专利名称:一种用脂肪酶催化制备维生素a脂肪酸酯的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产维生素A脂肪酸酯的方法。更具体地说，本发 明提供一种用脂肪酶催化维生素A与脂肪酸反应合成维生素A脂肪酸 酯的方法，特别是在非水相体系中用固定化微生物脂肪酶催化反应合成 维生素A脂肪酸酯的方法。
背景技术：
维生素A是人体必需的营养素之一，是儿童生长发育过程中必不可 缺少的微量营养素，它参与机体多种生理过程，能维持和促进人体生长、 发育、生殖和细胞膜的稳定性，对视觉的形成有明显的作用。由于其能 抗炎、抗氧化、调节免疫、抗皮肤衰老、抗癌等功效已经被广泛应用于 食品、药物、营养保健品、化妆品、飼料添加剂中。但是，维生素A是 非常不稳定的，很容易在空气、光、高温下被氧化。而且维生素A对皮 肤有刺激性。为了降低它的不稳定性和刺激性，可以将维生素A转化成 维生素A酯。但长期以来，工业维生素A脂肪酸酯均是通过化学法来 生产，用催化剂如曱醇钠、Grignard试剂等在高温高压下进行一系列 催化反应来完成。不仅总转化率不高，而且还存在许多难以克服的缺点。 如催化剂有毒性、高温高压反应能耗高、副反应多，产物色泽深、分 离和精制困难等，而且酸对设备腐蚀严重，不利于生产。随着生物技术 的发展，特别是酶工程的研究，为生物催化剂合成脂肪酸酯提供了新的 方法。与传统的化学法相比，酶法合成具有反应条件温和，特异性强， 副反应少，对环境友好，产物品质高等特点。特别是在非水相中脂肪酶 促反应，拓宽了酶的应用范围和领域，成为近年来酶学研究的热点。
"Inada， Yuji"在"维生素A酯的制备"(JP 62248495, 1986)中 公开了用O-甲氧基聚乙二醇修饰的荧光假单胞菌类脂肪酶来催化维生 素A酯合成的方法。该方法的特点是用O-甲氧基聚乙二醇修饰后的脂 肪酶作为催化剂，在水饱和的苯溶剂中，反应温度为25-30X:，利用维 生素A醋酸酯和C5-C20脂肪酸包括戊酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉 豆蔻酸、棕榈酸、油酸等，摩尔比为1:10的条件下合成维生素A酯， 维生素A酯收率达80-85%。该方法催化剂的制备复杂，成本高；而
且使用有机溶剂苯作反应介质，苯有毒性，对环境有污染。而且，使用 脂肪酸过多会增加后续分离提纯的困难性，必然导致产品成本高。
"谭天伟，刘涛，尹春华"在"一种用固定化脂肪酶催化合成维生
素A脂肪酸酯的方法"(中国专利申请200310116834.0, 2003)中公开 了一种用固定化脂肪酶催化合成维生素A脂肪酸酯的方法，是将底物维 生素A醋酸酯和C10-C18脂肪酸或脂肪酸酯，按摩尔比在1:1-1:7 的范围，与有机溶剂和固定化脂肪酶混合，固定化脂肪酶的用量是维生 素A醋酸酯质量的0.2-5倍，在20-501C的条件下，反应9-50小时， 取出固定化脂肪酶，反应液经过分离、结晶得到维生素A脂肪酸酯；有 机溶剂是含水量为0目前的生物催化维生素A脂肪酸酯生产方法存在;f艮多缺点，比如成 本过高，维生素A脂肪酸酯产率低等。因此，需要提供一种简便的低成 本、高产率制备维生素A脂肪酸酯的方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种新的制备维生素A脂肪酸酯的方法。
本发明使用脂肪酶尤其是固定化脂肪酶作为催化剂，催化维生素A 与脂肪酸反应，合成维生素A脂肪酸酯。通过这种方法，实现了本发明 的目的。优选地，所述方法在非水相体系中进行。
与现有技术中的方法相比，在本发明所公开的方法中，脂肪酶用量 少，反应时间短，维生素A转化率高，脂肪酸用量少，脂肪酶使用寿命 长等优点，从而降低了生产成本，有利于工业化生产。
具体实施方式
在本发明中，当描述维生素A脂肪酸酯的反应时，"维生素A，，是 指视黄醇(retinol);而在一般性的描述中，维生素A泛指能够在体内 或体外直接或间接提供视黄醇来源的任何物质，包括但不限于视黄醇、 视黄醛、视黄酸、及其各种衍生物，比如视黄醇醋酸酯、视黄醇脂肪酸 酯、视黄醇棕榈酸酯等。在一个方面，本发明提供用脂肪酶催化维生素A与脂肪酸^^应来 制备维生素A脂肪酸酯的方法。
在本发明中，脂肪酶是指能够催化脂肪酸酯化反应及其逆反应脂肪 酸酯水解的酶。很多生物体中都存在脂肪酶。本发明的脂肪酶可以来源 于任何天然表达脂肪酶的生物。同样地，所述脂肪酶也可以是重组生产 的，并且所述重组脂肪酶可以是突变体形式或非突变体形式。在一个实 施方案中，所述脂肪酶可以被修饰，比如用聚乙二醇修饰。因此，在本 发明中，凡提到"脂肪酶"或者特定来源的脂肪酶，均包括该脂肪酶的 天然形式、重组形式、突变形式、变体形式及各种修饰形式。本发明的 脂肪酶可以商业敖得或者根据已知方法制备，脂肪酶的制备方法是本领 域技术人员公知的，包括例如从天然来源中分离、化学合成、基因重组 制备、随机诱变、定点诱变、及重组表达，以及各种蛋白质的修饰技术。 这方面有众多的现有技术文件可供参考，包括例如Maniatis和 Sambrook等，《分子克隆实验指南》，第2版，1989。
在一个实施方案中，所述脂肪酶来源于微生物，包括但不限于细菌 和酵母。在一个实施方案中，所述脂肪酶来源于细菌，如假单胞菌属
(T^"o附( w"s1 )， 优选荧光假单胞菌(i^M^附0Wflsy7"omscewce )。 在 一个实施方案中，所述脂肪酶来源于酵母，尤其来源于酵母属
(5ViccAflro附j;c")、假丝酵母属(CVi"福")和/或亚罗酵母属(Ki/r歸/fl )， 优选来源于选自以下的酵母解脂假丝酵母(CViw</iV/fl/i>^^/cfl)、南极 假丝酵母(CVi/k/iV/" )、 亚罗解月旨酵母(FflfT歸/fl )，
特别是来源于解脂假丝酵母。此处所述"来源"表示表达脂肪酶基因的 原始起源。例如，对于从A生物脂肪酶基因在B生物中表达而获得的 脂肪酶，本发明中认为是来源于A生物。例如，本发明的脂肪酶可以来 源于解脂假丝酵母、南极假丝酵母、亚罗解脂酵母、荧光假单胞菌等中 的一种或多种。在一个实施方案中，本发明的脂肪酶来源于解脂假丝酵 母。这些以及很多其它生物中的脂肪酶是本领域已知的，它们的制备方 法可以在很多文献中发现，并且是在本领域技术人员的能力范围内。
在一个实施方案中，所述脂肪酶可以是游离的脂肪酶或固定化的脂 肪酶。
作为游离形式的脂肪酶，可以使用分离的脂肪酶，也可以使用未分 离的脂肪酶。分离的脂肪酶是指除去了初始存在环境中部分或全部污染 物的脂肪酶，包括但不限于经不同程度纯化的脂肪酶。未分离的脂肪酶是指存在于初始环境中的脂肪酶，包括但不限于含脂肪酶的发酵液及发 酵液上清。
在一个优选的实施方案中，所述脂肪酶是固定化脂肪酶。 可以使用本领域已知的方法固定化脂肪酶。例如，可以使用以下两
种方法中任一种来制备本发明的固定化脂肪酶(A )将载体和共固定剂 按质量体积比1:1-1:3的范围混合，室温晾干得到活化载体；共固定剂 为PEG6000、椰子油、吐温80、明胶、卵磷脂和疏酸镁混合物，其质量比为明 胶卵磷脂PEG6000:吐温80:硫酸镁椰子油=5: 1: 1: 2: 1: 1，镁盐 为氯化镁或硫酸镁；用脂肪酶的水溶液按1000 — 30000单位/克活化载体 与活化载体浸泡、混合、室温晾干，制得酶活为约8000 IU/g的固定化 脂肪酶；或者(B)用脂肪酶的发酵液或发酵液上清将载体浸泡、混合， 室温晾干，制得酶活为8000 IU/g的固定化脂肪酶。本发明中脂肪酶的 酶活定义为在40X:条件下，pH8.0的磷酸緩冲溶液中水解橄榄油，每 分钟释放出1 nmol脂肪酸的酶量为一个酶活单位。本发明在制备固定 化脂肪酶时，可以制成约8000 IU/g载体的水平，当然也可以其它酶活 水平制备固定化脂肪酶。这是本领域技术人员的公知常识。
此外，本发明固定化酶的制备可参见本申请人的共同待审中国发明 专利申请No. 200510112638.5。另外，在下列文献中也教导了在本发明 中使用的粗酶、固定化酶、修饰酶以及酶的发酵液等的制备TanTW， Zhang M, Wang BW， Ying CH, Deng L. Screening of high lipase producing Candida sp. and production of lipase by fermentation. Process Biochem 2003， 39(4):459画65; Mingrui Yu， Shaowei Qin, Tianwei Tan， Purification and characterization of the extracellular lipase Lip2 from Yarrowia lipolytica, Process Biochemistry 42 (2007) 384-391; Kaili Nie, Feng Xie, Fang Wang, Tianwei Tan, Lipase catalyzed methanolysis to produce biodiesel: Optimization of the biodiesel production. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 43 (2006) 142-147;以及中国发明 专利申请号02117614.0，其公开号为CN1456674; Mingrui Yu， Stefan Lange, Sven Richter, Tianwei Tan, Rolf D. Schmid High-level expression of extracellular lipase Lip2 from Yarrowia lipolytica in Pichia pastoris and its purification and characterization. Protein Expression and Purification 53 (2007) 255-263。上述文献的内容均通过 引用全文并入本文。此外，本领域技术人员将理解，酶的发酵、改造及固定化并不局限于上述文献提供的方法，普通技术人员根据本领域中的一般性知识，可 以十分容易地确定合适的酶的生产制备方法。
在本发明脂肪酶的固定化中，可以采用任何合适的载体。所述载体 可以是例如固体颗粒，如珪胶、硅藻土或分子筛，优选硅胶。或者，所 述载体可以是膜状织物或非织造布，例如天然纤维织物如棉布或化学纤 维织物如聚酯织物，尤其是膜状织物，优选为棉、尼龙、丝绸、聚酯或 纤维素的织物，其具有表面积大、吸附性强、价格便宜、稳定性好以及 可以重复利用的特点。
所用的载体硅藻土和树脂也是公知的常用载体，织物膜是市场上销 售的织物。本发明所用的发酵液例如可以是酵母类脂肪酶发酵液，用市
售的或自制备的均可。例如采用解脂假丝酵母发酵制备，发酵条件可 以是温度26"C、 pH自然、搅拌转速为300rpm、通气量为1VVM，培 养基组成可以是有机氮源、有机碳源、无机盐等组成。
在一个实施方案中，本发明织物膜的固定化脂肪酶可用于搅拌槽式 反应器，将固定化脂肪酶固定在圆柱形网架上，网架固定在转轴上一并 作为搅拌桨作轴向旋转。作为替代，也可以本领域已知的其它方式使用 固定化脂肪酶。
在一个实施方案中，本发明织物膜的固定化脂肪酶可用于固定床式 反应器，将固定化脂肪酶固定在圆柱形网架上，圆柱形网架固定在反应 器中。作为替代，也可以本领域已知的其它方式使用固定化脂肪酶。
在本发明的方法中，所述脂肪酸可以选自脂肪酸、及其混合物。 所述脂肪酸可以选自C4-C30脂肪酸，C5-C26脂肪酸，C6-C24脂肪酸， C6-C20脂肪酸，C8-C18脂肪酸，C8-C16脂肪酸，C10-C18脂肪酸， C10-C16脂肪酸，C12-C16脂肪酸，及其混合物。比如其可以是月桂酸、 肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸等，或其混合物。在本发明中，所述脂肪酸 可以是饱和或不饱和脂肪酸，优选饱和脂肪酸。
在一个实施方案中，所述脂肪酸可以是动物/植物油脂水解产生的脂 肪酸混合物或分离的脂肪酸。
在一个优选实施方案中，所述脂肪酸是棕榈酸。
在一个方面，本发明制备维生素A脂肪酸酯的反应在非水相体系中 进行。这种非水相体系是本领域技术人员已知的。例如，所述非水相体系可以是有机溶剂，或者还可以是离子液体。本文所述的离子液体是指
由带正电离子和带负电离子构成并且在-100lC至200C之间均呈液体状 态的物质。理论上在离子液体中没有电中性的分子，而全部是阴离子和 阳离子。
在非水相体系中的酶催化作用优于水中的酶。有机溶剂能保持较低 的水分活度，可以降低酯化和水解反应的热力学和动力学障碍。而且有
机底物在有机溶剂中具有较高的溶解度从而可以提高反应速度。因此， 在非水体系中的酯化反应可实现高转化率，简化分离工艺。
在一个实施方案中，所述有机溶剂可以是芳香烃及其衍生物、卣代 烷烃及其衍生物、直链和支链烷烃、环烷烃等、或其混合物。例如，所 述有机溶剂是苯、甲苯、二甲苯、氯甲烷、二氯曱烷、三氯曱烷、四氯 曱烷、氯乙烷、二氯乙烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、正癸烷、环己烷、 石油醚等、或其混合物。在一个优选实施方案中，所述有机溶剂是正己 烷或石油醚。石油醚是从石油分馏而得的物质，按分馏沸程可以分成 30-60、 60-90等不同类型，其主要成分是戊烷和己烷等低级脂肪族烷烃。
在一些实施方案中，本发明的非水相体系可以含水或者不含水。例 如，所述非水相体系的含水量可以是0-10%,优选0-5%,更优选0-2%， 最优选0-1%.
在一个优选实施方案中，所述有机溶剂是含水量0-1%的石油醚。 例如，可以是含水量为0、 0.1%、 0.2%、 0.3%、 0.4%、 0.5%、 0.6%、 0.7%、 0.8%、 0.9%、 1.0%的石油醚。
在一个方面，本发明的反应体系中可以加入吸水剂以除去水分，比 如硅胶、分子筛、吸水树脂等。本文所述的硅胶是指无机硅胶，其主要 由二氧化硅组成，具有很强的吸附能力，是一种常用的色镨分离载体。 硅胶根据其孔径的大小可分为大孔珪胶、粗孔硅胶、介孔硅胶、细孔硅 胶等。分子筛是一种具有立方晶格的硅铝酸盐化合物，主要由硅铝通过 氧桥连接组成空旷的骨架结构，在结构中有很多孔径均匀的孔道和排列 整齐、内表面积很大的空穴。这些微小的孔穴直径大小均匀，能把比孔 道直径小的分子吸附到孔穴的内部中来，而把比孔道大得分子排斥在夕卜， 因而能把形状直径大小不同的分子，极性程度不同的分子，沸点不同的 分子，饱和程度不同的分子分离开来，即具有"筛分"分子的作用，故 称为分子筛。分子筛吸湿能力极强，保存时应避免直接暴露在空气中。 吸7jC树脂是指各种具有吸水能力的高分子聚合物，比如聚丙烯酸、纤维 素及其衍生物等。
在本发明的维生素A脂肪酸酯制备反应中，维生素A和脂肪酸的摩 尔比可以是任意可用的比例，例如考虑到原料成本而优选不超过1:1。 在一个实施方案中，维生素A和脂肪酸的摩尔比可以在1:1-1:5的范 围，例如在1:1-1:3的范围。但是在本发明中，维生素A和脂肪酸的 摩尔比并不限于该范围，例如其摩尔比可以大于1:1或者小于1:5。在 本发明的方法中，1:1以及甚至更高摩尔比的维生素A和脂肪酸仍然可 以得到优异的维生素A转化率。比如，在实施例2中，l:l摩尔比的维 生素A和棕榈酸得到90°/。的维生素A转化率。
在本发明的维生素A脂肪酸酯制备反应中，脂肪酶的用量可以是任 意合适的量。脂肪酶的用量与多种因素相关，这些因素包括但不限于维 生素A的量和浓度、脂肪酸的量和浓度、两种底物的摩尔比、反应体系、 反应温度、反应时间、脂肪酶自身的比活性、脂肪酶来源等。在一个实 施方案中，固定化脂肪酶的用量是维生素A质量的0.2-5倍。例如， 可以是0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.8倍、1倍、2倍、3倍、4倍、 5倍以及其间的任何比例。在一个具体实施方案中，固定化脂肪酶的用 量不限于此。
在本发明维生素A脂肪酸酯的制备反应体系中，其反应温度可以是 能进行反应的任何温度。最适反应温度与具体的反应条件有关，比如脂 肪酶来源、脂肪酶浓度、底物类型、有机溶剂、反应时间等。例如，反 应温度可以是20-50X:， 25-45X:， 30-40t:， 30-37X:等。在一个具 体实施方案中，反应温度可以是151C， 20X:， 25n， 30"C， 35"C， 37
40X:， 45"C， 50匸等，例如是30"C。在反应期间，反应温度可以保 持恒定，或者按照一定规律变化。 一般来说，在反应期间保持反应温度 恒定。
在本发明维生素A脂肪酸酯的制备反应体系中，其反应时间可以是 能进行反应的任何时间长度，这可以根据实际需要来设定。对于期望达 到的转化率和其它期望效果，具体的反应时间与多种反应条件有关，比 如脂肪酶来源、脂肪酶的量和浓度、底物类型和底物量、有机溶剂等。 例如，反应时间可以是1分钟-l周，5分钟-2天，或10分钟-1天 等。在一个具体实施方案中，反应时间可以是l分钟，2分钟，3分钟， 4分钟，5分钟，6分钟，7分钟，8分钟，9分钟，IO分钟，15分钟，20分钟，30分钟,40分钟，50分钟，l小时，2小时，3小时，4小时， 5小时，6小时，7小时，8小时，9小时，IO小时，12小时，15小时， 18小时，20小时，24小时，2天，3天，4天，5天，6天，或7天等。
在一个方面，本发明提供一种在非水相体系中用固定化脂肪酶催化 维生素A和脂肪酸反应来制备维生素A脂肪酸酯的方法。
在一个实施方案中，将底物维生素A和脂肪酸，按摩尔比在l:l-1:5的范围，与有机溶剂和固定化脂肪酶混合，固定化脂肪酶的用量是 维生素A质量的0.3-5倍，在20-50匸的条件下，反应1-24小时， 取出固定化脂肪酶，反应液经过分离、结晶得到维生素A脂肪酸酯；有 机溶剂是含水量为0-1%的石油醚；固定化脂肪酶是固定在载体上的酵 母类脂肪酶，例如解脂假丝酵母脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶等。
由本发明得到的产品色泽浅，品质高，成本低。为脂肪酸酯的工业 化生产提供了一种新方法。
本发明与传统的化学合成法相比，本发明的方法反应条件温和、能 耗低，大大降低了生产成本。同时本发明使用生物催化剂，反应特异性 强、副产物少。产品具有色泽浅、品质高的特点。
本发明与使用维生素A醋酸酯作底物的合成方法相比，具有以下优 点1、有更高的转化率；2、反应时间缩短；3、脂肪酶比如固定化酶 可以重复使用，从而其使用寿命延长；4、维生素A与脂肪酸的摩尔比 可以更小，减少过量脂肪酸的量。
实施例
下面将结合一些具体实施例来进一步描述本发明。需要注意的是， 这些具体实施例只是作为举例说明，而不应理解为对本发明要求保护范 围的限制。此外，还提供了比较实施例，以进一步举例说明本发明相对 于当前所用方法的优点。
本发明实施例中所用脂肪酶是参考申请人的中国发明专利申请No. 200510112638.5以及Tan TW， Zhang M, Wang BW， Ying CH, Deng L. Screening of high lipase producing Candida sp. and production of lipase by fermentation. Process Biochem 2003;39(4):459-65中的方法制备的。
根据以下方法计算维生素A的转化率。首先对反应中生成的维生素 A棕榈酸酯进行HPLC分析，色镨条件如下色镨柱为Alltech C18
(250x4.6mm, 4.5nm);流动相为100%甲醇；检测器为岛津10A紫外 检测器；检测波长327nm;流速lml/min。用维生素A棕榈酸酯标准品 制作标准曲线，根据标准曲线用外标法计算生成维生素A棕榈酸酯的质 量，然后根据以下方程计算维生素A的转化率
维生素A的转化率=(m/M) / ( m。/MQ) x 100%
其中，m为生成维生素A棕榈酸酯的质量(g); M为维生素A棕榈酸 酯的分子量524.9 (g/mol); m。为底物维生素A的质量(g); M。为维 生素A的分子量328.4 ( g/mol )。
实施例1:
1. 脂肪酶的固定化
棉布和共固定剂按质量体积比1:1的比例混合(W:V)，室温晾干， 得到活化载体；共固定剂为PEG6000、椰子油、吐温80、明胶、卵磷脂和疏 酸镁混合物，其质量比为明胶卵磷脂PEG6000:吐温80:硫酸镁椰子油 =5: 1: 1: 2: 1: 1。用解脂假丝酵母脂肪酶的发酵液按8000 IU/g活化载 体的比例与活化载体浸泡、混合、室温晾干，制得酶活为8000 IU/g的 固定化脂肪酶。
2. 催化合成维生素A棕榈酸酯
将底物0.160g (0.56mmo1)维生素A和0.429g ".68mmo1)棕榈 酸与10ml含水量为0.5%的石油醚溶剂和0.3g固定化脂肪酶混合，加 入0.5g珪胶，在温度30t:的条件下，摇床中(l卯r/min),反应8小时， 转化率为95%;将反应液除去固定化脂肪酶、硅胶，减压蒸发除去溶剂 石油醚，得到粗品维生素A棕榈酸酯，再用甲醇在3on下多次洗涤粗 品维生素A棕榈酸酯，离心，弃去上清液，经真空干燥后得到纯化的维 生素A棕榈酸酯，进一步结晶得到浅黄色维生素A棕榈酸酯晶体。
实施例2:
操作步骤同实施例1，不同之处在于0.429g (1.68mmol)棕榈酸 改为0.143g (0.56mmol)，底物摩尔比(维生素A/棕榈酸)为l.'l;转 化率为93%。
实施例3:
操作步骤同实施例l，不同之处在于0.429g(1.68mmol)棕榈酸改为 0.286g (1.12mmol)，底物摩尔比(维生素A/棕榈酸)为1:2;转化率为
93%。 实施例4:
0.429g(1.68mmol)棕榈酸改为0.527g(2.24mmo1)，底物摩尔比(维生 素A/棕榈酸)为1:4;转化率为94%.
实施例5:
操作步骤同实施例l，不同之处在于0.429g(1.68mmol)棕榈酸改为 0.715g(2.8mmol),底物摩尔比(维生素A/棕榈酸)为1:5;转化率为95%。
实施例6:
操作步骤同实施例l，不同之处在于0.3g固定化脂肪酶改为0.05g 固定化脂肪酶；转化率为91.5%。
实施例7:
抹作步骤同实施例l，不同之处在于0.3g固定化脂肪酶改为O.lg 固定化脂肪酶；转化率为94%。
实施例8:
操作步骤同实施例l，不同之处在于0.3g固定化脂肪酶改为0.2g 固定化脂肪酶；转化率为95%。
实施例9:
操作步骤同实施例l，不同之处在于0.3g固定化脂肪酶改为0.4g 固定化脂肪酶；转化率为95%。
实施例10:
操作步骤同实施例l，不同之处在于0.3g固定化脂肪酶改为0.5g 固定化脂肪酶；转化率为95%。
实施例11:
操作步骤同实施例l，不同之处在于温度30t:改为温度25iC;转 化率为93%。
实施例12:
操作步骤同实施例l，不同之处在于温度30n改为温度40lC;转 化率为89%。
实施例13:
操作步骤同实施例l，不同之处在于温度30"C改为温度50n;转 化率为78%。
实施例14:
操作步骤同实施例1，不同之处在于反应时间8h改为反应时间 0.5h;转化率为94.7%.
实施例15:
操作步骤同实施例1，不同之处在于反应时间8h改为反应时间 lh;转化率为96%。
实施例16:
操作步骤同实施例1，不同之处在于反应时间8h改为反应时间 2h;转化率为95%。
实施例17:
操作步骤同实施例1，不同之处在于反应时间8h改为反应时间 4h;转化率为95%。
实施例18:
操作步骤同实施例1，不同之处在于反应时间8h改为反应时间 6h;转化率为94%。
实施例19:
操作步骤同实施例l，不同之处在于加入0.5经硅胶改为加入0.38 珪胶；转化率为94%。
实施例20:
操作步骤同实施例l，不同之处在于加入0.5g珪胶改为加入0.8g 硅胶；转化率为95%。
实施例21:
操作步骤同实施例1，不同之处在于加入0.5g硅胶改为不加硅胶； 转化率为91%。
实施例22:
操作步骤同实施例1，不同之处在于加入0.5g硅胶改为不加硅胶， 0.3g固定化脂肪酶改为0.05g固定化脂肪酶；转化率为61.5%。
实施例23:
操作步骤同实施例1，不同之处在于加入0.5g硅胶改为不加硅胶， 0.3g固定化脂肪酶改为O.lg固定化脂肪酶；转化率为74.2%。
实施例24:
操作步骤同实施例1，不同之处在于加入0.5g硅胶改为不加硅胶， 0.3g固定化脂肪酶改为0.2g固定化脂肪酶；转化率为86%。
实施例25:
操作步骤同实施例1,不同之处在于加入0.5g硅胶改为不加珪胶， 0.3g固定化脂肪酶改为0.4g固定化脂肪酶；转化率为卯％。
实施例26:
操作步骤同实施例1，不同之处在于加入0.5g硅胶改为不加硅胶， 反应时间8h改为反应时间0.5h;转化率为70%。
实施例27:
操作步骤同实施例1，不同之处在于加入0.5g硅胶改为不加硅胶， 反应时间8h改为反应时间lh;转化率为84%。
实施例28:
操作步骤同实施例1，不同之处在于加入0.5g硅胶改为不加珪胶， 反应时间8h改为反应时间2h;转化率为卯％。
实施例29:
操作步骤同实施例1，不同之处在于加入0.5g硅胶改为不加珪胶， 反应时间8h改为反应时间4h;转化率为卯％。
实施例30:
操作步骤同实施例1，不同之处在于加入0.5g硅胶改为不加硅胶， 反应时间8h改为反应时间6h;转化率为91%。
实施例31:
操作步骤同实施例1,不同之处在于加入0.5g硅胶改为不加硅胶, 反应时间8h改为反应时间lh;转化率为84%。实施例32:
将解脂假丝酵母脂肪酶的发酵液按实施例1的方法固定化，制得酶 活为8000IU/g的固定化脂肪酶；再将底物0.160g (0.56mmol)维生素 A和0.429g(1.68mmol)棕榈酸与10ml含水量为0.5%的石油醚溶剂和
lg固定化脂肪酶混合，加入0.8g硅胶，在温度3ox:的条件下，摇床中 (190r/min)，反应4小时，转化率为95%;取出固定化脂肪酶，晾干 放入新的上述反应体系中，反应4小时，转化率为96%;重复上述操作 50次，转化率一直保持92%以上，即固定化脂肪酶能重复使用50次， 而转化率保持92%以上。
比较实施例1
将解脂甲丝酵母脂肪酶的发酵液按实施例1的方法固定化，制得酶 活为8000IU/g的固定化脂肪酶；再将底物O.lOOg ( 0.3mmo1)维生素A 醋酸酯和0.234g(0.9mmol)棕榈酸与10ml含水量为0.5%的石油醚溶剂 和0,3g固定化脂肪酶混合，在温度30"C的条件下，摇床中(l卯r/min)， 反应24小时，转化率为80%;取出固定化脂肪酶，反应液经过分离、 结晶得到浅黄色维生素A棕榈酸酯晶体。
比较实施例2
操作步骤同比较实施例1，不同之处在于0.234g棕榈酸改为0.078g, 底物摩尔比(维生素A醋酸酯/棕榈酸)1: 1;转化率为49%。
比较实施例3
操作步骤同比较实施例1 ，不同之处在于0.234g棕榈酸改为0.156g， 底物摩尔比(维生素A醋酸酯/棕榈酸)1: 2;转化率为60%。
比较实施例4
操作步骤同比较实施例l，不同之处在于反应24小时改为反应1 小时；转化率为25%。
比较实施例5
操作步骤同比较实施例l,不同之处在于反应24小时改为反应3 小时；转化率为55%。
比较实施例6
操作步骤同比较实施例1，不同之处在于反应24小时改为反应12小时；转化率为79%。 比较实施例7
将解脂假丝酵母脂肪酶的发酵液按实施例l方法固定化，制得酶活 为8000IU/g的固定化脂肪酶；再将底物O.lOOg (0.3mmol)维生素A 醋酸酯和0.234g (0.9mmol)棕榈酸与10ml含水量为0.5%的石油醚溶 剂和0.3g固定化脂肪酶混合，在温度30"C的条件下，摇床中(l卯r/min)， 反应12小时，转化率为80%;取出固定化脂肪酶，晾干放入新的上述 反应体系中，反应12小时，转化率为80%;重复上述操作，第5次， 转化率为75%;重复上述操作，第6次，转化率60%;重复上述操作， 第7次，转化率为55%;重复上述操作，第8次，转化率为45%。
本领域一般技术人员可以在了解本发明所公开内容的基础上，对本发 明所公开的技术方案进行各种补充、修改、变化和替换等，这些补充、修 改、变化和替换等也都在本发明权利要求
的保护范围内。
权利要求
1.一种制备维生素A脂肪酸酯的方法，其包括利用脂肪酶催化维生素A与脂肪酸反应的步骤。
2. 权利要求
l的方法，其中所述脂肪酶是固定化脂肪酶。
3. 权利要求
2的方法，其中所述固定化脂肪酶的固定化载体选自 固体颗粒或者膜状天然或非天然纤维织物或非织造布，比如硅胶、硅藻 土、树脂、棉布、以及聚酯、尼龙、丝绸和纤维素的织物和非织造布， 优选地选自棉布、以及尼龙、丝绸、聚酯或纤维素的织物和非织造布。
4. 权利要求
1的方法，其中所述脂肪酶来源于微生物，例如来源于细菌，如假单胞菌属(Pseudomonas)，优选荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescence),或者来源于酵母, 尤其来源于酵母属 (Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)和/或亚罗酵母属(Tarrowia)， 优选来源于选自以下的酵母解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、南极 假丝酵母(Candida antarctica)、 亚罗解月旨酵母(Yarrowia lipolytica), 特别是来源于解脂假丝酵母。
5. 权利要求
1的方法，其中所述脂肪酸选自C4-C18脂肪酸及其 混合物，优选C5-C18脂肪酸及其混合物，更优选C6-C16脂肪酸及其 混合物，尤其优选C8-C16脂肪酸及其混合物，比如月桂酸、肉豆蔻酸、 棕榈酸、硬脂酸及其混合物、动物/植物油脂水解产生的脂肪酸混合物 或分离的脂肪酸，最优选棕榈酸。
6. 权利要求
1的方法，其中所述反应在非水相体系中进行。
7. 权利要求
6的方法，其中所述非7jC相体系的含水量为0-5%， 优选0-3%，更优选0-2%，最优选0-1%,比如是0、 0.1%、 0.2%、 0.3%、 0.4%、 0.5%、 0.6%、 0.7%、 0.8%、 0.9%、 1.0%或其间的任意数值。
8. 权利要求
6的方法，其中所述非水相体系是有机溶剂，优选所 述有机溶剂选自苯、甲苯、二甲苯、氯曱烷、二氯甲烷、三氯甲烷、 四氯甲烷、氯乙烷、二氯乙烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、正癸烷、环 己烷、石油醚等、或其混合物，更优选选自正己烷或石油醚。
9. 权利要求
l的方法，其中维生素A和脂肪酸的摩尔比可以是任 意合适的比例，优选不超过l:l,更优选在1:1-1:5范围内，最优选在 1:1-1:3范围内。
10. 权利要求
l的方法，其中脂肪酶的用量是维生素A质量的0.2 -5倍，例如03-4倍，0.511. 权利要求
6的方法，其中在所述非水相体系中加入固体颗粒载 体，例如硅胶、硅藻土或分子筛，优选硅胶。
12. 权利要求
l的方法，其中所述反应在20-50℃;、优选25-45 ℃、更优选30-40℃、尤其优选30-37℃条件下进行，例如在30℃进 行。
专利摘要
本发明涉及一种生产维生素A脂肪酸酯的方法。更具体地说，本发明提供一种用脂肪酶催化维生素A与脂肪酸反应合成维生素A脂肪酸酯的方法，特别是在非水相体系中用固定化微生物脂肪酶催化反应合成维生素A脂肪酸酯的方法。在本发明所公开的方法中，脂肪酶用量少，反应时间短，维生素A转化率高，脂肪酸用量少，脂肪酶使用寿命长等优点，从而降低了生产成本，有利于工业化生产。
文档编号C12P7/62GKCN101200740SQ200710179808
公开日2008年6月18日 申请日期2007年12月18日
发明者李宏亮, 晶 胡, 谭天伟 申请人:北京化工大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan