用于核酸扩增的基质的制作方法

专利名称:用于核酸扩增的基质的制作方法
用于核酸扩增的基质
发明领域
本发明涉及用于核酸扩增包含多孔基质的方法、基质、试剂盒和 系统，所述多孔基质具有使得生物分子能够扩散的孔。
发明背景
核酸的扩增是基于核酸分析的几乎所有诊断或分析测试的基本部 分。因为目的核酸通常仅以非常小的浓度存在，所以这些测试包含至
少一个扩增步骤，以产生可检测量的核酸分子。需要选择性结合2种 寡核苷酸引物的众所周知的测定是在US 4,683,195中描述的聚合酶链 反应(PCR)。这种方法允许在脱氧核普酸三磷酸的存在下在几个循环 中经由耐热的聚合酶将特定核酸区域选择性扩增至可检测水平。
因为通量以及成本不仅对于工业而且对于科学应用都具有重要 性，所以存在关于基于PCR的测试的并行化和小型化的高度需求。用 于PCR扩增的并行化的众所周知方法是多孔板的使用，所述多孔板可 以通过使用加热块(thermal block)整体暴露于温度循环。此处，可能 直接在多孔板内(例如通过焚光)或通过使用例如凝胶电泳或质谱分 析法外部分析PCR结果。此种多孔板允许平行的几百次反应，每个具 有几^的反应体积。在具有最高达1536个孔的多孔板中用于PCR扩 增的系统从几个公司商购可得。
最近，在固体支持体中具有各仅有50 nl体积的最高达10,000个均 匀分布的孔的特殊支持体是可用的(Brenan等人，Proc. SPIE,第4626 巻，第560-569页)，以平行执行数千不同PCR应用。但是当然，具 有通孔的此种支持体的生产、液体处理、蒸发和邻近孔之间的交叉污 染在此种系统中是苛求的。
Applied Biosystems Inc. ( Foster City， CA/USA )引入微观流体卡， 其使得用户能够在一次性使用的塑料中执行最高达8个样品的PCR反 应，其中每种样品48次不同PCR测定。引物和水解探针进行预合成、 点样到不同孔内且其后进行干燥。对于实验，用户必须将包括样品的 PCR主混合物移液到1个孔内，用封口箔将卡密封且使卡离心，从而
使得PCR混合物可以在PCR反应发生前通过通道系统扩散到不同孔 内。
Fluidigm ( San Francicso , CA/USA )已开发了具有纳米流体 (nanofluidic )芯片用于实时PCR的系统，用于组合48种样品和48 次测定，总共2.304次实验。纳米流体芯片装载样品、引物和FRET探 针组后，仪器配置自动将样品和测定组合成在不连续的lOnl反应室内 的所有可能的配对。
发明概述
考虑到现有技术，本发明涉及用于核酸扩增的方法、基质、试剂 盒和系统，由此所述核酸扩增在多孔基质的孔内发生。
本发明的一个方面是用于核酸扩增的方法，其包括
a)提供进行构造以提供区室的多孔基质，
b )向所述多孔基质中加入包含核酸的样品和扩增混合物，
c)使所述多孔基质暴露于温度循环，
其中所述核酸扩增在所述多孔基质的孔内发生。
在本发明自始至终，核酸扩增概括了本领域技术人员已知的所有 种类的扩增程序，例如US 4,683,195中描述的聚合酶链反应(PCR)。 其他可能的扩增反应是连接酶链反应(LCR， Wu, D. Y.和Wallace, R.B., Genomics 4 ( 1989 ) 560-569和Bamny, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 ( 1991 ) 189-193 );聚合酶连接酶链反应(Barany, PCR Methods and Applic. 1 ( 1991 ) 5-16) ; Gap-LCR (PCT专利公开号WO 90/01069 ); 修复链反应(欧洲专利公开号439 182 A2) ， 3SR ( Kwoh, D.Y.等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 ( 1989) 1173-1177; Guatelli, J.C.等人， Proc. Natl. Acad. Sd. USA 87 ( 1990 ) 1874-1878; PCT专利公开号WO 92/08800 )和NASBA (美国专利号5,130,238 )。此外，存在链置换扩 增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、和Q卩-扩增(关于综述参见 j列^口 Whelen, A.C.禾口 Persing, D. H., Annu. Rev. Microbiol. 50 ( 1996 ) 349-373 ; Abramson ; R.D.和Myers ， T.W. , Current Opinion in Biotechnology 4 ( 1993 ) 41-47)。
作为多孔基质所有材料都可应用于本发明，只要提供足够尺度的 孔，从而使得核酸扩增可以在所述多孔基质的孔内发生。应当指出所
述孔的排列是无关的，并且基质可以具有均匀或随机分布的孔以及具 有均勻或分散尺度的孔。换言之，孔是多孔基质的材料内的空间隙， 所述空间隙可以充满流体且允许分子如核酸和酶扩散。
为了使核酸扩增能够在所述多孔基质的孔内实现，流体可能在基 质及其周围环境之间交换当然是必需的，并且因此，材料必须不仅在 其内部而且在其界面上具有孔。为了核酸扩增在多孔基质的孔内发生， 所述多孔基质必须与所述包含核酸的样品和所述扩增混合物物理接
触。对于随后的PCR扩增，可以优选将多孔基质密封，从而使得避免 与周围环境的交换。
在本发明自始至终，包含核酸的样品概括了在溶液中的所有种类 的核酸。所述样品可以包含一种或多种类型的核酸分子，任选连同其 他生物分子。术语核酸^f既括了 DNA、 RNA或核酸类似物如锁定核酸 (LNA)或其组合。
在本发明自始至终，核酸扩增反应所需的所有试剂由短语扩增混 合物概括。扩增混合物可以包含例如酶、引物和核苷酸，连同合适的 緩沖液、溶剂和去污剂。
除了关于热和化学稳定性的某些要求外，没有其他物理参数限制 材料用于本发明的可应用性。材料可以是有机或无机的、非晶形或晶
状的、固态或塑性的以及弹性或非弹性的。例子是玻璃毛状物(glass fleece)、玻璃纤维、塑料、金属氧化物、硅衍生物、纤维素、尼龙、 聚酯、聚丙烯(PP )、聚乙烯(PE )、聚对苯二甲酸乙二酯 (polyethylenterephthalat) ( PET )、聚丙烯腈(polyacrylmtril) ( PAT )、 聚偏氟乙烯(polyvinylidendifluorid ) ( PVDF )或聚苯乙烯。
由于例如对于PCR扩增必需的温差，材料的热稳定性是需要的。1 个PCR扩增循环包含加热、冷却阶段和恒温阶段，而l个循环开始时 的温度与所述循环结束时的温度相同。随着时间的这些温度变动由短 语温度循环概括，举例说明了所述多孔基质的温度的循环变化。化学 稳定性是必需的，因为大多数核酸扩增反应需要某些试剂如緩沖液或 溶剂，且本发明的多孔基质必须对所述化学药品有抵抗力。
本发明的另一个方面是用于核酸扩增的多孔基质，其包含
a)平行执行许多个别核酸扩增的区室，
b )使得用于核酸扩增的核酸分子和聚合酶能够在所述多孔基质的 孔内扩散的孔，和
c)与所述多孔基质的表面附着的至少一种引物。
多孔基质的表面概括了多孔基质与周围环境的所有界面，换言之 基质的外部和孔的内部。在本发明自始至终，具有至少一种附着的引 物的多孔基质可以与某些另外元件一起获得，例如在脆性材料的情况 下支持多孔基质的工具，或提供与多孔基质受控的流体交流的工具。
本发明的另外一个方面是用于核酸扩增的多孔板，其中所述多孔 板的每个孔包含根据本发明的多孔基质，从而使得核酸扩增在所述多 孔基质的所述孔内发生。
本发明的进一步方面是用于核酸扩增的试剂盒，其包含
a) 根据本发明的多孔基质，和
b) 扩增混合物。
本发明的另外 一 个方面涉及用于核酸扩增的系统，其包含
a) 根据本发明的多孔基质，和
b) 热循环仪。
热循环仪是使用于核酸扩增的所述设备暴露于温度循环的装置。 温度循环对于大多数核酸扩增反应是必需的，且因此，所述热循环仪 以这样的方式改变多孔基质内的温度，从而使得扩增反应在所述多孔 基质的孔内发生。
任选地，所述热循环仪可以具有另外的工具，以分析多孔基质内 的核酸扩增。
附图简述

图1:举例说明多孔基质1的一个实施方案的示意图，所述多孔基 质使用电极3在可应用于PCR扩增的装置中通过电化学进行构建，其 包含在多孔基质的孔内具有核酸4的区室2和封口 5, 6以避免交扰。
图2:具有浸入标记的寡核苷酸中的不同官能化的2种多孔基质的 照片。
图3:使用电极3在多孔基质1上电化学产生亲水/疏水模式的一 个实施方案的示意图(x:疏水部分；U:应用的电位)。 图4:浸入水中的官能化多孔基质的照片。
图5:杂交循环的荧光图像 图6:杂交循环的荧光图像
图7:在标准PCR和在多孔基质的孔内执行的PCR中获得的PCR 产物的凝胶。
发明详述
本发明的一个方面是用于核酸扩增的方法，其包括
a) 提供进行构造以提供区室的多孔基质，
b) 向所述多孔基质中加入包含核酸的样品和扩增混合物，
c) 使所述多孔基质暴露于温度循环， 其中所述核酸扩增在所述多孔基质的孔内发生。 就核酸扩增所需的扩增混合物而言，本发明的方法可以以至少2
种不同方式来执行。本领域技术人员了解酶、引物和核苷酸连同合适 的緩沖液、溶剂和/或去污剂是执行核酸扩增所需的。
因此，在根据本发明的优选方法中，所述扩增混合物包含酶、引 物、核普酸和緩沖液。
对于在多孔基质的孔内发生的核酸扩增，所述多孔基质必须与所 述包含核酸的样品和所述扩增混合物物理接触。这可以例如通过将多 孔基质浸入包含所述含有核酸的样品和所述扩增混合物的溶液内，或 通过将所述包含核酸的样品和所述扩增混合物点样或移液至多孔基质 的限定区域得S 'j确保。，泉样或移液实施方案的优点当然是需要较少量 的样品和试剂，并且超过一种样品可以应用于1个多孔基质。将所述 包含核酸的样品和所述扩增混合物通过几种技术顺次或在一个步骤中 加入所述多孔基质中是可能的，所述技术如移液、喷墨针印刷或微通 道沉积。
在根据本发明的另一个优选方法中，步骤a)中的所述多孔基质与 至少一种附着的引物和/或包含酶、核香酸和緩冲液的所述扩增混合物 一起提供。
在本发明的这个实施方案中，扩增反应所需的引物在加入扩增混 合物之前已存在于多孔基质上。所述引物与多孔基质的表面附着是优 选的。如上所述，多孔基质的表面概括了多孔基质与周围环境的所有 界面，换言之基质的外部和孔的内部。附着的引物是与多孔基质的表面结合的引物。在本发明的范围内 的是本领域技术人员已知的所有种类的键。例子是共价键如硅烷偶联、
酰胺键或环氧化物偶联，配位结合如His标记和螯合剂之间，生物亲和 (bioaffine)结合如生物素/链霉抗生物素蛋白键。可替代地，引物与 多孔基质的结合可以是物理吸着。在这个实施方案中，引物通过例如 将所述引物点样或移液至基质随后蒸发溶剂简单地应用于多孔基质。
在根据本发明的更优选的方法中，所述至少 一 种附着的引物在多 孔基质上合成。
在根据本发明的另 一 个更优选的方法中，所述至少 一 种附着的引 物是点样在多孔基质上的合成引物。
主要存在提供具有至少一种附着的引物的多孔基质的2种不同策 略，即整个引物与基质的结合(芯片外(off-chip)合成)或引物在基 质上的合成(芯片上(on-chip)合成)。
对于芯片外合成，可以将多孔基质浸入包含所述引物的溶液内或 通过例如将所述引物点样或移液至多孔基质的限定区域。如果不仅需 要物理吸着，那么后续偶联依赖于使用的基质材料和引物的结合部分 来达到，并且几种替代方案是本领域技术人员已知的。可能的表面修 饰可以是环氧官能化如环氧硅烷衍生物，或醛官能化，或羟基官能化， 或硫醇(thiole)官能化，或氨基官能化如氨丙基三乙氧基硅烷，或多 功能的氨基涂层(参见例如来自SchottNexterion的商业产品)。为了 将点样的引物共价偶联到表面上，可以使用不同技术，如经由例如UV 介导的交联的光化学偶联，使用合适试剂的湿法化学辅助的偶联，电 化学介导的偶联如氧化还原偶联或经由例如第尔斯-阿尔德 (Diels-Alder )反应的交叉偶联。
在芯片上合成期间，引物在多孔基质上在超过一个步骤中由单个 核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸(本发明自始至终称为核苦酸结构单元) 合成。这个程序的每一步骤在本发明自始至终称为合成循环。
优选地，本发明自始至终引物在多孔基质上的合成或偶联通过电 化学程序来进行。为了实现具有附着的引物的此种多孔基质的电化学 生产，多孔基质和/或核苷酸结构单元必须具有由保护基加以保护的结 合位点，然而这些保护基是电化学不稳定的。因此，电化学生产的每 个合成循环涉及至少一种情况，其中电势应用于多孔基质，使结合位
点的那些保护基电化学脱保护，所述保护基在应用的电位下是电化学 不稳定的，并且位于多孔基质的某些部分上和/或已与多孔基质附着的 某些核苷酸结构单元上。保护基的脱保护可以通过切割整个保护基、 切割保护基的部分、或通过保护基内的构象变化而发生。电化学不稳 定的保护基的电化学脱保护包括经由应用的电位的直接脱保护以及由
护。某些保护基脱保护后，单个核苷酸、寡核普酸或多核苷酸可以与 所述脱保护的结合位点结合。
此外，电极是应用电势必需的，以实现具有附着的引物的此种多 孔基质的电化学生产。优选地，所述电极以电极阵列的形式进行排列， 所述电极阵列包含固体支持体和超过一个个别电极的排列。任何材料 都可以用于这些个别电极，就其具有合适的导电性而言和就其经过某 一电位范围电化学是稳定的而言，即金属性材料或半导体材料。对于 个别电极的固体支持体，可以使用任何材料，就其具有避免个别电极 之间短3各的性质而言。
个别电极的排列这样设计，从而使得每个电极是可选择性寻址的 电极。因此，个别电极的排列设计提供了选择，以通过电势在组中同 时寻址某一数目的电极或独立地寻址每个电极。
所述电极阵列的每个电极限定多孔基质上的某一区域，其中电化 学反应可以由于在所述电极上应用的电位而发生。因此，每个电极对 应于在多孔基质上的个别点，而每个个别点在电化学生产后包含某些 引物，从而导致可以由生产程序限定的引物阵列。
在本发明自始至终，优选的保护基是酸不稳定的保护基，优选地
9- (9-苯基)咕吨基(pixyl)或三苯甲基，最优选地4,4'-二甲氧基三苯 甲基(DMT)或4-单曱氧基三苯甲基(MMT)，或碱不稳定的保护基， 优选地乙酰基丙酰(levulinyl)或曱硅烷基，最优选地叔丁基二甲基曱 硅烷基(TBDMS)或叔丁基二苯基曱硅烷基(TBDPS)。
在根据本发明的更优选的方法中，所述附着的引物在执行所述温 度循环之前与所述多孔基质切割开。
在根据本发明的这个优选方法中，与多孔基质偶联的引物可以在 核酸扩增之前被释放。因此，引物与多孔基质的偶联必须是在某些条 件下不稳定的。引物与多孔基质的切割可以使用电势、照射(例如UV
光)、热或化学处理来进行。用于引物的可能的可切割接头是碱不稳
定的部分，如琥珀酰、草酰或氢化醌接头(Q接头)，或光不稳定的 部分，如2-硝基千基-琥珀酰或藜芦醚-碳酸盐接头，或在还原条件下可 切割的接头，如硫代-琥珀酰接头，或酸不稳定的部分，如三苯曱基衍 生物，例如4,4'-二曱氧基三苯曱基衍生物。
应当指出核酸扩增可以在具有切割的引物以及具有附着的引物的 所述多孔基质的孔内进行。核酸扩增在温度循环期间发生，所述温度 循环包含加热、冷却阶段和恒温阶段，而1个循环开始时的温度与所 述循环结束时的温度相同。在最后的温度循环后， 一定量的扩增的核 酸存在于多孔基质的孔内。取决于用户的需求，主要存在检测或分析 多孔基质内的扩增产物的2种不同程序。
在本发明的另外一个优选实施方案中，所述扩增的核酸通过离心 从所述多孔基质中提取。
使用根据本发明的多孔基质，可能取出扩增产物用于外部分析， 例如利用凝胶电泳、杂交测定或质谱分析法。
如果使用不含区室的无结构的多孔基质，那么整个基质可以置于 离心容器中以提取扩增的核酸。如果使用具有区室的有结构的多孔基
质，那么人们必须确保来自每个区室的扩增的核酸收集在分开的容器 中。这可以通过使用微量滴定板来实现，所述微量滴定板以这样的方 式调整至多孔基质区室的大小和分布，从而使得如果多孔基质置于所 述微量滴定板上方，那么每个区室在微量滴定板的孔上方。
可替代地，多孔基质可以切割成各自仅包含1个区室的几个部分。 其后，每个所述多孔基质部分可以置于分开的离心容器中用于提取分 别的核酸。
此外，扩增的核酸的提取可以通过应用压力差(例如真空)或吸 干膜的液体(例如用移液管)来完成。
本发明的优选实施方案是其中扩增的核酸在所述多孔基质内进行 冲企测的方法。
可替代地，扩增产物可以在多孔基质中直接进行检测，并且所述 检测基于荧光是优选的，因为分析PCR扩增的标准技术基于荧光染料， 如嵌入染料或标记的杂交探针。在这个实施方案中，扩增混合物包含 焚光化合物用于检测分别的扩增产物。例如，扩增混合物可以包含选
自FRET杂交探针、TaqMan探针、分子信标和单标记的探针的几种标 记的杂交探针。可替代地，可以使用dsDNA结合荧光实体例如SYBR Green,其仅当与双链核酸结合时发出荧光。
此外，多孔基质内扩增的核酸的检测可以使用电化学技术来进行。 在这个实施方案中，将电极置于多孔基质下以应用电势，且杂交探针 用电化学部分如二茂铁(ferrocen)衍生物或锇络合物进行标记。
此外，多孔基质内扩增的核酸的检测可以使用化学发光技术来进行。
本发明的更优选实施方案是其中扩增的核酸通过荧光优选地实时 才企测的方法。
如果扩增混合物包含荧光探针，那么优选不仅在扩增结束时监控 一次扩增的荧光，而且在每个扩增循环中监控至少一次。换言之，优 选在多孔基质的孔内执行实时PCR。
本发明的方法提供了进行构造以提供区室的多孔基质。在本发明自始至终，区室是通过不透性边界(boarder)彼此分开 的多孔基质的区域。换言之，围绕多孔基质区室的所述不透性边界避 免了邻近区室之间的液体交换。因此，可能仅使用1个多孔基质平行 执行几个测定，因为不透性边界避免了区室之间的交扰。
应当指出在本发明自始至终，提供区室的多孔基质的结构任选不 仅包含区室自身，而且包含用于区室与膜外部之间的液体交流的通道 结构。此外，可能提供具有使2个或更多区室连接的通道结构的多孔 基质，如果这是某些应用所需的话。流体可以例如通过重力、毛细力、 压力或离心来穿透通道结构。
本发明的另一个更优选的实施方案是其中在所述区室的每一个中 执行个别核酸扩增的方法。
使用有结构的多孔基质，当然可能在每一个区室中执行个别核酸 扩增，而主要存在用于这个目的的2种不同替代方案。
在本发明的更优选的方法中，所述个别核酸扩增是相同的或不同的。
在本发明的另 一 个更优选的方法中，所述不同的核酸扩增基于所 述区室内的不同样品和/或不同引物。
在所有区室中执行相同核酸扩增的 一个原因可以是产生就扩增结 果而言增加的可靠性。在每个区室中执行不同的核酸扩增增加了样品 分析的通量。不同的核酸扩增可以通过每个区室中分析相同样品的不 同引物，或通过经由许多等同区室加以分析的不同样品来确立。优选 提供具有区室的多孔基质，所述区室各自具有与所述区室内的孔表面 附着的一种或多种不同引物。
在根据本发明方法的优选实施方案中，多孔基质具有lxlCT2 cm2 -2xl02 cm2的面积和lxl0-2 cm — 0.5 cm的高度，优选地1x10-1 cm2 -lx102 cm2的面积和3xl(T2 cm关于多孔基质的尺寸和高度，必须考虑几个方面。首先，多孔基 质的面积必须足够大，以完全实现区室的形成以及使得能够排列所需 数目的所述区室。因此，多孔基质的面积还依赖于每个区室和周围屏 障的预期尺寸。 一方面，多孔基质的高度必须足够大以提供一定体积 的区室，以执行PCR扩增，且另一方面，如果荧光技术用于分析扩增 产物，那么足够薄以使得能够进行遍及整个体积的焚光检测。
在根据本发明方法的另一个优选实施方案中，多孔基质具有至少2 个区室，优选地2-lxl()S个区室，最优选地lx102-lxl()S个区室。
根据本发明的另一个优选方法是其中所述区室通过所述多孔基质 的化学官能化来提供的方法。
存在提供具有区室的多孔基质的几种可能性。短语化学官能化概 括了化学修饰多孔基质的表面特性的所有程序。可能通过湿法化学处 理、光化学处理、离子轰击、温度或通过电化学来修饰多孔基质的表 面特性。应当指出多孔基质的化学官能化可以通过上述技术直接或间 接进行，其中上述技术仅进行表面激活，从而使得其后另外的部分可 以与所述激活的结合位点结合。
根据本发明的另外 一 个优选方法是其中所述化学官能化用电化学 方法来进行的方法。
优选使用电化学方法，因为多孔基质的表面修饰可以以受控方式 使用如上所解释的电极阵列来进行。
对于区室中的核酸扩增，优选所述区室是包埋在疏水周围环境中 的亲水的。 一般而言，产生亲水/疏水模式的程序必须区别多孔基质的 不同区域。
使得能够产生此种模式的技术是例如通过将某 一 电流或电压应用 于多孔基质的某些区域的电化学，通过将某一波长的光应用于多孔基 质的某些区域的光化学，或通过将 一 定体积的试剂应用于多孔基质的 某些区域的点样技术。
用于构建多孔基质的起点可以是具有游离官能部分如羧基、环氧、 醛、羟基氨基的预加工的多孔基质，或具有受保护的官能部分(如前
多孔基质，或不含官能团6;非预加工的多《t基质。'工'、'
使用具有游离官能团的预加工的多孔基质，电化学、光化学或点 样技术必须寻址多孔基质的某些区域，以附着亲水或疏水部分。
使用具有受保护的官能团的预加工的多孔基质，电化学、光化学 或点样技术必须寻址多孔基质的某些区域以使化学反应能实现，以使 亲水或疏水部分附着或脱保护。例如，具有由疏水基团保护的官能部 分的多孔基质可以进行脱保护，以产生亲水区域，且未处理的区域将 保持疏水。具有由亲水基团保护的官能部分的相反过程可以用于通过 切割亲水保护基产生模式。为了产生疏水区域，在所述脱保护后使另 外的疏水残基与脱保护区域偶联可以是有用的。
使用不含官能团的非预加工的多孔基质，亲水/疏水冲莫式可以通过 用官能团修饰多孔基质的某些区域来产生。
为了产生亲水/疏水模式，可以使用不同基团。对于亲水区域，亲 水基团如羟基、氨基、羧基、硫醇、磷酸是可用的。对于疏水区域， 疏水基团如胆固醇、碳醇(例如十二烷醇)、三苯曱基衍生物或棕榈 酰是合适的。为了增强亲水/疏水性质，还可以使用多功能残基如树状 聚体或分支衍生物。优选亲水/疏水残基以共价方式与多孔基质偶联， 以提供充分的稳定性用于后续扩增反应。
进一步优选的是其中所述区室通过流体点样来提供的根据本发明
的方法。
适合于构造多孔基质以提供区室的流体是溶于溶剂的材料，所述 溶剂在大气压下蒸发且因此形成所述材料的薄膜。关于这种策略的例 子是溶于四氢呋喃(tetrahydrofurane ) ( THF )的聚氯乙烯(PVC )溶液。
应当指出可能提供具有超过一种类型的引物分子/区室的多孔基
成，而所述正交保护基是在不同条件下不稳定的至少2种不同的保护 基，所述不同条件例如不同的电势、酸/碱不稳定性或电化学、湿法化 学和光化学的任何其他组合。使用此种正交保护基例如用于保护多孔 基质的结合位点提供了在多孔基质的1个个别区室中产生超过一类引 物的混合物的机会。可以提供至少2种不同的保护基，各自作为个别 表面修饰或作为包含2种或更多所述不同保护基的单一分支的表面修 饰。
根据本发明的优选方法是这样的方法，其中在使所述多孔基质暴 露于温度循环之前和引物与所述多孔基质任选切割之前执行另外的预 杂交步骤。
提供引物阵列具有预杂交步骤可以在扩增反应之前执行的另外优 点，以在有结构的多孔基质的相应区室上积累应用的样品的某些核酸。 这个预杂交步骤是如果样品内的核酸与各自区域的共价结合的引物接 触则发生的杂交步骤。换言之，样品内的每种靶核酸在后续扩增反应 之前找到具有互补序列的附着引物。由于此种预杂交步骤，可能检测 低得多的浓度，因为检测极限不再依赖于每种核酸跨越阵列的所有区 室的统计学分布。
在根据本发明的更优选方法中，所述多孔基质进行密封，以避免 区室之间的交扰。
图1显示了举例说明多孔基质的一个实施方案的示意图，所述多 孔基质进行密封，以避免区室之间的交扰。如果多孔基质1进行构造 以提供区室2,那么重要的是避免不仅在多孔基质内而且经由其周围环 境的区室之间的交扰。因此，优选在样品和/或扩增混合物应用后和PCR 扩增前密封多孔基质。在本发明自始至终，用于水溶液的所有种类的 封口 5, 6可能是本领域技术人员已知的。例子是例如可以与多孔基质 表面粘合的塑料箔，或可以通过机械力压向多孔基质以提供不透水接 触的载玻片。如果载玻片用于密封多孔基质，那么优选使用疏水载玻 片(例如硅烷化的玻璃)或中间物油膜。可替代地，整个多孔基质可
以浸入油例如PCR油中。此外，蒸发流体由此在表面上形成薄膜，如 溶于四氢呋喃(THF)的聚氯乙烯(PVC),适合于密封多孔基质。应 当指出如果例如多孔基质内的PCR的荧光检测是需要的，那么必须使 用光学透明材料，且如果扩增的核酸的后续提取是预期的，那么可逆 密封是必需的。
在根据本发明的优选方法中，热基底6用于密封多孔基质的 一 侧。 热基底是板样形式的特殊热管(heat pipe),其作为Therma-BaseTM从 Thermacore (Lancester， USA)商购可得。热管是具有内部芯结构的密 封真空容器，所述内部芯结构通过内部工作流体的蒸发和冷凝来转移 热。 一般使用氨、水、丙酮或甲醇，尽管对于低温和高温应用使用专 门流体。因为热在热管的一侧上吸收，所以工作流体一皮蒸发，乂人而产 生热管内的压力梯度。蒸气被迫流向管的较冷末端，它在其中冷凝， 经由例如散热器(heat sink)将其潜热传递给芯结构且随后给周围环境。 冷凝的工作流体经由内部芯结构内的重力或毛细管作用回到蒸发器。 因为热管利用工作流体的潜热作用，所以它们可以设计为维持环境条 件附近的组分。尽管当冷凝的流体用重力工作时，它们是最有效的， 但热管可以以任何定向工作。
因此，使用用于密封多孔基质一侧的热基底具有就热循环而言的 另外的有利效果，所述热循环是多孔基质内的PCR扩增所必需的。关 于包括热基底的本发明实施方案的 一 些更多细节可以在说明书中随后 找到。
应当指出如果多孔基质进行构造以提供区室和通道结构，那么在 样品和扩增混合物应用后密封多孔基质的顺序可以加以改变。在这种 情况下，多孔基质可以例如在引物已与区室内的孔附着后进行密封。 其后，将扩增混合物和样品经由通道结构应用于区室以执行扩增反应。
在多孔基质内提供区室的另外程序是使用机械压力以使基质部分 压缩，从而使得孔被关闭或最小化和液体的扩散受阻。
此外，多孔基质可以通过使用使多孔基质部分熔化的温度或激光 处理进行构造以提供区室，从而使得多孔基质的孔在处理的区域中变 得关闭。
在根据本发明的另外 一个优选方法中，所述多孔基质是玻璃毛状 物，有机聚合物如纤维素，或无机聚合物如尼龙、聚酯、聚丙烯(PP)、
聚乙烯(PE)、聚对苯二曱酸乙二酯(PET)、聚丙烯腈(PAT)、聚 偏氟乙烯(PVDF)或聚苯乙烯。
此外，其他材料如玻璃、金属氧化物或硅衍生物适合于本发明， 就它们以这样的方式进行加工，从而使得它们提供在其中使得核酸能 够扩增的孔而言。
本发明的另一个方面是用于核酸扩增的多孔基质，其包含
a)平行执行许多个别核酸扩增的区室，
b )使得用于核酸扩增的核酸分子和聚合酶能够在所述多孔基质的 孔内扩散的孔，和
c)与所述多孔基质的表面附着的至少一种引物。 引物可以通过本领域技术人员已知的任何程序与多孔基质附着。 例子是共价键如硅烷偶联、酰胺键、醛或环氧化物偶联，经由例如第 尔斯-阿尔德反应的交叉偶耳关，配位结合如His标记和螯合剂之间，生 物亲和结合如生物素/链霉抗生物素蛋白键。可替代地，引物与多孔基 质的结合可以是物理吸着。在这个实施方案中，引物通过例如将所述 引物点样或移液至基质随后蒸发溶剂简单地应用于多孔基质。
在根据本发明的优选多孔基质中，所述引物与多孔基质共价附着。 根据本发明的多孔基质具有平行执行许多个别核酸扩增的区室。 关于具有区室连同或不连同通道结构的多孔基质的不同可能性和 需求先前已得到解释。应当指出如果不同的核酸扩增在多孔基质的区 室中进行，那么优选在样品、引物和/或探针装载之后和扩增反应之前 密封多孔基质。如果提供通道结构，那么多孔基质可以可替代地在样 品和扩增混合物装载之前进行密封。
在根据本发明的另外一种优选的多孔基质中，所述区室通过化学 屏障进行限定，优选地所述化学屏障是所述多孔基质的化学官能化。
如前所述，构造多孔基质的一种可能性是多孔基质的材料的化学 官能化。例如，亲水多孔基质的某些部分可以进行改变，从而使得其 后它是疏水的。换言之，亲水多孔基质的官能化的疏水部分形成关于 水溶液的化学屏障。
在根据本发明的更优选的多孔基质中，所述化学官能化是电化学 官能化。
在根据本发明的另外 一种优选的多孔基质中，所述区室通过流体 点样来限定。
本发明关于电化学官能化和流体点样以构造多孔基质以提供含或 不含通道结构的区室的替代方案先前已概述。
根据本发明的另 一种优选的多孔基质是其中每个区室具有相同或 不同的附着的引物的基质。
一般而言，提供多孔基质的区室化以平行执行多个不同的扩增反 应，并且主要存在2种不同的替代方案，即相同引物组和不同样品或 不同引物组和相同样品。因此，可以提供在每个区室中具有相同引物 组的多孔基质，以筛选多种样品，或在每个区室中具有不同引物的多 孔基质，以筛选关于几种成分的样品。
本发明的另 一个方面是用于核酸扩增的多孔板，其中所述多孔板 的每个孔包含根据本发明的多孔基质，从而使得核酸扩增在所述多孔 基质的所述孔内发生。
使用多孔板用于处理多个多孔基质具有下述优点这种装置可应 用于许多商业设备如块循环仪(blockcycler),以以受控和高度平行的 方式执行扩增反应。另外多孔板与对于筛选目的增加通量的技术相容， 如使用机器人仪器的自动移液技术，具有标准检测仪器的分析技术。
本发明的另外 一 个方面是用于核酸扩增的试剂盒，其包含
a) 根据本发明的多孔基质，和
b) 扩增混合物。
在本发明自始至终，扩增混合物包含执行聚合酶链反应(PCR)形 式的核酸扩增反应所必需的所有化合物，即耐热的DNA聚合酶、至少 一种核酸化合物、脱氧核香酸、具有至少一类二价阳离子优选地Mg2+ 的緩沖液。此外，扩增混合物可以包含例如具有二价阳离子结合位点 用于"热启动"PCR的合成肽或其他PCR添加剂。
在根据本发明的优选试剂盒中，所述扩增混合物包含酶、引物、 核普酸和l爰冲液。
作为耐热的聚合酶，可以使用各种各样的酶。优选地，所述耐热 的DNA聚合酶选自敏捷气热菌(Aeropyrum pernix ),闪烁古生球菌 (Archaeoglobus fulgidus ),石危还原球菌属物种(Desulfurococcus sp.) Tok., 嗜热石成曱烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum )， 甲
烷球菌属物种(Methanococcus sp.)(例如詹氏甲烷球菌(ja画schii)， 沃氏曱烷球菌(voltae ))，炽热曱烷嗜热菌(Methanothermus fervidus.), 火球菌属(Pyrococcus)物种(激烈火球菌(furiosus )、种类GB-D、 沃氏火球菌(woesii )、 abysii、 horikoshii、 KOD、 Deep Vent、 Proofstart ), Pyrodictium abyssii, 隐蔽热网菌(Pyrodictium occultum),石危化叶菌 属物种(Sulfolobus sp.)(例如嗜酸热石克化叶菌(acidocaldarius)、硫 ,黄矿石危化叶菌(solfataricus ))，热；求菌属(Thermococcus )物种(zilligii、 barossii 、 fumicolans 、 gorgonarius 、 JDF-3 、 kodakaraensis KODI、 litoralis、 种类9分度North-7、种类JDF-3、 gorgonarius、 TY),嗜酸热原体
(Thermoplasma acidophilum ),非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus ), 栖热袍菌属物种(Thermotoga sp.)(例如海栖热袍菌(marit腿)、 那不勒斯栖热袍菌(neapolitana)),嗜热碱曱烷杆菌，栖热菌属
(Thermus )物种(例如，？K生栖热菌(aquaticus )、布氏栖热菌
(brockianus)、丝一犬栖热菌(filiformis)、黄4西热菌(flavus)、享L栖 热菌(lacteus)、红色栖热菌(rubens)、红栖热菌(ruber)、嗜热栖 热菌(thermophilus ) 、 Z05或Dynazyme )。还在本发明的范围内的 是其突变体、变体或衍生物、嵌合或"融合-聚合酶"，例如Phusion
(Finnzymes或New England Biolabs,目录号F-530S )或iProof( Biorad, 目录号172-5300 ), Pfx Ultima( Invitrogen,目录号12355012 )或Herculase II Fusion ( Stratagene，目录号600675 )。此外，根据本发明的组合物 可以包含一种或多种上述聚合酶的掺合物。
在一个实施方案中，耐热的DNA聚合酶是依赖DNA的聚合酶。 在另一个实施方案中，耐热的DNA聚合酶具有另外的逆转录酶活性且 可以用于RT-PCR。关于此种酶的一个例子是嗜热栖热菌(Thermus thermophilus ) ( Roche Diagnostics目录号11 480 014 001 )。还在本 发明的范围内的是上文汇集的 一种或多种聚合酶与逆转录病毒逆转录 酶的摻合物，所述逆转录酶例如来自MMLV、 AMV、 AMLV、 HIV、 EIAV、 RSV的聚合酶和这些逆转录酶的突变体。
DNA聚合酶、脱氧核苷酸和其他緩冲液组分的浓度以标准量存在， 其浓度是本领域众所周知的。Mg"浓度可以为0.1 mM扩增混合物的至少 一种核酸化合物包含至少 一对扩增引物以执行 核酸扩增反应。
此外，扩增混合物可以包含用于实时检测分别的扩增产物的荧光
化合物，以及分别地2-6种不同标记的杂交探针，所述杂交探针不限 于但选自FRET杂交探针、TaqMan探针、分子信标和单标记的探针。 可替代地，此种扩增混合物可以包含dsDNA结合荧光实体例如SYBR Green,其^又当与双链DNA结合时发出焚光。
此外，扩增混合物可以适应于执行单步RT-PCR，并且包含Taq DNA聚合酶和逆转录酶例如AMV逆转录酶的4参合物。在进一步的示 例性具体实施方案中，此种扩增混合物特别适应于执行单步实时 RT-PCR,并且包含核酸^r测实体例如SYBR Green或荧光标记的核酸 ^:测探针。
在根据本发明的另 一 种优选试剂盒中，使至少 一 种引物与所述多 孔基质的表面附着且所述扩增混合物包含酶和核苷酸。
在试剂盒的这个实施方案中，引物已与所述多孔基质的表面附着， 且因此扩增混合物必须不包含引物分子。
本发明的另外一个方面是用于核酸扩增的系统，其包含
a) 根据本发明的多孔基质，和
b) 热循环仪。
在本发明自始至终，热循环仪概括了与多孔基质一起执行热循环 所必需的所有组分。热循环仪包含至少一个热泵例如Pdtier元件以增 加多孔基质的温度，散热器以在多孔基质的冷却期间散逸热，和控制 单元以控制多种样品的所述同时热循环。如前所述，优选提供在多孔 基质和散热器之间的另外热基底，以增加温度变化的速度和精确性， 以及提供跨越多孔基质的整个横截面积的均 一加热/冷却程序。
在根据本发明的优选系统中，所述热循环仪包含至少一个热泵、 散热器和/或控制单元。
在根据本发明的另 一种优选系统中，所述热循环仪包含照明工具 和检测工具。
优选提供具有另外的检测工具的系统以直接在多孔基质上分析扩 增结果。优选所述检测工具是荧光检测器，因为分析PCR扩增的标准 技术基于荧光染料，如嵌入染料或标记的杂交探针。如果扩增结果应
该用荧光技术进行分析，那么本发明的扩增混合物进一步包含荧光探 针。因为荧光技术的确需要光用于激发荧光染料，所以根据本发明的 优选系统进一步包含照明工具。
取决于多孔基质的横截面积的尺寸，荧光检测器和照明工具必须 满足特殊需求。如果本发明的多孔基质具有在其横截面积上分布的区 室，那么人们必须确保多孔基质中心处的区室及其边界处的区室获得 相同的照明，且荧光强度以可比较的方式进行记录。这可以通过使用 荧光检测器和/或配备远心光学器件的照明工具来实现。
在本发明的范围内，远心光学器件是具有非常小孔径的光学器件， 且因此提供高焦深。换言之，对于跨越与在物方和/或像方中的光轴平 行的物方的所有点，远心光学器件的远心光与主射线准平行。因此，
利用物方中的远心度(telecentricity )的照明工具或冲企测工具的品质对 于某些物点(object point)与光学器件的距离是难以察觉的。远心光学 器件的孔径在无限远成像。此外，使用远心光，确保跨越光束的良好 侧向同质性，并且位于部件中心处的部位与位于部件边界处的那些可 比较。在本发明自始至终，远心光学器件始终包含向场透镜。在本发 明的背景中，向场透镜是最接近于物镜的单个透镜，其决定仪器的视 野、包含一个或多个组分(消色差透镜)、并且与设备的另外光学组 分组合有助于物方和/或像方中的远心度。
本发明的向场透镜将激发光从光源转移到多孔基质且将荧光信号 从多孔基质转移到检测器。这的确不排除在束路径中引入另外的光学 组分，所述束路径例如光源和向场透镜之间、向场透镜和检测器之间 或向场透镜和多孔基质之间。
在根据本发明的另一种优选系统中，所述核酸扩增是实时PCR。 如果根据本发明的系统配备荧光检测器和照明工具，那么优选不
仅在扩增结束时监控一次扩增的焚光，而且在每个扩增循环中监控至
少一次。换言之，优选在多孔基质的孔内执行实时PCR。
根据本发明的另外 一 种优选系统进 一 步包含从用于核酸扩增的所 述设备中提取扩增的核酸的工具。
在根据本发明的这种系统的另 一个实施方案中，系统配备从多孔 基质中提取扩增的核酸的另外工具。在某些实施方案中，可能需要从
多孔基质中提取扩增的核酸用于后续分析。此种外部分析是例如质谱 分析或凝胶分析。
在根据本发明的更优选的系统中，提取扩增的核酸的所述工具是 离心工具。
从含或不含区室的多孔基质中提取扩增的核酸的不同程序已在前 文详细解释。
提供下述实施例、序列表和图以帮助理解本发明，本发明的真实 范围在附加权利要求
中阐述。应当理解在不背离本发明的精神的情况 下，可以在阐述的程序中进行修饰。
实施例1:
使用电化学程序和将标记的寡核苷酸分配给基质在多孔基质上产 生亲水/疏水模式。
在疏水基质上包含2个亲水位置的亲水/疏水模式的制备使用图3 中描述的电化学程序来产生。在这个实施例中，描述了疏水部分与亲 水官能化多孔基质的偶联。对于这个实验，使用自制的反应室，其包 含具有2个金电极的电极阵列、无机的多孔基质、标准DNA合成试剂、 疏水部分的亚磷酰胺和在活化电极上电化学产生酸性介质的緩沖溶 液。
将多孔基质(来自PolyAn， Berlin/德国的PE-Sinter膜,孔径大小 10 )Lim,厚度0.6 mm;羟基的装填密度1.7 ^mol/cm2)置于反应室 中与电极接近。因为多孔基质自身仅具有不含任何保护基的结合位点， 所以使5'-DMT-T-3'-亚磷酰胺与多孔基质偶联作为起始基团。为了这个 目的，将5'-DMT-T-3'-亚磷酰胺连同活化剂(溶于乙腈的二氰基咪唑 (Dicyanoimidazol))填充到室内，以与膜的官能团反应。
其后取出溶液且进行氧化步骤，以使来自第一个偶联步骤的三价 磷分子氧化成更稳定的五价磷分子。随后从反应室中冲洗掉氧化溶液， 并且进行加帽步骤以封闭来自第 一个偶联步骤的多孔基质的所有未反 应的羟基用于进一步反应。其后，取出加帽溶液且将緩沖溶液填充到 室内。为了修饰具有亲水点和疏水周围环境的多孔基质(图2a)，使 用下述程序(在图3中举例说明)。将电势(-300 pA60秒)顺次应用 于2个电极，以切割多孔基质与活化的电极接近的那些部分上的保护
基。其后，再次从反应室中沖洗掉緩冲溶液，并且加入溶于吡啶的三
甲基氯硅烷溶液10分钟，以与先前脱保护的羟基反应。因此，羟基被 曱硅烷基封闭，这导致下述状况其中在电极上方的位置具有甲硅烷 基保护的羟基且在电极旁的位置具有三苯曱基保护的羟基。因此，加 入溶于二氯甲烷的3%三氯乙酸的酸性溶液(DMT-取出试剂，Roth, Karlsruhe/德国，目录号2257,1 )2分钟，以取出电极旁所有剩余的DMT 基团。因此，解封闭的羟基现在易接近以与疏水部分反应以产生在膜 上的疏水区域。因此，将胆固醇-亚磷酰胺(四甘醇胆固醇亚磷酰胺溶 于乙腈中的O.l M溶液，ChemGenes Corp., Wilmington, MA/USA, 目录号CLP-2704 )与活化剂填充到室内，以在多孔基质的脱保护的结 合位点上反应。温育2分钟后沖洗掉亚磷酰胺溶液，且进行另一个氧 化步骤以使三价磷部分稳定化。交换氧化溶液后，将氨的水溶液冲洗 到反应室内，其温育时间为60分钟，以释放来自电极上方的位置的甲 硅烷基保护基，并且使来自磷酸部分的所有磷酸保护基脱保护。使用 乙腈和水的一些后续洗涤步骤后，获得在电极上方具有亲水性和电极 旁具有疏水性的亲水/疏水模式。
为了修饰具有疏水点和亲水周围环境的多孔基质(图2b),在类 似条件下通过使用下述程序制备第二种基质，但具有相反模式。用 5'-DMT-T-3'-亚磷酰胺首先偶联在基质上产生起始层后，将緩沖溶液填 充到室内并且将电势(-300 ^A60秒)顺次应用于2个电极，以切割多
磷酰胺(四甘醇胆固醇亚磷酰胺溶于乙腈中的0.1 M溶液，ChemGenes Corp., Wilmington, MA/USA,目录号CLP-2704 )与活化剂填充到室 内，以在多孔基质的脱保护的结合位点上反应。温育2分钟后沖洗掉 亚磷酰胺溶液，且进行另一个氧化步骤以使三价磷部分稳定化。其后 取出溶液，并且进行加帽反应以封闭来自胆固醇偶联步骤的多孔基质 的所有未反应的羟基用于进一步反应。随后取出加帽溶液，并且加入 溶于二氯曱烷的3%三氯乙酸的酸性溶液(DMT-取出试剂，Roth， Karlsruhe/德国，目录号2257,1 )2分钟，以取出电极旁所有剩余的DMT 基团。交换酸性溶液后，将氨的水溶液沖洗到反应室内，其温育时间 为60分钟，以使来自磷酸部分的所有磷酸保护基脱保护。最后，执行
使用乙腈和水的一些洗涤步骤，并且获得在电极上方具有疏水性和电 极旁具有亲水性的亲水/疏水模式。
制备2种不同官能化模式后，膜的物理性质通过将其应用于5'^73-(T) 15寡核苷酸的水溶液进行测试。5分钟的温育时间后，膜在0.5x SSPE緩沖溶液中进行洗涤并且随后用标准数码相机进行成像。
使亲水寡核普酸移动到膜的亲水区域内，并且设法避开疏水区域。 图2中的图片显示了这种行为，红色的寡核苷酸在电极上方(图2a) 或电极旁(图2b)的亲水区域上，这取决于官能化模式。
实施例2:
在水中的具有亲水/疏水模式的多孔基质
将膜(来自PolyAn， Berlin/德国的PE-Sinter膜，孔径大小7-16pm,厚度0,6 mm;羟基的装填密度0,8 ^mol/cm2)根据实施例1 中提及的电化学程序(电流-300 nA,脱保护时间60秒)制备为亲 水/疏水模式，其中胆固醇部分在电极上方。这种制备后，将膜置于2 个载玻片之间从而形成反应室，并且将水冲洗到这种排列内。水扩散 到膜的亲水部分内，但不进入疏水区域内。图4显示了在520 nm通道 中在Lumilmager仪器(Roche Applied Science, Mannheim,德国)上 成像的这样处理的膜的图片。
实施例3:
使用SYBRGreenI由于多孔基质中的寡核苷酸杂交的荧光强度中 的变化
制备在膜边缘周围具有塑料框以避免液体渗漏的2种膜(来自 PolyAn的PE-Sinter膜，孔径大小80将2个膜置于载玻片上并且用来自SYBR Green I测定的2种不同 的终点PCR溶液进行处理，所述SYBR Green I测定用LightCycler 2.0 4义器(Roche Applied Science, Mannheim,德、国)进4亍。2种不同的PCR
反应用与LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I ( Roche Applied Science, Mannheim,德国，目录号03 515 885 )组合的，来自 Universal ProbeLibrary Control Set ( Roche Applied Science, Mannheim, 德国，目录号04 696 417 001;详细序列信息在序列部分中列出)的 SYBR Green I测定来进行，依照包装插页中描述的标准条件。
第一种PCR是使用引物对(SEQ ID. 1和SEQ ID. 2 )和来自上述 ^式剂盒的合成冲莫氺反(来自 Universal ProbeLibrary Control Set (Roche Applied Science, Mannheim,德国)的对照F)的阳性反应，另 一种 PCR是使用相同引物但不含模板(所谓的无模板对照，NTC)的阴性 对照实-睑。将终点PCR溶液移液到2个膜的中间处。在图5左侧上的 膜获得阳性PCR实验，图5右侧上的第二个膜阴性对照(NTC)。分 配PCR溶液后，膜随后用另一个载玻片覆盖，而这个反应室用夹子夹 紧并且用粘合箔进行密封。
其后,用Lumilmager仪器(Roche Applied Science, Mannheim, 德国)在520 nm通道中在2种不同温度下，即在室温下或在8(TC下记 录载玻片的荧光强度。由于双链DNA与嵌入染料SYBR Green I组合 导致荧光信号的原理，所以在室温下对于阳性PCR实验存在大量荧光 信号，而对于对照实验仅能获得较少信号(参见图5a)。在升高的温 度(8(TC)下，双链DNA解链，并且SYBR Green I染料的信号消失， 从而使得2个膜都具有较少的荧光强度(参见图5b)。反应室随后冷 却和双链DNA形成后，荧光信号对于阳性PCR实^^增加(参见图5c )。
实施例4:
来自SYBR Green I测定用终点PCR溶液处理膜后荧光强度中的变
化
此处，使用如实施例3中所述相同的实验装置，但仅使用1个膜 (来自PolyAn的PE-Sinter膜,孔径大小80将来自实施例3的终点PCR实验的2种溶液移液到膜的2个分开 区室内。再次将膜置于2个载玻片之间，用夹子夹紧，用粘合箔进行 密封且调节至室温或80°C。荧光强度通过Lumilmager仪器(Roche
Applied Science, Mannheim,德国)在520 nm通道中进行检测。图6 显示了这种膜在如实施例3中概述的温度循环期间具有相应的荧光行 为的图像(左区室阳性PCR实验，右区室NTC; a)室温，b) 90 °C, c) 60°C, d)室温)。
实施例5:
通过使用基于探针的检测方式的(3-2微球蛋白在膜内的PCR反应
(3-2微球蛋白的PCR反应混合物溶液用Universal ProbeLibrary测 定和体夕卜RNA转录物(来自LightCycler h-卩2M Housekeeping Gene Set， Roche Applied Science, Mannheim,德、国，目录号3 146 081 )进4亍制 备，所述体外RNA转录物先前用Transcnptor第 一链cDNA合成试剂 盒(Roche Applied Science, Mannheim，德国，目录号4 379 012 )进 行逆转录，依照包装插页中描述的标准条件。对于最终PCR反应，使 所得的cDNA的约105个拷贝与引物(SEQ ID 3和SEQ ID 4 )、 Universal ProbeLibrary探针(Universal ProbeLibrary的探针Nr. 42 )和PCR主混 合物(LightCycler TaqMan Master,Roche Applied Science,目录号04 535 286 001 )进行混合。与来自包装插页中的标准条件相对比，PCR混合 物中所有PCR试剂的终浓度增加。终浓度如下引物1000 nM， UPL 4果针850 nM, PCR混合物2,lx。
将这种溶液移液到膜(来自PolyAn的PE-Sinter膜，孔径大小 80PCR反应后，将膜从塑料箔中取出并且通过将膜离心到塑料盖内 来获得液体。将获得的溶液移液到即用型4%琼脂糖凝胶(Invitrogen， Carlsbad, CA/USA,目录号G 501 804 )上，并且与作为参考的PCR 反应进行比较，所述作为参考的PCR反应用相同的PCR反应混合物在 LightCycler 2.CM义器(Roche Applied Science, Mannheim, 德、国)上完 成。在LightCycler 2.0仪器上，使用下述PCR规程于95。C最初变性
10分钟和随后45个扩增循环，各具有于95°C10秒的变性步骤，随后 为于65°C30秒和72°C1秒的扩增步骤，与40°C30秒的后续最终冷却 步骤。图7显示了相应的凝胶，而2个不同膜PCR反应的条带(由II 指出)产生与参考PCR反应相同的扩增子长度(由I指出的一式四份)。 加上凝胶分析，在扩增开始(在第1个循环时)和结束(第45个 循环)时在520 nm通道中，通过Lumilmager仪器(Roche Applied Science, Mannheim,德国)测量由于UPL水解探针的焚光团在PCR 期间切割的膜荧光强度的增加。如预期的，在520 nm通道中，信号强 度在PCR反应期间对于一个膜从最初9,8 x 106增至1,1 x 107,且对于 另一个膜从最初9,6 x 106增至1,1 x 107。
权利要求
1. 一种用于核酸扩增的方法，其包括a)提供进行构造以提供区室的多孔基质，b)向所述多孔基质中加入包含核酸的样品和扩增混合物，c)使所述多孔基质暴露于温度循环，其中所述核酸扩增在所述多孔基质的孔内发生。
2. 根据权利要求
1的方法，其中步骤a)中的所述多孔基质与至 少 一种附着的引物一起提供和/或所述扩增混合物包含酶、核苦酸和緩 沖液。
3. 根据权利要求
2的方法，其中所述至少一种附着的引物在执行 所述温度循环之前与所述多孔基质切割开。
4. 根据权利要求
1 -3的方法，其中在每个所述区室中进行个别核酸扩增。
5. 根据权利要求
1-4的方法，其中所述区室通过所述多孔基质 的化学官能化来提供。
6. 根据权利要求
1 -4的方法，其中所述区室通过流体点样来提供。
7. 根据权利要求
2-6的方法，其中在所述多孔基质暴露于温度 循环之前和所述引物与所述多孔基质任选切割之前执行另外的预杂交步骤。
8. 根据权利要求
1-7的方法，其中所述多孔基质进行密封，以 避免所述区室之间的交扰。
9. 根据权利要求
1-8的方法，其中所述多孔基质是玻璃毛状物， 有机聚合物如纤维素，或无机聚合物如尼龙、聚酯、聚丙烯(PP)、 聚乙烯(PE)、聚对苯二曱酸乙二酯(PET)、聚丙烯腈(PAT)、聚 偏氟乙烯(PVDF)或聚苯乙烯。
10. —种用于核酸扩增的多孔基质，其包含 a)平行执行许多个别核酸扩增的区室，b )使得用于核酸扩增的核酸分子和聚合酶能够在所述多孔基质的 孔内扩散的孔，和c)与所述多孔基质的表面附着的至少一种引物。
11. 根据权利要求
10的多孔基质，其中所述引物与所述多孔基质 共价附着。
12. 根据权利要求
10-11的多孔基质，其中所述区室由化学屏障 限定，优选地所述化学屏障是所述多孔基质的化学官能化。
13. —种用于核酸扩增的多孔板，其中所述多孔板的每个孔包含根 据权利要求
10- 12的多孔基质，从而使得核酸扩增在所述多孔基质的 所述孔内发生。
14. 一种用于核酸扩增的试剂盒，其包含a) 根据权利要求
10-12的多孔基质，和b) 扩增混合物。
15. —种用于核酸扩增的系统，其包含a) 根据权利要求
10- 12的多孔基质，和b) 热循环仪。
16. 根据权利要求
15的系统，其中所述热循环仪包含照明工具和 检测工具。
17. 根据权利要求
16的系统，其中所述核酸扩增是实时PCR。
专利摘要
本发明涉及用于核酸扩增包含多孔基质的方法、基质、试剂盒和系统，所述多孔基质具有使得生物分子能够扩散的孔。更具体地，本发明涉及其中核酸扩增在多孔基质的孔内发生的方法、基质、试剂盒和系统。
文档编号C12Q1/68GKCN101395279SQ200780007187
公开日2009年3月25日 申请日期2007年2月27日
发明者R·莫里茨 申请人:霍夫曼—拉罗奇有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan