控制葡萄糖和维生素浓度提高发酵制备丙酮酸产量的方法

文档序号:74075阅读:596来源:国知局

专利名称::控制葡萄糖和维生素浓度提高发酵制备丙酮酸产量的方法
技术领域
:—种控制葡萄糖和维生素浓度提高发酵制备丙酮酸产量的方法,涉及光滑球拟酵母发酵制备丙酮酸
技术领域
:。技术背景丙酮酸又称2-氧代丙酸、a-酮基丙酸或乙酰基甲酸,为无色至淡黄色液体,呈醋酸香气和愉快香味,是最重要的a-氧代羧酸之一。丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用,而且是多种有用化合物的前体,在化工、制药和农用化学品等工业及科学研究中有着广泛的用途。自从20世纪50年代开始发酵法生产丙酮酸以来,国内外对丙酮酸生物合成的研究越来越深入,涉及菌种选育、营养条件、维生素、溶氧水平等各个方面。为了达到丙酮酸产量、转化率、生产强度的高度统一,研究者又从ATP酶入手研究了丙酮酸生物合成中的能量代谢,并对呼吸作用作了一些有益的研究。利用葡萄糖和维生素控制策略提高丙酮酸的产量及生产强度,降低发酵液中残留葡萄糖浓度,尚未见文献报道。
发明内容本发明的目的是提供一种葡萄糖和维生素控制策略提高发酵法生产丙酮酸时的丙酮酸产量、得率及生产强度,降低发酵液中残留葡萄糖浓度的方法,利用本发明能提高丙酮酸发酵的产量、生产强度和得率,并且降低发酵液中的残留葡萄糖浓度,利于提取。本发明的技术方案一种控制葡萄糖和维生素浓度提高发酵制备丙酮酸产量的方法,是利用多重营养缺陷型光滑球拟酵母(Torulopsisglabrata)CCTCCM202019发酵生产丙酮酸的过程中,控制发酵体系中的葡萄糖和维生素的浓度水平,采用初始葡萄糖浓度为80g/L,初始维生素浓度6mL/L;2468h流加葡萄糖流加液,控制发酵液中葡萄糖浓度为20-30g/L,流加维生素流加液,维生素流加速率为24-25h为3.lmL/h,25_34h流速每小时增加0.2mL/h,末一小时的流速达5.lmL/h,34-35h减至1.4mL/h,35-68h流速每小时增加0.05mL/h,末一小时的流速达3mL/h,68-88h减至lmL/h;所述发酵过程中培养基组成以g/L计葡萄糖80,氯化铵7,乙酸钠6,KH2P045,Mg2S047H200.8,维生素溶液10mL/L,微量元素溶液10mL/L,pH5.5;维生素溶液(L):烟酸0.8g,盐酸硫胺素2mg,盐酸吡哆醇10mg,生物素lmg;微量元素溶液(L):CuS04*5H200.05g,FeS04*7H202g,MnCl24H200.2g,CaCl22H202g,ZnCl20.5g,2mol/LHC1定容至1L;葡萄糖流加液组成为葡萄糖800g/L,氯化铵58g/;维生素流加液组成为盐酸硫胺素400iig/L,生物素200iig/L,烟酸80mg/L,盐酸吡哆醇2mg/L;培养方法7L发酵罐中装液量3L,接种量12X,转速为400r/m,通气量为lvvm,温度为30°C,流加8mol/L的NaOH控制pH为5.5,24h后向发酵罐中按上述要求流加葡萄糖流加液和维生素流加液。菌种光滑球拟酵母T.glabrataCCTCCM202019,NA、Bio、B64种维生素营养3缺陷型,且丙酮酸脱羧酶活性组成型降低,为本研究室选育。该菌种已申请中国专利,申请号为02113142.2,公开号为CN1392246A。培养基和培养方法配制维生素的混合溶液(L):烟酸O.8g,盐酸硫胺素2mg,盐酸吡哆醇10mg,生物素lmg。配制微量元素混合溶液(L):CuS045H200.05g,FeS047H202g,MnCl24H200.2g,CaCl22H202g,ZnCl20.5g,2mol/LHC1定容至1L。斜面和种子培养基(L):葡萄糖30g,蛋白胨20g,KH2P04lg,MgS047H200.5g,维生素溶液10mL,琼脂20g(斜面添加);PH5.5。发酵培养基(L):葡萄糖80g,氯化铵7g,乙酸钠6g,KH2P045g,Mg2S04*7H200.8g,维生素溶液lOmL,微量元素溶液10mL,pH5.5。培养方法为种子培养从新鲜斜面上接一环菌接入种子培养基(50mL/500mL锥形瓶),在30°C,200r/min下培养18h。再按1%接种量接入二级种子培养基(300mL/1000mL锥形瓶),在30°C,220r/min下培养18h。发酵培养KBT型7L全自动发酵罐(韩国KoBioTechnol.Co.,Ltd.)中装液量3L,接种量12%,转速为400r/m,通气量为lvvm,温度为30°C,流加8mol/L的NaOH控制pH为5.5。24h后向发酵罐中按要求流加营养物,同时加大通气量保证通气量为lvvm,温度、pH和溶氧分别采用相应的电极进行自动控制。分析方法将含有4mL发酵液的塑料离心管置于台式高速离心机(TGL-16G)中,于lOOOOr/min离心5min,取上清夜进行分析测定。吸取O.lmL发酵液,定容后以水为空白,在660nm处测定0D值。然后根据10D66。二0.23g/(细胞干重)的换算关系,计算得出细胞干重。葡萄糖采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定。丙酮酸及a-酮戊二酸的测定高效液相色谱(HPLC)法。色谱条件为:StableBondC18反相柱,柱温28°C,检测器UV210nm,流动相:0.1%(v/v)H3P04,流速1.Oml/min,进样体积:10iiL。相关技术条件对丙酮酸发酵性能的影响在此控制策略下,丙酮酸产量由对照例的65.5g/L提高到8090g/L,残留葡萄糖由46.9g/L降低至5.Og/L以下。本发明的有益效果在利用多重营养缺陷型菌株光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCCM202019发酵生产丙酮酸的过程中,葡萄糖和维生素浓度可以显著影响丙酮酸的得率和产量。以往丙酮酸发酵中葡萄糖和维生素的供给为发酵起始向培养基中一次性添加以保证整个过程细胞生长和丙酮酸合成的微妙平衡。然而,维生素的一次性添加必然导致发酵前期的过量和发酵中后期的匮乏,由此造成发酵前期丙酮酸产率较低而发酵后期细胞活力受限,从而导致丙酮酸生产强度和产率难以达到统一。利用本发明能强化细胞活力而降低发酵液中残留葡萄糖,提高丙酮酸发酵的生产强度;并且可以通过流加维生素有效延长发酵时间。本发明的营养因子添加模式对其它发酵产品的生产具有一定的指导意义。具体实施方式对照实施例在7L罐中进行分批发酵,初始体积3L,发酵初糖180g/L(总糖540g),添加维生素10mL/L(总共添加30mL),发酵96h,丙酮酸产量为65.5g/L(总酸229.3g),发酵液中残留葡萄糖46.9g/L(164.2g),糖酸转化率为0.61g/g。实施例在7L罐中进行流加发酵,初始体积3L,发酵初糖80g/L(总糖540g),初始添加维生素6mL/L(总共添加42mL),按权利要求书中方法发酵92h,丙酮酸产量为91.2g/L(总酸401.3g),发酵液中残留葡萄糖2.lg/L(9.2g),糖酸转化率为0.75g/g。权利要求一种控制葡萄糖和维生素浓度提高发酵制备丙酮酸产量的方法,其特征是利用多重营养缺陷型光滑球拟酵母(Torulopsisglabrata)CCTCCM202019发酵生产丙酮酸的过程中,控制发酵体系中的葡萄糖和维生素的浓度水平,采用初始葡萄糖浓度为80g/L,初始维生素浓度6mL/L;24~68h流加葡萄糖流加液,控制发酵液中葡萄糖浓度为20-30g/L,流加维生素流加液,维生素流加液流加速率为24-25h为3.1mL/h,25-34h流速每小时增加0.2mL/h,末一小时的流速达5.1mL/h,34-35h减至1.4mL/h,35-68h流速每小时增加0.05mL/h,末一小时的流速达3mL/h,68-88h减至1mL/h;所述发酵过程中培养基组成以g/L计葡萄糖80,氯化铵7,乙酸钠6,KH2PO45,MgSO4·7H2O0.8;维生素溶液10mL/L,微量元素溶液10ml/L,pH5.5;维生素溶液(L)烟酸0.8g,盐酸硫胺素2mg,盐酸吡哆醇10mg,生物素1mg;微量元素溶液(L)CuSO4·5H2O0.05g,FeSO4·7H2O2g,MnCl2·4H2O0.2g,CaCl2·2H2O2g,ZnCl20.5g,2mol/LHCl定容至1L;葡萄糖流加液组成为葡萄糖800g/L,氯化铵58g/L;维生素流加液组成为盐酸硫胺素400μg/L,生物素200μg/L,烟酸80mg/L,盐酸吡哆醇2mg/L;培养方法7L发酵罐中装液量3L,接种量12%,转速为400r/m,通气量为1vvm,温度为30℃,流加8mol/L的NaOH控制pH为5.5,24h后向发酵罐中按上述要求流加葡萄糖流加液和维生素流加液。专利摘要控制葡萄糖和维生素浓度提高发酵制备丙酮酸产量的方法,属于发酵制备丙酮酸
技术领域
:。本发明采用初始葡萄糖浓度为80g/L,初始维生素浓度6mL/L;24~68h流加葡萄糖流加液,控制发酵液中葡萄糖浓度为20-30g/L,流加维生素流加液,维生素流加速率为24-25h为3.1mL/h,25-34h流速每小时增加0.2mL/h,末一小时的流速达5.1mL/h,34-35h减至1.4mL/h,35-68h流速每小时增加0.05mL/h,末一小时的流速达3mL/h,68-88h减至1mL/h。在此控制策略下,丙酮酸产量由对照例的65.5g/L提高到80~90g/L,残留葡萄糖由46.9g/L降低至5.0g/L以下。本发明生产的丙酮酸可用于化工、制药等领域。由于残留葡萄糖浓度较低,提高了下游处理时的效率。本发明的策略对其它发酵产品的生产也有指导意义。文档编号C12R1/645GKCN101157941B发布类型授权专利申请号CN200710131672公开日2010年6月9日申请日期2007年9月19日发明者刘立明,梁楠,许庆龙,陈坚申请人:江南大学导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan专利引用(2),非专利引用(1),
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