一种芳香烃羟化酶系统及应用的制作方法

专利名称：:一种芳香烃羟化酶系统及应用的制作方法一种芳香烃羟化酶系统及应用
技术领域：
：本发明涉及一种酶系统及应用，尤其涉及一种芳香烃羟化酶系统及应用。
背景技术：
：芳香烃类化合物是一类重要的环境污染物，它们广泛来源于石油冶炼、农药生产、印染化工、汽车尾气等工农业的生产、运输等各个过程。芳香烃类化合物对环境的污染是人们关注的重点,不仅因为它具有较强的毒性和抗降解能力,而且一些芳烃具有致畸、致癌、致突变的作用,并可在生物体内富积。环境中常见的芳香烃化合物根据其化学结构来分，主要有苯、甲苯、二甲苯等结构简单的单环芳烃化合物、硝基取代芳香烃化合物、卤化硝基取代芳香经化合物、多环芳香烃化合物(PAH)及重质多环化合物(HMWPAH)及其衍生物等。目前主要采用物理、化学和生物方法对环境污染进行处理，其中生物法因具有处理成本低、操作简便、污染物降解效果好、不易引起二次污染等特点而得到广泛应用。利用微生物的降解作用来消除芳香烃类化合物对环境的影响是环境治理的一条有效途径。长久以来，人们从各个角度研究微生物对芳香烃类化合物的降解，包括高效降解微生物的筛选和分离、芳香烃化合物的降解途径、微生物降解的遗传学研究，芳香族化合物的定量结构与生物降解相关性等等。但是，芳香烃化合物来源广泛，种类多样，另一方面，自然界中能够降解芳香烃类化合物的微生物种属也是多种多样，每种微生物的降解机理都是千差万别，要全面而详细地阐明芳香烃类化合物的微生物降解是相当困难的。从目前分离的微生物种类来看，绝大部分属于细菌。微生物降解芳香烃类化合物的分子机制和基因水平的研究是目前的热点之一，欧美、日本等多个国家已经在这方面取得一些的进展，但对于整个降解途径的系统的阐述还有待于进一步的研究。国内在这个领域的研究还基本处于宏观层面，对于基因功能的研究较少报道。普遍认为，微生物对芳香烃的降解因其作用环境而分为有氧降解和厌氧降解。有氧降解以分子氧作为最终电子受体,而厌氧降解以除氧以外的物质如硝酸盐、硫酸盐、二氧化碳或铁等作为最终电子受体。对于单环芳香类化合物的降解研究表明，常规培养的好氧微生物能产生混合功能的氧化酶或双氧化酶,这些酶在分子氧的参与下,使苯环羟基化,并进一步引发芳环裂解，所以能有效地降解芳香烃化合物。土壤中石油芳香烃降解速率因化学结构的不同而不同。苯、酚、萘、甲苯、邻胺基苯酸、扁桃酸等经微生物氧化分解，生成儿茶酚；而苯甲酸、m-甲酚、m-硝基苯酸、p-硝基苯酸、p-甲氧基苯酸、奎尼酸、莽草酸、香草酸等，经微生物氧化降解为原儿茶酚，有少量m-甲酚可通过另一途径降解为龙胆酸。微生物对芳香烃降解的起始途径是多样的，但关键性的中间产物具有一致性。邻苯二羟基类化合物儿茶酚和原儿茶酚就是大多数芳香化合物在微生物代谢过程中的中间产物，又是环开裂前共同的先导性中间产物(ChaudhryGR，ChakrabartyAM，Biodegradationofhalogenatedorganiccompounds.Microbiol.Rev.1991.55:59-79，Gibson,D.T"andV.Subramanian.1984,Microbialdegradationofaromatichydrocarbons,p.181-252.InD.T.Gibson(ed)，Microbialdegradationoforganiccompounds.MarcelDekker，Inc.,NewYork.)。关键性中间产物进一步的生物降解途径也是多样的，儿苯酚和原儿茶酚的环若按邻位断开，生成(3-酮己二酸，然后进一步代谢；儿茶酚和原儿茶酚的环若按间位断开,则生成丙酮酸和乙醛。目前已报道的单环芳香烃羟化酶主要有以下三大类单一组分的黄素羟化酶、二蛋白或多蛋白单加氧酶催化。这些酶系统大多由还原酶和单加氧酶组成。还原酶使黄素还原，单加氧酶利用还原的黄素使芳香底物羟基化。这种羟基化作用常见于有氧降解途径的起始步骤。第一种被纯化的羟化酶来源于尸"^/omo"os.，&fe，较小的蛋白与FAD紧密结合，较大的蛋白是羟基化作用偶联蛋白。已报道与NADH的反应和与氧、底物的反应发生在黄素蛋白组分上。户/w^fe中HPAH的机制似乎与单组分的芳香黄素蛋白羟化酶机制类似，只是前者需要两个蛋白。第二种羟化酶系统分离于五.co//『，它包含一个黄素还原酶，其催化产生还原性FAD被转移到大的羟化酶上使其芳香组分羟基化。在这一反应中，黄素还原酶可被不同的黄素还原酶替换。第三种羟化酶系统分离于尸"wdowo"oswe"(io"'"a，它除了包含一个较小的还原酶组分和一个较大的加氧酶组分之外，还包含一个在电子传递链中连接还原酶和加氧酶的铁氧化还原蛋白。该羟化酶系统通过还原酶催化生成的NADH使铁氧化还原蛋白酶被还原传递电子到终端加氧酶催化底物发生双加氧作用。目前关于单环芳香烃羟化酶基因的专利报道主要有徐玉泉等人报道了一种苯酚羟化酶基因及其用途(专利公开号CN1500802A)，公开了一种可将苯酚转化为邻苯二酚的代谢编码基因；陈国强等人报道了一种表达苯环双加氧酶的工程菌及其应用(专利公开号CN1869200A)，公开了一种苯环双加氧酶的专用表达工程菌与该工程菌在生产顺-1，2-二羟基-3，5-环己二烯中的应用。鉴定过的芳香烃羟化酶基因相关文章主要有尸sewt/固o"as/7wf油、￡^c/ze"'c/z/aco/z,禾口v4"'weto6a"erZa簡朋m7中p-轻基苯乙酸3-羟化酶(HPAH)(Arunachalam,U.，Massey,V.,andVaidyanathan,C.S.1992.J.Biol.Chem.267，25848—25855;Galan，B.,Diaz，E.，Prieto,M.A.，andGarcia,J.L.2000.J.Bacteriol.182，627—636;Chaiyen,P.,Suadee,C.,andWilairat，P.2001.Eur.J.Biochem.268，5550—5561),Wearaf/zermc^/zz'/z^BR219禾口5acz'〃wsAermog/Mcow'fias/wA7中苯酚夢5"(七酶(PheA)(Kim,I.C.,andOriel，RJ.1995.Appl.Environ.Microbiol.61,1252—1256;Kirchner,U.,Westphal，A.H.，Muller,R.,andvanBerkel,W.J.H.2003.J.Biol.Chem.278，47545~47553)，5w狄o/^W(3ce/ac/aAC1100中氯酚画4-单加氧酶(Gisi，M.R.，andXun，L.2003.J.Bacteriol.185,2786—2792),Aa&to"/fle^ra//zaJMP134中2，4，6-三氯苯酚单加氧酶(Louie,T.M.，Webste,C.M.,andXun，L.2002.J.Bacteriol.184,3492—3500),iWococ，中吡咯-2-羧酸酯单加氧酶(Becker,D.，Schrader,T.,andAndreesen,J.R.1997.Eur.J.Biochem.249,739—747)，尸^wfifowo"osVLB120中苯乙烯单加氧酶(Otto，K.，Hofstetter，K.,Rothlisberger,M.，Witholt，B,，andSchmid,A.2004.J.Bacteriol.186,5292—5302;Kantz,A.，Chin,R,Nallamothu,N,，Nguyen，T.,andGassner，G.T.2005.Arch.Biochem.Biophys.442，102—116),5ac/〃z^/zaen'cws中p-石肖基苯酚羟化酶(Kadiyala,V.，andSpain,J.C.1998.Appl.Environ.Microbiol.64，2479—2484)。
发明内容本发明的一个目的是提供一种芳香烃羟化酶系统，其包括NADH依赖的FMN还原酶，FAD合成酶和芳香族化合物羟化酶。其中上述的NADH依赖的FMN还原酶、FAD合成酶和芳香族化合物羟化酶的编码基因依次分别具有a)SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；或b)不同于SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3但编码的氨基酸序列与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；或c)在严格杂交条件下与所述的a)或b)中的序列杂交，并且编码具有活性的所述的芳香烃羟化酶系统的核苷酸序列。上述的NADH依赖的FMN还原酶、FAD合成酶和芳香族化合物羟化酶具有d)上述a)、b)或c)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或e)SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和或f)上述e)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后、并且具有所述的NADH依赖的FMN还原酶、FAD合成酶和芳香族化合物羟化酶的活性的氨基酸序列。本发明的较佳实施例中，上述的芳香烃羟化酶系统于嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2中分离得到。本发明的较佳实施例中，上述的芳香烃羟化酶系统的底物包括邻氨基苯甲酸、2-羟基苯乙酸、4-羟基苯乙酸、水杨酸中的至少一种，其中最适底物是邻氨基苯甲酸。本发明的较佳实施例中，上述的芳香烃羟化酶系统的反应温度为25°C-100°C，其中最适反应温度为6(TC。本发明的较佳实施例中，上述的芳香烃羟化酶系统的反应pH值为3.2-11.0，其中最适反应pH值为9.0。本发明的另一目的是提供一种表达芳香烃羟化酶系统的重组质粒，其至少包括上述的NADH依赖的FMN还原酶、FAD合成酶和芳香族化合物羟化酶的编码基因。本发明的较佳实施例中，上述的重组质粒的载体为pET-28a(+)。本发明的另一目的是提供一种产生芳香烃羟化酶系统的重组菌，其中导入了上述的NADH依赖的FMN还原酶、FAD合成酶和芳香族化合物羟化酶的编码基因。本发明的较佳实施例中，上述的重组菌为大肠杆菌，优选为大肠杆菌BL21菌株。本发明的另一目的是提供上述的芳香烃羟化酶系统的应用，其可用于降解单环芳香烃化合物或氨基取代芳香烃或其衍生物中的至少一种。应当指出的是，上述提到的术语"严格条件"在本说明书中的含义是指在该条件下形成了所谓特异杂交而没有形成非特异的杂交。例如，该严格条件可以是，相互之间的同源性不小于70%的DNA之间可以杂交而低于上述数值的DNA之间不能杂交，优选的是同源性不少于90%的DNA之间可以杂交。相对于Southern杂交中普通洗漆条件而言，可以例如为如下的杂交条件将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0,7%SDS)中，50。C预杂交30分钟；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0，7%SDS，同位素标记的核苷酸片段)，5(TC杂交12小时后；弃杂交液，加入洗膜液I(2xSSC和0.1。/。SDS)，50。C洗膜2次，每次30分钟；加入洗膜液II(0.5xSSC和0.1。/。SDS)，5CTC洗膜30分钟。所属
技术领域：
：的技术人员应该知道，本发明的编码芳香烃羟化酶系统的DNA序列，还包括编码对SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示核苷酸序列所表达的酶分子的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失并仍具有该酶活性的蛋白质的核苷酸序列。另外，对本发明的芳香烃羟化酶系统基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的蛋白质，也能达到本发明的目的。因而本发明还包括与SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的氨基酸序列具有至少70%的同源性，优选具有至少90%的同源性，但同时具有芳香烃羟化酶系统活性的蛋白质。上面使用的术语"多个"可以是小于100的数目，优选为小于10的数目。本发明的嗜热脱氮芽孢杆菌(Geo^"7/usAwwocfew/^/cara)NG80-2中分离的羟化酶系统与类似的羟化酶系统有很大不同。NG80-2的羟化酶系统是一个三蛋白酶系统，它包括一个NADH依赖的FMN还原酶(GT3158基因编码)，一个FAD合成酶(GT3159基因编码)和一个芳香族化合物羟化酶(GT3160基因编码)(如图1)。FAD合成酶催化FMN合成FAD。NADH依赖的FMN还原酶是具有FAD结合域的黄素蛋白酶，可以还原FAD。底物再通过还原性FAD被芳香化合物羟化酶所催化(如图2)。和己知的芳香烃羟化酶系统相比，本发明提出的芳香烃羟化酶系统是一种新型的芳香烃羟化酶系统，是目前唯一已纯化蛋白并鉴定基因功能的耐高温芳香烃羟化酶系统，该酶系统由三个具有单独功能的蛋白组分组成，能在高温碱性条件下降解单环芳香烃化合物。通过对本发明提出的芳香烃羟化酶系统基因推导的氨基酸序列比较分析，本发明的芳香烃羟化酶系统与其它已报道的酶的氨基酸序列相比，绝大多数相似性均小于41%。相似性高于41%的芳香烃羟化酶系统都未做功能鉴定。其中，与GT3158相似性最高的已知蛋白为来源于尸"w^wwwospwWaS-313的SsuE(085762)(氨基酸序列一致性为41%)，与GT3159相似性最高的已知蛋白为来源于C。o^e6acfen'Mwam附om'agewas的RibF(Q59263)(氨基酸序歹U—致性为32%)，与GT3160相似性最高的已知蛋白为来源于Geo&c〃/w^ze濯og/wcoy油57'w51A7白勺phenol2-hydroxylasecomponentA(AAF66546)禾口尸yoveni/"c/zrawop/zo/-ebiosyntheticproteinPvcCfromi^ei^omowas(030372)(氨基酸序列一致性均为34%)。由此可见，本发明的芳香烃羟化酶系统与其它已报道的芳香烃羟化酶的氨基酸序列相比后，相似性大于41%的已发现菌株中，基本上都进行了序列比对的研究，没有发现对相应菌株的芳香烃羟化酶基因的功能进行鉴定的相关文献。本发明的芳香烃羟化酶系统具有耐高温降解单环芳香化合物的能力，该酶系统的鉴定对于研究微生物的降解作用来消除芳香类化合物对环境的影响及环境治理具有重要的应用价值。该芳香烃羟化酶系统的酶资源的开发和应用具有处理成本低、操作简便、污染物降解效果好、不易引起二次污染等优点，并且其具备的耐高温稳定酶活性，可广泛应用于酶制剂工业生产和高温环境中环境污染物芳香烃的降解。同时也为深入研究嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2降解芳香化合物代谢途径的机制提供了更有力的证据。该芳香烃羟化酶系统的嗜热性及降解芳香化合物的能力具有重要的工业应用价值。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。图l是本发明的芳香烃羟化酶系统基因结构示意图；图2是本发明的芳香烃羟化酶系统降解邻氨基苯甲酸作用示意图；图3是插入本发明的芳香烃羟化酶系统中NADH依赖的FMN还原酶基因的重组质粒pLW1318的图谱；图4是插入本发明的芳香烃羟化酶系统中FAD合成酶基因的重组质粒pLW1279的图谱；图5是插入本发明的芳香烃羟化酶系统中芳香族化合物羟化酶基因的重组质粒pLW1259的图谱；图6是本发明的芳香烃羟化酶系统三组分蛋白的SDS-PAGE图；图7是本发明芳香烃羟化酶系统中FAD合成酶酶活毛细管电泳检测图；图8是本发明芳香烃羟化酶系统降解邻氨基苯甲酸酶活毛细管电泳检测图；图9表示本发明芳香烃羟化酶系统在不同温度下的比活力；图10表示本发明芳香烃羟化酶系统在不同pH值下的比活力。具体实施方式下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明。以下各实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。实施例一芳香烃羟化酶系统基因的克隆1.NG80-2总DNA的提取嗜热脱氮芽孢杆菌(Geo6ac/〃MAwmc^emYnycara)NG80-2(其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.1228，保藏日期为2004年10月09日，已申请国内发明专利并获得授权，发明名称嗜热脱氮芽孢杆菌及其筛选和应用，专利号ZL200410072759.7)总DNA的提取研究证明，由嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2基因组能够分离出编码芳香烃羟化酶系统的基因。因此，在本实施例中，采用从中国天津大港油田官69-8区块油井地层水分离获得的嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2，取其过夜培养的新鲜培养物3ml，离心收集菌体，菌体悬于250微升50mMTris缓冲液中(pH8.0)，加入10微升0.4MEDTA(pH8.0)，混匀后37。C保温20分钟，之后加入30微升20mg/ml溶菌酶，混匀后37"C再保温20分钟，再加入5微升20mg/ml蛋白酶K，温柔混匀后，再加入20微升10%SDS，5(TC保温至溶液澄清，分别用等体积酚氯仿异戊醇抽提两次，氯仿异戊醇抽提一次，最后一次的上清溶液，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，沉淀溶于100微升TE缓冲液(pH8.0，10mMTris，lmMEDTA)，加入10mg/mlRNase2微升，65。C保温30分钟，分别用酚氯仿异戊醇、氯仿异戊醇各抽提一次，上清液加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，真空干燥，沉淀溶于50微升TE缓冲液。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/A280=1.95，A260=0.73。2.本发明芳香烃羟化酶系统基因的克隆和筛选取前面所述的总DNA溶液0.5微升(约10ng)作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物(SEQIDNO:7-SEQIDNO:12)，并按下述设定的PCR循环参数进行20个循环PCR。设定的PCR循环参数如下95°C，5分钟；95°C，30秒；50°C，45秒；72°C，2分钟；72°C，5分钟；4°C，2小时引物序列如表l:表1构建克隆所需引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>上述PCR产物用表1中对应的限制性内切酶双酶切，经0.8%的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收酶切产物片断。与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a(+)连接，转化感受态大肠杆菌DH5(x后，涂于含50吗/mlKan(卡那霉素)的LB固体培养基上。37。C培养12小时，挑取单克隆转接到20mlLB培养基中进行培养(50(ig/mlKan)，37t:培养12小时后，提取质粒鉴定，插入有SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的DNA序列的pET-28a(+)质粒分别为重组质粒pLW1318(见图3)，pLW1279(见图4)和pLW1259(见图5)，将重组质粒pLW1318、pLW1279和pLW1259，分别转入表达宿主大肠杆菌BL21(该菌株可向天津开发区厚普生物技术开发有限公司订购,货号为69387-3)中，得到含有三种重组质粒的重组菌株分别为H1623、H1456和H1506,重组质粒pLW1318、pLW1279和pLW1259可高频转化大肠杆菌BL21表达芳香烃羟化酶系统所需三组分蛋白活性和抗卡那霉素性能。采用Sanger法对此DNA片段进行了测序，测序结果显示pLW1318、pLW1279和pLW1259中的插入片段分别含有长558bp(SEQIDNO:1)、540bp(SEQIDNO:2)和1485bp(SEQIDNO:3)的开放阅读框架，分别编码由185(SEQIDNO:4)、179(SEQIDNO:5)和494(SEQIDNO:6)个氨基酸组成的蛋白质。实施例二芳香烃羟化酶系统三组分蛋白的纯化和特性将上述重组菌H1623、H1456和H1506单克隆分别接入20ml含50^ig/mlKan的LB培养基中，37°C，180rpm/min培养12小时，然后将培养物按1%(v/v)接种量分别接入200ml含50pg/mlKan的LB培养基(共IO个摇瓶)，37°C，220rpm/min培养OD600为0.6时，分别加入IPTG至终浓度为O.lmM，45°C，180rpm/min诱导2.5小时。分别离心收集菌体，悬于含50mMTris-HCl(pH8.0)缓冲液中，利用超声波破碎细胞，离心上清液分别为芳香烃羟化酶系统三个组分的粗提液。将上述三个组分的上清液经螯合琼脂糖凝胶(ChelatingSepharose)镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上均显示一条带(见图6)。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此芳香烃羟化酶系统的基本特性。用SDS-PAGE测得的重组酶的分子量分别为21000、20000和56000道尔顿，分别与理论上推算的分子量(20725、20167和56164道尔顿)相似；等电点沉淀法测得的重组酶的等电点pl分别为6.04、9.40和5.96。实施例三芳香烃羟化酶系统的活性测定1.测定本发明芳香烃羟化酶系统中NADH依赖的FMN还原酶活性对上述实施例二中制得的芳香烃羟化酶系统中NADH依赖的FMN还原酶活性进行测定，具体方法为配制lml反应体系，MgCb的终浓度为5mM，NADH的终浓度为100pM，FMN或FAD的终浓度为100(xM，一定浓度的NADH依赖的FMN还原酶，用20mMpH7.6的磷酸钾缓冲液补至50pl。混匀，在60。C水浴中反应IO分钟，反应结束后，冰浴5分钟，终止反应。然后在340nm处测定光吸收。以每分钟消耗生成lpmol底物NADH(s34Qnm=6,220M—1cm—1)所需酶量定义为1个酶活力单位。2.测定本发明芳香烃羟化酶系统中FAD合成酶活性对上述实施例二中制得的芳香烃羟化酶系统中FAD合成酶活性进行测定，具体方法为配制50^d反应体系，MgCl2的终浓度为5mM，NADH的终浓度为2mM，FMN的终浓度为lmM，ATP的终浓度为3mM，一定浓度的FAD合成酶，用20mMpH7.6的磷酸钾缓冲液补至50pl。混匀，在6(TC水浴中反应IO分钟，反应结束后，冰浴5分钟，终止反应。然后用CE检测产物FAD的生成(见图7)。以每分钟生成lnmol产物所需酶量定义为1个酶活力单位。3.测定本发明芳香烃羟化酶系统不同底物时的比活力对上述实施例二中制得的芳香烃羟化酶系统进行不同底物的测定，具体方法为配制50(il反应体系，MgCl2的终浓度为5mM，NADH的终浓度为2mM，FMN的终浓度为lmM，ATP的终浓度为3mM，分别加入2mM邻氨基苯甲酸，一定浓度的三组分芳香烃羟化酶系统，用20mMpH7.6的磷酸钾缓冲液补至50pl。混匀，在6(TC水浴中反应IO分钟，反应结束后，冰浴5分钟，终止反应。然后用CE检测3-羟基化产物的生成(见图8)。以每分钟生成lnmol产物所需酶量定义为1个酶活力单位。以邻氨基苯甲酸、2-羟基苯乙酸、4-羟基苯乙酸或水杨酸分别作为底物测定酶活，结果参见表2，从该表中可以看出，该芳香烃羟化酶系统的最适底物是邻氨基苯甲酸。表2芳香烃羟化酶系统不同底物时的比活力<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>4.测定本发明芳香烃羟化酶系统在不同温度下的比活力对上述实施例二中制得的芳香烃羟化酶系统进行最适反应温度的测定，具体方法为配制50ial反应体系，MgCl2的终浓度为5mM，NADH的终浓度为2mM，FMN的终浓度为lmM，ATP的终浓度为3mM，分别加入2mM邻氨基苯甲酸，一定浓度的三组分芳香烃羟化酶系统，用20mMpH7.6的磷酸钾缓冲液补至50^1。混匀，分别于25。C至IO(TC水浴中反应IO分钟，反应结束后，冰浴5分钟，终止反应。然后用CE检测3-羟基化产物的生成。测定结果参见图9。从该图中可以看出，该芳香烃羟化酶系统的最适反应温度约为60°C。5.测定本发明芳香烃羟化酶系统在不同pH下的比活力对上述实施例二中制得的芳香烃羟化酶系统进行最适pH值的测定，具体方法为配制50^d反应体系，MgCl2的终浓度为5mM，NADH的终浓度为2mM，FMN的终浓度为lmM，ATP的终浓度为3mM，分别加入2mM邻氨基苯甲酸，一定浓度的三组分芳香烃羟化酶系统，分别用pH3.2至pH11.0的缓冲液(配方见表3)补至50pl。混匀，在6(TC水浴中反应IO分钟，反应结束后，冰浴5分钟，终止反应。然后用CE检测3-羟基化产物的生成。测定结果参见图10，从该图中可以看出，该芳香烃羟化酶系统的最适pH值约为9.0。表3芳香烃羟化酶酶系统活测定中所用的缓冲液<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属
技术领域：
：的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围所做的更动与改进，都将落入本发明的保护范围。序列表<110>南开大学<120>—种芳香烃羟化酶系统及应用<130〉7P13010-CN<160〉12<170〉Patentlnversion3.2<210>1〈211>558<212>DNA〈213>芳香烃羟化酶系统的NADH依赖的FMN还原酶基因序列<400>1gtgaagttgttaggtatctcaggaacattagtgggcaccaagacatgcattctggtggaa60caggtgcttgtcgaggcgaagcggatctgtccggaggtagacatacaactcttgg3tttg120aaggactaccaggtggagttttgcgatggccgccaacagtcgtcctacaatgaggacaca180caaaaggtgatcgagctcgtatccgtcgctgactgctacgtgatcggcacaccgatcttc240caaggctccattaccggggcattgaagaacctgtttgatttgatcagtccccaggcacta300cggcacaaagtgatggggtttgtcgccaacggtgggacgtaccagcattatctagtgatt360gagaatcagttgaaaccaattgctatgcttcttccgggcattcgtggcacctggtagcgtc420tacgcccataccgatcatttcaatgagaaaaatgaattggttgatccggaggtacgcgag480cgcgttgcccagctcgcatgggaagtggtgcatatgcactggtcactgaagtctggtggt540gtccatgcccatcgttga558<210>2<211〉540<212>DNA<213〉芳香经羟化酶系统的FAD合成酶基因序列<400〉2atgaaggtgcatgaggcaaatcaggggttgacgctacccggctcggtggtggcgataggg60gctttcgacggagtgcaccagggtcatcaggccgtgcttcgacaggcagtggagcgcagt120cggcagctcggcgtcgagagcgtagcgtacacgattgatcccccgccccgctgtcgcttt180cagggatcgcgcatgttgacgaccttgcaggagaagctagacaggtttgctgtcttgggg240ttgaaccacgcggtggtggcccatttcgacgagcggtacgctgcgcgtcgggtggacgcg300ttcaUcgcgaactgaccgctttgaacccgcgggaggtgatcgttgggcaggactttcgc360tUggtcgcaaccgggaaggggacgtagccttgctccggcgtcacttt.cccgtgcggatc420gttcagacggtctgctgtgcggacggccaacggatctcctcaacgcgcattcgcgagttg480atcgagcggggagagtgggaacagtcgaccgtccttctggggtggccgcttagctcgtaa540<210〉3<211>1485<212〉腿〈213〉芳香烃羟化酶系统的芳香族化合物羟化酶基因序列<400〉3atgaggatggggatccgcacaggtgcccagtacatcagtggattgaagtcccggaagccagaaatctggttgagtggccgtcgcgtgatcaacgtatgcgaagaacctgtgttcaaacaaccaatccgcgaaatcgccagactctatgatatgcagcatgatcccgagtatcaggacaagattacacacatttgcacagaaaccggagagcgggtgagcaacgcgttcctggtccctaaatctcgggaggatctgctagcccgccgtgcgttgtttgaagtatgggcccgcgccacgtttggtctgatggggagaactcctgattttctcaatgtcgtgctcacctcgctgtacagcaacgcttcgtttttggaaaagtacaatccgcagtgggcggaaaacatccgt.gcgtactaccgctatgtgcgcgacaacgacctgtttttgacgcacgccatcatcaatccgcaaaacgaccggagcaagccgtcccacgaacsgcaggacacgtttacgcacctaggagtggtaagggagacgccggaggggttgattgtgagaggtgccaagatgctggccacactggcaccgatcacggacgaggtgatcatctataccttccctggatat.aagccaggtgatgagcggtacgcggtctcgtttgctatcccgatcgacacgccagggctgcgcattctctgccgagaaccaatgcaggatggcacacgcccgctgtttgaccatccgctagcatcccgcttcgaggaaatggatgcgctcttggtgttcaacgatgtgctggtgccatgggaccgggtgttcatctacaataacgtggaagcggctaacctgctctatccgaagaccggtatcgcgcagcaacctgctcatcaaacaggagtgcgcggtctgattaagctgcagttcgccaccgaagtagctattcgtttggccgattcgatcggggtggacgtctatctgaacgtgcaaaatgacctaggtgagctgctccagtcggtagaagcaatccgcgcattgctgcacctagctgaacacgaactggaggtgttgccctccggcg鄉tgatgccaggatgggtgccgcttgagacgattcgtggtctcctgcccaagctgtatccacgtgctgtgg卿tattacaaatcatcggtgccggtggcctgttgatgtccccaacgggtgccgactttgctaatccggaactagcggcagacatgg卿aatactacgctggtcgcattggagtgggcggag鄉agagggttcggctgttc咖ctggcttgggatttatgtggcgaagcatttggccagagactcctgcagtatgagcgtttctacactggcgacccgatccgc1380aagcgggcgatcttctataacaacatcaaaagggaacgtacgctcgtcatggtggatgag1440gctctgcggatgccgaatcagcaggagaaagttgtgaatgcctga601201802403003604204805406006607207808409009601020108011401200126013201485<210>4<211>185<212〉PRT<213〉芳香烃羟化酶系统的NADH依赖的FMN还原酶氨基酸序列<400〉4ValLysLeuLeuGlylieSerGlyThrLeuValGlyThrLysThrCys151015lieLeuValGluGinValLeuValGluAlaLysArglieCysProGlu202530ValAsplieGinLeuLeuAspLeuLysAspTyrGinValGluPheCys354045AspGlyArgGinGinSerSerTyrAsnGluAspThrGinLysVallie505560GluLeuValSerValAlaAspCysTyrVallieGlyThrProliePhe65707580GinGlySerlieThrGlyAlaLeuLysAsnLeuPheAspLeulieSer859095ProGinAlaLeuArgHisLysValMetGlyPheValAlaAsnGlyGly100105110ThrTyrGinHisTyrLeuVallieGluAsnGinLeuLysProlieAla115120125SerPhePheArgAlaPheValAlaProGlySerValTyrAlaHisThr130135140AspHisPheAsnGluLysAsnGluLeuValAspProGluValArgGlu145150155160ArgValAlaGinLeuAlaTrpGluValValHisMetHisT卬SerLeu165170175LysSerGlyGlyValHisAlaHisArg180185<210>5<211〉179〈22〉PRT<213>芳香烃羟化酶系统的FAD合成酶氨基酸序列<400>5MetLysValHisGluAlaAsnGinGlyLeuThrLeuProGlySerVal151015ValAlalieGlyAlaPheAspGlyValHisGinGlyHisGinAlaVal202530LeuArgGinAlaValGluArgSerArgGinLeuGlyValGluSerVal354045AlaTyrThrlieAspProProProArgCysArgPheGinGlySerArg505560MetLeuThrThrLeuGinGluLysLeuAspArgPheAlaValLeuGly65707580LeuAsnHisAlaValValAlaHisPheAspGluArgTyrAlaAlaArg859095ArgValAspAlaPhelieArgGluLeuThrAlaLeuAsnProArgGlu100105110VallieValGlyGinAspPheArgPheGlyArgAsnArgGluGlyAsp115120125ValAlaLeuLeuArgArgHisPheProValArglieValGinThrVal130135140CysCysAlaAspGlyGinArglieSerSerThrArglieArgGluLeu145150155160lieGluArgGlyGluTrpGluGinSerThrValLeuLeuGlyTrpPro165170175LeuSerSer<210>6<211>494<212>PRT<213>芳香烃羟化酶系统的芳香族化合物羟化酶氨基酸序列<400>6MetArgMetGlylieArgThrGlyAlaGinTyrlieSerGlyLeuLys151015SerArgLysProGlulieTrpLeuSerGlyArgArgVallieAsnVal202530CysGluGluProValPheLysGinProlieArgGlulieAlaArgLeu354045TyrAspMetGinHisAspProGluTyrGinAspLyslieThrHislie505560CysThrGluThrGlyGluArgValSerAsnAlaPheLeuValProLys65707580SerArgGluAspLeuLeuAlaArgArgAlaLeuPheGluValTrpAla859095ArgAlaThrPheGlyLeuMetGlyArgThrProAspPheLeuAsnVal100105110ValLeuThrSerLeuTyrSerAsnAlaSerPheLeuGluLysTyrAsn115120125ProGinTrpAlaGluAsnlieArgAlaTyrTyrArgTyrValArgAsp130135140AsnAspLeuPheLeuThrHisAlalielieAsnProGinAsnAspArg145150155160SerLysProSerHisGluGinGinAspThrPheThrHisLeuGlyVal165170175ValArgGluThrProGluGlyLeulieValArgGlyAlaLysMetLeu180185190AlaThrLeuAlaProlieThrAspGluVallielieTyrThrPhePro'195200205GlyTyrLysProGlyAspGluArgTyrAlaValSerPheAlaliePro210215220lieAspThrProGlyLeuArglieLeuCysArgGluProMetGinAsp225230235240GlyThrArgProLeuPheAspHisProLeuAlaSerArgPheGluGlu245250255MetAspAlaLeuLeuValPheAsnAspValLeuValProTrpAspArg260265270ValPhelieTyrAsnAsnValGluAlaAlaAsnLeuLeuTyrProLys275280285ThrGlylieAlaGinGinProAlaHisGinThrGlyValArgGlyLeu290295300lieLysLeuGinPheAlaThrGluValAlalieArgLeuAlaAspSer305310315320lieGlyValAspValTyrLeuAsnValGinAsnAspLeuGlyGluLeu325330335LeuGinSerValGluAlalieArgAlaLeuLeuHisLeuAlaGluHis340345350GluLeuGluValLeuProSerGlyGluValMetProGlyTrpValPro355360365LeuGluThrlieArgGlyLeuLeuProLysLeuTyrProArgAlaVal370375380GluValLeuGinlielieGlyAlaGlyGlyLeuLeuMetSerProThr385390395400GlyAlaAspPheAlaAsnProGluLeuAlaAlaAspMetGluLysTyr405410415TyrAlaGlyArglieGlyValGlyGlyGluGluArgValArgLeuPhe420425430LysLeuAlaTrpAspLeuCysGlyGluAlaPheGlyGinAi.gLeuLeu435440445GinTyrGluArgPheTyrThrGlyAspProlieArgLysArgAlalie450455柳PheTyrAsnAsnlieLysArgGluArgThrLeuValMetValAspGlu465470475480AlaLeuArgMetProAsnGinGinGluLysValValAsnAla485490<210>7<211>29<212>DNA<213>克隆芳香烃羟化酶系统的NADH依赖的FMN还原酶基S的上游引物序列<400>7ccggaattcgtgaagttgttaggtatctc29<210>8<211>29<212>DNA<213>克隆芳香烃羟化酶系统的NADH依赖的FMN还原酶基因的下游引物序列<400>8cccaagctttcaacgatgggcatggacac29<210>9<211>33<212>DNA<213>克隆芳香烃羟化酶系统的FAD合成酶基因的上游引物序列<400>9ggaattccatatgaaggtgcatgaggcaaatea33<210>10<211>29<212>DNA<213>克隆芳香烃羟化酶系统的FAD合成酶基因的下游引物序列<400>10cccaagcttttacgagctaagcggccacc29<210>11<211>33<212>DNA<213>克隆芳香烃羟化酶系统的芳香族化合物羟化酶基因的上游引物序列<400>)1ggaattccatatgaggatggggatccgcacagg33<20>12<211>29<212>DNA<213>克隆芳香烃羟化酶系统的芳香族化合物羟化酶基因的下游引物序列<400>12cccaagctttcaggcattcacaactttct29权利要求1.一种芳香烃羟化酶系统，其特征在于包括NADH依赖的FMN还原酶，FAD合成酶和芳香族化合物羟化酶。2.根据权利要求1所述的芳香烃羟化酶系统，其特征在于所述的NADH依赖的FMN还原酶、FAD合成酶和芳香族化合物羟化酶的编码基因依次分别具有a)SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；或b)不同于SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3但编码的氨基酸序列与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；或c)在严格杂交条件下与所述的a)或b)中的序列杂交，并且编码具有活性的所述的芳香烃羟化酶系统的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的芳香烃羟化酶系统，其特征在于所述的NADH依赖的FMN还原酶、FAD合成酶和芳香族化合物羟化酶具有d)上述a)、b)或c)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或e)SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的氨基酸序列；或f)上述e)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后、并且具有所述的NADH依赖的FMN还原酶、FAD合成酶和芳香族化合物羟化酶的活性的氨基酸序列。4.根据权利要求1-3任一项所述的芳香烃羟化酶系统，其特征在于所述的芳香烃羟化酶系统于嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2中分离得到。5.根据权利要求1-3任一项所述的芳香烃羟化酶系统，其特征在于所述的芳香烃羟化酶系统的底物包括邻氨基苯甲酸、2-羟基苯乙酸、4-羟基苯乙酸、水杨酸中的至少一种。6.根据权利要求5所述的芳香烃羟化酶系统，其特征在于所述的芳香烃羟化酶系统的最适底物是邻氨基苯甲酸。7.根据权利要求1-3任一项所述的芳香烃羟化酶系统，其特征在于所述的芳香烃羟化酶系统的反应温度为25°C-100°C。8.根据权利要求7所述的芳香烃羟化酶系统，其特征在于所述的芳香烃羟化酶系统的最适反应温度为60°C。9.根据权利要求1-3任一项所述的芳香烃羟化酶系统，其特征在于所述的芳香烃羟化酶系统的反应pH值为3.2-11.0。10.根据权利要求9所述的芳香烃羟化酶系统，其特征在于所述的芳香烃羟化酶系统的最适反应pH值为9.0。11.一种表达芳香烃羟化酶系统的重组质粒，其特征在于至少包括权利要求2的NADH依赖的FMN还原酶、FAD合成酶和芳香族化合物羟化酶的编码基因。12.根据权利要求11所述的重组质粒，其特征在于所述的重组质粒的载体为pET-28a(+)。13.—种产生芳香烃羟化酶系统的重组菌，其特征在于所述的重组菌内导入了权利要求2的NADH依赖的FMN还原酶、FAD合成酶和芳香族化合物羟化酶的编码基因。14.根据权利要求13所述的重组菌，其特征在于所述的重组菌为大肠杆菌。15.根据权利要求14所述的重组菌，其特征在于所述的重组菌为大肠杆菌BL21菌株。16.权利要求1-3任一项所述的芳香烃羟化酶系统用于降解单环芳香烃化合物或氨基取代芳香烃或其衍生物中的至少一种。专利摘要本发明涉及一种芳香烃羟化酶系统及应用，其中该系统包括NADH依赖的FMN还原酶，FAD合成酶和芳香族化合物羟化酶。本发明还涉及表达所述的芳香烃羟化酶系统的重组质粒及重组菌，本发明所述的芳香烃羟化酶系统可用于降解单环芳香烃化合物或氨基取代芳香烃或其衍生物中的至少一种。文档编号C12N15/52GKCN101397549SQ200710154194公开日2009年4月1日申请日期2007年9月24日发明者露冯,刘雪倩,磊王申请人:南开大学导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan