的对照植株。将经过DNA水平鉴定的、带有SING-22基因的烟草植株作为实验组。将对照组和实验组烟草幼苗转移至含有1.5％NaCl的培养基中。
培养15～25天后，比较二者在含盐培养基中植株的生长状况。结果表明，这时对照组植株的叶片变黄，与其相比，转基因烟草叶片颜色仍呈深绿色，叶片较饱满。可见，转SING-22基因烟草对高盐的耐受性明显高于不含外源基因的对照组。
序列表<110>深圳大学<120>编码具耐盐特性多肽的DNA序列、耐盐多肽SING-22及表达载体<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>429<212>DNA<213>大豆(Glycine Max.L)<400>1gccacggaca acaacaacaa caaaaccggt tccaaggtcg gagagtacgc agattacgct 60tctcagaagg ccaaggaaac aaaagatgca acgatggaaa aagctggaga gtacacggat 120tatgcttcgc agaaagcgaa ggaagcgaag aagacgacca tggagaaggg tggagaatac 180aaggattact ctgcggagaa agctaaggag agaaaagatg ctactgtgaa taagatggga 240gagtataagg actatgctgc ggagaaagcc aaagagggga aagatgctac tgtgaataaa 300atgggagagt ataaggacta tgctgcggag aaaacgaaag aggggaaaga tgccactgtg 360aataagatgg gagagtataa ggattacact gcggagaagg cgaaagaggg gaaagatacg 420acgt tgggg 429<210>2<211>143<212>PRT<213>大豆(Glycine Max.L)<400>2Ala Thr Asp Asn Asn Asn Asn Lys Thr Gly Ser Lys Val Gly Glu Tyr1 5 10 15Ala Asp Tyr Ala Ser Gln Lys Ala Lys Glu Thr Lys Asp Ala Thr Met20 25 30Glu Lys Ala Gly Glu Tyr Thr Asp Tyr Ala Ser Gln Lys Ala Lys Glu35 40 45Ala Lys Lys Thr Thr Met Glu Lys Gly Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ser50 55 60Ala Glu Lys Ala Lys Glu Arg Lys Asp Ala Thr Val Asn Lys Met Gly65 70 75 80Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Lys Ala Lys Glu Gly Lys Asp Ala85 90 95Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Lys Thr100 105 110Lys Glu Gly Lys Asp Ala Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys Asp115 120 125
Tyr Thr Ala Glu Lys Ala Lys Glu Gly Lys Asp Thr Thr Leu Gly130 135 140<210>3<211>31<212>DNA<213>大豆(Glycine Max.L)<400>3caccgaattc gccacggaca acaacaacaa c 31<210>4<211>28<212>DNA<213>大豆(Glycine Max.L)<400>4gtccaagctt ccccaacgtc gtatcttt 28<210>5<211>29<212>DNA<213>大豆(Glycine Max.L)<400>5ctgtggatcc atggccacgg acaacaaca 29<210>6<211>29<212>DNA<213>大豆(Glycine Max.L)<400>6catcgagctc actagtgccc caacgtcgt 29
权利要求
1.一种DNA序列，具有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列或可在严谨条件下与SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
2.如权利要求
1所述的DNA序列在培育耐盐、耐旱、耐低温植物新品种中的应用。
3.一种具耐盐特性的多肽SING-22，具有序列表中SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。
4.一种重组载体，含有权利要求
1所述的任何一种DNA序列。
5.根据权利要求
4所述的重组载体，为重组质粒。
专利摘要
本发明涉及编码具耐盐特性多肽的DNA序列、耐盐多肽SING－22及表达载体，本发明提供的DNA序列具有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列或可在严谨条件下与SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，本发明提供的耐盐多肽SING－22具有序列表中SEQID NO.2所述的氨基酸序列，分子量为17.0KD，本发明提供的重组载体含有SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列或可在严谨条件下与SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。本发明提供的多肽SING－22具有亲水性、热稳定性和耐盐特性，本发明提供的DNA序列可应用于培育抗逆植物新品种。
文档编号C12N15/29GKCN1603410SQ200410051755
公开日2005年4月6日 申请日期2004年9月30日
发明者郑易之 申请人:深圳大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan