专利名称:一种利用甘油生产氨基酸的方法
技术领域：
本发明涉及能够同时利用甘油作为碳源生产氨基酸的微生物及该微生物的制备方法，以及利用该微生物生产氨基酸的方法。
技术背景
近来，为了解决由于包括石油在内的自然资源消耗増加引起的高油价和自然资源利用引起的环境污染的问题，利用自然界的可再生材料开发替代能源倍受瞩目。其中，通过发酵获得こ醇(生物こ醇)和从来自植物的油料获得生物柴油，被认为是一种替代能源。
生物柴油指的是脂肪酸甲酯或脂肪酸こ酷，它是在催化剂存在下，以来自植物的 油料为底物，与こ醇进行酯化作用合成的。在这个过程中，不可避免的会产生总重量10%的甘油副产物。
甘油(C3H8O3)比葡萄糖(C6H12O6)在化学性质上更具还原性，因此在微生物代谢中可以提供更高的还原力。通常，由于在发酵过程中产生的很多物质在其代谢过程中都需要还原力，因此用甘油作为底物可以显著提高产量和活性。尽管甘油具有这个性质，但是，用甘油生产伊氏素(Reut erin) (Talarico 等，AntimicroAgentsChemother.，32 :1854-1858(1988))，2，3_ 丁 ニ 醇(Biebl 等，Appl Microbiol. Biotechnol. 50 24-29(1998))，1，3-丙 ニ 醇(Menzel 等，Enzyme Microb. Technol. , 20 :82-86 (1997)),玻拍酸(Korean Patent No. 0313134),衣康酸(US Patent No. 5，457，040), 3-轻基丙醒(Doleyres 等，Appl. Micribiol. Biotechnol. 68 (4) :467-474(2005))和丙酸(Himmi 等，Appl. Microbiol. Biotechnol. ,53 :435-440(2000))的研究仍然有限。其中原因之ー便是与传统发酵エ业实际应用的其他碳源相比，甘油比较昂贵。与此相反，通过发酵生产甘油的方法已经有人进行研究(Wang等，Biotechnol. Adv.，19 (3) :201-223 (2001))。但是，随着生物柴油产量的巨大增长，甘油产品也増加了，从而使甘油价格下降。基于以上事实，有报道利用包括甘油在内的生物柴油副产物生产1，3_丙ニ醇(Gonzalez-Pajuelo等，J. Ind.Microbiol. Biotechnol. 31 :442-446, (2004))和氢，以及こ醇(Ito 等，J. Biosci. Bioeng.，100(3) :260-265(2005))。但是利用包括甘油在内的生物柴油产品的副产物来生产氨基酸和代表性发酵产品为主要代谢产物的方法还未见报道。
直到现在，甘油主要从肥皂，脂肪酸，蜡，表面活性剂或其类似物的生产过程取得。但是，如上所述，随着生物柴油产品的增长，甘油产品作为其副产物也随之增长，因此如何有效处理包括甘油在内的副产物的问题就会出现。另外，精炼甘油的价格预期会急剧下降。因此，利用甘油通过发酵生产有用化学材料将会带来许多附加效应。
大肠杆菌(Escherichiacoli)和肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)的甘油代谢已经比较清楚。在大肠杆菌中，水甘油通道蛋白GlpF不需要消耗能量，从环境中摄入甘油(Heller 等，J. Bacteriol. 144 =274-278, (1980))。甘油被甘油激酶(GlpK)转变成3-磷酸甘油，再被3-磷酸甘油脱氢酶转变成磷酸ニ轻丙酮(dihydroxyacetonephosphate,DHAP)，接着再被丙糖磷酸异构酶(TpiA)转变为3-磷酸甘油醛(G-3-P)，从而通过糖酵解代谢(Lin EC，Annu. Rev. Microbiol. 30 :535-578, (1976))。在甘油激酶没有活性的情况下，甘油被甘油脱氢酶(Gdh)转变为ニ羟丙酮(DHA)，然后被甘油激酶或ニ羟丙酮激酶转变成磷酸ニ轻丙酮，再接着转变成3-磷酸甘油,从而被代谢掉(Paulsen等,Microbiology, 146 2343-2344, (2000)) 0甘油代谢可以通过不同的途径进行调节。特别是，在甘油和葡萄糖同时存在的情况下，已知野生型大肠杆菌具有ニ阶段生长，葡萄糖优选先于甘油被利用(Lin，Annu. Rev. Microbiol. 30 :535-578, (1976))。
如上所述，当来自生物柴油产品的副产物ー甘油，被有效用作碳源时，可以产生大量附加值。另外，同时用甘油和葡萄糖作为碳源，野生型大肠杆菌具有ニ阶段生长，葡萄糖优先于甘油被利用。因此，当提供含有甘油的复合碳源吋，发酵效率降低。基于此，本发明人进行了甘油微生物利用的延伸研究，从而完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目的是，提供一个高效低成本生产氨基酸的方法，其中氨基酸生产菌株在含有甘油的培养基中培养时，可以同时利用甘油作为碳源。
本发明的另ー个目的是，提供ー个能够同时利用甘油作为碳源生产氨基酸的微生物，及制备该微生物的方法。
优选实施方式
在一个实施例中，本发明提供了ー个利用甘油生产氨基酸的方法，包括在含有甘油的培养基中接种和培养同时利用甘油作为碳源的产氨基酸微生物，以及从培养基中回收上述步骤所产生的氨基酸。
本文所用的短语“同时利用甘油作为碳源生产氨基酸的微生物”指的是具有除了甘油以外还可以利用其他碳源来生产氨基酸能力的微生物，并且同时利用甘油作为碳源生产氨基酸。除甘油之外的其他碳源指的是相关技术中已知的碳源，如象蔗糖、果糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、淀粉和纤维素这样的碳水化合物，象豆油，葵花籽油、蓖麻油和椰子油的脂肪，象棕榈酸、硬脂酸、亚油酸这样的脂肪酸，优选葡萄糖、果糖和乳糖，最好是葡萄糖。与微生物优先利用上述碳源再利用甘油相比，本发明的微生物同时利用上述碳源和甘油作为碳源生产氨基酸，因此，具有较高的效率来生产最終的氨基酸。特别是，在同时提供葡萄糖和甘油作为碳源的情况下，会出现ニ阶段生长，其中野生型大肠杆菌专门利用葡萄糖，并将其耗尽才利用甘油。因此在提供含有甘油的复合碳源的情况下，发酵效率降低。相反，同时利用甘油作为碳源生产氨基酸的微生物与野生型不同，在同时有葡萄糖和甘油存在的情况下，而不是在葡萄糖和甘油分别存在下，能同时利用葡萄糖和甘油，从而提高发酵效率，生产大量氨基酸。
本方面的微生物在其基因组中优选具有galR基因和/或glpR基因，且其中任意一个或两者都不被激活。已知galR基因表达的蛋白GalR可以抑制编码GalP蛋白的基因表达。GalP是ー个渗透酶，可以转运包括半乳糖和葡萄糖这样的一系列糖进入细胞(MARKGEANAC0P0UL0S AND SANKAR ADHYA, Journal of Bacteriology, Jan. 1997，p. 228-234，Vol. 179, No. I)。已知GlpR基因表达的GlpR蛋白是3-磷酸甘油代谢的调节因子，可以与甘油代谢相关的glpD, glpFK, glpTQ,和glpABC操纵子的操作基因结合,从而使这些基因的转录失活(Larson 等，J. Bio. Chem. 262(33) :15869-15874 ；Larson 等，J. Biol.Chem. 267(9) :6114-6121(1992) ;Zeng 等，J. Bacteriol. 178 (24) :7080_7089，(1996))。本发明人发现可以通过提高GalP蛋白表达或抑制甘油代谢代表性的调节因子glpR来抑制相关的基因，从而提高甘油利用的效率。灭活方法的实例包括以下步骤用紫外线这样的辐射或化学药物诱导突变，从突变子中筛选具有glpR和galR基因失活的菌株，这些现有技术的已知方法都可以使用。另外,灭活方法包括DNA重组技术方法。DNA重组技术可以通过在微生物中引入具有glpR基因和/或galR基因同源序列的核酸序列或含有该序列的载体，从而产生同源重组来进行。另外，引入的核酸序列或载体可以含有显性的选择标记。glpR和/或galR基因已经公开，可以从数据库中得到，如国家生物信息中心(NCBI)和日本DNA数据库。再者，大肠杆菌中的glpR和/或galR基因也已经公开，可以从Blattner等公开的大肠杆菌基因组序列得到(Science277 :1453-1462(1997)。还有，glpR和/或galR基因包括退化或某个密码子沉默突变所产生的等位基因。本案中，术语“灭活”指的是不表达有活性的glpR和/或galR基因，或甘油代谢相关的基因的表达不被抑制，或不表达 有活性的GalP0因此，如果glpR基因失活，甘油代谢相关基因的表达或其重组增加，且如果galR基因失活，则GalP表达增加。
本发明中，微生物指的是能够产生氨基酸的微生物，且该微生物可以同时利用甘油，最好在其基因组中含有glpR和/或galR基因，同时这两个基因中的任意一个或两者都被失活的微生物不局限于原核生物或真核生物。微生物的实例包括属于以下属的微生物埃希氏菌属，肠杆菌属，短杆菌属，棒杆菌属，克雷伯氏菌属，朽1檬酸杆菌属，链霉菌属，芽孢杆菌属，乳杆菌属，假单胞菌属，酵母菌属和曲霉属，优选属于肠杆菌科的微生物，更优好是属于埃希氏菌属的微生物，更更优选大肠杆菌，最优选选大肠杆菌FTR2537和FTR2533(KCCM-10540和KCCM-10541)(Korean Patent Publication No.2005-0079344)，大肠杆菌CJM002 (KCCM-10568)，大肠杆菌CJIT6007 (KCCM-10755P)和从中衍生的大肠杆菌。该微生物可以同时利用甘油作为碳源。因此，其在提供甘油而不是在不提供甘油作为碳源的情况下，具有良好的生产氨基酸的能力。
在微生物中，高产L-苏氨酸的菌株大肠杆菌FTR2533通过失活galR基因由大肠杆菌 FTR7624 (Korean Patent Publication No. 2005-0079344)得到，大肠杆菌 FTR7624 由KCCM-10236衍生得到。通过失活大肠杆菌KCCM-10236基因组中的tyrR基因，菌株大肠杆菌FTR7624的L-苏氨酸产量增加。菌株大肠杆菌KCCM-10236是能够高产L-苏氨酸的菌株，它具有抗L-苏氨类似物，异亮氨酸泄露代谢缺陷型，耐L-赖氨酸类似物，和耐a -氨基丁酸的性质，且引入了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PPC)和与苏氨酸合成途径相关的基因(thrA :天冬氨酸激酶I-同型丝氨酸脱氢酶，thrB :同型丝氨酸激酶，thrC :苏氨酸合成酶)(Korean Patent Publication No. 2005-0079344)。另外，高产 L-甲硫氨酸菌株大肠杆菌CJM002 (KCCM-10568)衍生自专利菌株大肠杆菌FTR2533，通过NTG突变去除了专利菌株中的L-甲硫氨酸营养缺陷。大肠杆菌CJIT6007是ー个具有glpR和galR基因双失活的菌株，通过PCR技术制备了含有与glpR基因同源的核酸序列的缺失突变基因盒，并将其引入菌株大肠杆菌FTR2533。
本发明的利用微生物生产氨基酸的方法中，微生物的培养方法可以根据现有技术已知的合适培养基和培养条件来进行。现有技术的技术人员很容易根据所选择的菌株来修改培养方法。培养方法可以是批次培养法，连续培养法和批次补料培养法，但不限于此。例如，在 James M. Lee 的《生物化学工程》(Prentice-Hall International Editions, pp138-176)中不同的培养方法已经被公开。
培养方法中使用的培养基应该优选满足特殊菌株的需要。本发明中所用的培养基部分或全部含有甘油作为碳源，而且可以含有一定量的其他碳源。现有技术人员熟知的碳源，比如象蔗糖、果糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、淀粉和纤维素这样的碳水化合物，象豆油，葵花籽油、蓖麻油和椰子油的脂肪，已经象棕榈酸、硬脂酸、亚油酸这样的脂肪酸。每升培养基中优选含有l_300g甘油。培养基中，甘油含量为总碳源质量的10%到100%，且如果含量超过这个范围，氨基酸的产量就会減少。除碳源之外，能被利用的氮源包括有机氮源如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浸泡液和大豆粉，或无机氮源如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵，而且他们可以単独使用或以任意组合使用。培养基中可以含有磷酸ニ氢钾，磷酸氢ニ钾和相应的钠盐作为磷源。另外培养也含有金属盐如硫酸镁和硫酸鉄。另外，培养基中也含有氨基酸、维生素和适当的前体物。培养基或前体物可以在批次培养或连续培养中加入。化合物如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸可以在培养过程中加入来调节培养基的PH值。还有，在培养过程中，消泡剂如脂肪酸聚こニ醇酯用于抑制泡沫形成。再者，为了维持培养基的好氧条件，可以在培养基中通入氧气或含有氧气的气体。 为了维持厌氧或微厌氧条件，可以通入氮气、氢气或ニ氧化碳，不通入空气。培养基的温度通常在20-45°C，最好在25-40°C。培养周期是连续产生氨基酸的时期，最好是10-160个小时。
为了回收培养基中的氨基酸，可以使用现有技术已知的方法，也可以应用离子交换色谱或类似方法，但不限于此。
根据本方法生产的氨基酸实例包括エ业用的天冬氨酸、苏氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、精氨酸和组氨酸，但不限于此，优选是天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸，最好苏氨酸和甲硫氨酸。
在一个实施例中，本发明涉及同时利用甘油作为碳源生产氨基酸的微生物。在一个特殊实施例中，本发明涉及同时利用甘油作为碳源生产氨基酸的微生物，其中该微生物基因组中具有失活的glpR和/或galR基因。
本发明中的微生物是能够生产氨基酸，同时利用甘油的微生物；该微生物优选是在基因组中具有glpR和/或galR基因的微生物，且该微生物中的这两个基因中的任意一个或两者都失活。该微生物不限于原核生物或真核微生物。该微生物的例子包括属于埃希氏菌属，肠杆菌属，短杆菌属，棒杆菌属，克雷伯氏菌属，朽1檬酸杆菌属，链霉菌属，芽孢杆菌属，乳杆菌属，假单胞菌属，酵母菌属和曲霉属，优选属于肠杆菌科的微生物，更优选属于埃希氏菌属的微生物，更更优选大肠杆菌，最优选大肠杆菌CJIT6007(保藏编号KCCM-10755P)。
在另ー个实施例中，本发明涉及制备同时利用甘油作为碳源产氨基酸微生物的方法，特别是，同时利用甘油产氨基酸，且具有失活的galR和/或glpR基因的微生物。
在ー个特殊的实施例中，本发明涉及制备有效利用甘油的微生物的方法，包括以下步骤制备失活的glpR基因或其DNA片段，将该基因或其DNA片段导入能够生产氨基酸的微生物，将glpR基因在其基因组上进行重组，筛选glpR基因失活的微生物。
在本发明的方法中，该微生物优选属于肠杆菌科，且该微生物更优选大肠杆菌，最优选大肠杆菌CJIT6007 (保藏编号KCCM-10577P)。
本发明的方法中 ，失活的glpR基因或其DNA片段指的是多核苷酸序列，其中该多核苷酸序列含有与宿主glpR基因同源的核苷酸序列，且在该序列中引入如缺失，替换和颠换的突变，以使其不表达具有活性的glpR基因产物。在宿主中引入失活的glpR基因或其片段的方法可以通过转化，结合，转导或电穿孔等方法实现，但不限于此。
在通过转化向宿主细胞引入失活glpR基因或其片段的情况下，可以通过将多核苷酸序列与该菌株的培养基混合的方法来进行。这时，该菌株自发接受DNA，从而被转化。但是，最好还是用适当的方法将该菌株制成感受态，以便于DNA进入。失活的glpR基因或其片段在基因组DNA中引入一个外源DNA片段，用失活的形式替代这个序列的野生型。在一个特别的实施例中，失活的多核苷酸序列包含ー个含有靶点DNA5'和3'-末端区域部分的尾部。为了方便，失活的多核苷酸序列可以含有ー个选择标记，如抗生素抗性基因。在目标DNA被抗生素抗性基因失活的情况下，转化子的筛选可以在含有合适抗生素的琼脂平板上进行。通过转化将失活的多核苷酸序列引入宿主细胞，通过将野生型基因组序列与基因组DNA的尾巴序列同源重组，将其失活。
在另ー个特别的实施例中，本发明涉及制备微生物的方法，其中用相同的方法使该微生物的galR和glpR基因中的任意一个或两者先后或同时失活，方法如上所述。
在本发明方法的ー个例子中，所制备的微生物中，将调节甘油代谢相关基因的glpR基因失活，以使其通过发酵利用包括甘油在内的不同碳源，可以有效的产生氨基酸。制备该微生物的方法包含以下步骤
首先，通过PCR技术，以质粒pKD3为模板制备含有与glpR基因同源核苷酸序列的缺失基因盒。然后，用上述PCR得到的DNA片段转化具有重组酶基因的质粒pKD46的大肠杆菌。转化的大肠杆菌在含有抗生素标记的琼脂平板上铺板，筛选具有抗生素抗性的菌株，从而分离具有失活glpR基因的菌株。
在本发明的一个特别实施例中，本发明人通过PCR技术制备了含有与glpR基因同源的核苷酸序列的缺失基因盒，接着将其引入高产苏氨酸菌株大肠杆菌FTR2533。因此，得到ー个新的菌株，为了比父本菌株更高效的利用甘油，将该菌株的野生型glpR基因失活，从而可以高产量的产生L-苏氨酸。新菌株被命名为大肠杆菌CJIT6007，根据布达佩斯条约，于2006年6月2日保存在韩国微生物保藏中心(保藏编号KCCM-10755P)。
下文中，将详细介绍本发明的实施例。但是这些实施例只是为了证明发明意图，且本发明不限于这些实施例。
具体实施方式
实施例I :产苏氨酸菌株同时利用甘油的摇瓶测试(葡萄糖和甘油)
大肠杆菌野生型菌株K12和FTR2533分别接种在含有MMYE的平板上，33°C培养12小吋。然后用接种环将这两个菌株接种于MMYE液体培养基，33°C，200rpm，培养6小吋。MMYE培养基成份如下表I.所示
表I. MMYE培养基成份[0036]
权利要求
1.ー种利用甘油和葡萄糖生产氨基酸的方法，包括以下步骤在含有甘油和葡萄糖的培养基中接种并培养能同时利用甘油和葡萄糖作为碳源的产氨基酸微生物；和 从上述步骤的培养基中回收氨基酸， 其中所述的微生物是基因组中具有失活的galR基因和glpR基因的大肠杆菌； 并且所产氨基酸为苏氨酸。
2.根据权利要求
I所述的方法，其中I升培养基中所含的甘油含量为lg_300g。
3.根据权利要求
I所述的方法，其中所述的甘油含量为培养基中碳源总重量的10-100% (重量)。
4.根据权利要求
I所述的方法，其中所述大肠杆菌为CJIT6007，其保藏编号为KCCM-10755P。
5.ー种能同时利用甘油和葡萄糖作为碳源产氨基酸微生物，所述的微生物是基因组中具有失活的galR基因和glpR基因的大肠杆菌，并且所产氨基酸为苏氨酸。
6.根据权利要求
5所述的微生物，其中所述大肠杆菌为大肠杆菌是CJIT6007，其保藏编号为 KCCM-10755P。
专利摘要
本发明涉及能同时利用甘油作为碳源的产氨基酸微生物，制备该微生物的方法，以及用该微生物生产氨基酸的方法。根据本发明，利用生物柴油产品的副产物甘油高效生产氨基酸，从而替代传统发酵材料如葡萄糖的一种廉价材料。
文档编号C12N1/20GKCN101501204 B发布类型授权 专利申请号CN 200780024305
公开日2012年10月17日 申请日期2007年6月26日
发明者张真淑, 朱哉映, 朴英薰, 申容旭, 裵贤爱, 赵光命 申请人:Cj第一制糖株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (2),