苯并[1,2,3]噻二唑衍生物及其合成方法和用途的制作方法

专利名称：:苯并[1,2,3]噻二唑衍生物及其合成方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明的技术方案涉及与碳环稠合的含1，2-二唑的杂环化合物，具体涉及苯并噻二唑衍生物。植物诱导抗病激活剂作用机制新颖，对环境友好，属绿色农药范畴，现已研究开发成功的主要品种有S-甲基苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸酯(英文縮写为BTH，英文通用名称acibenzolar-S-methyl)、2，6-二氯异烟酸和P_氨基丁酸、茉莉酸甲酯、烯丙异噻唑以及噻酰菌胺(英文通用名称Tiadinil，简称TDL)等(鲍丽丽，刘凤丽，范志金，具有植物诱导抗病活性的先导化合物及其结构修饰，农药学学报，2005，7(3):201-209;MichikoYasuda;HideoNakashita;ShigeoYoshida;Tiadinil，anovelclassofactivatorofsystemicacquiredresistance,inducesdefensegeneexpressionanddiseaseresistanceintobacco.JapanesePesticideScience,2004，29:46-49)。发明人曾建立了植物诱导抗病激活剂诱导抗病活性的筛选体系，有关苯并噻二唑诱导抗病活性的研究和专利文献的报道情况已经总结在了发明人最近申请的专利文件的
背景技术：
中，同时，发明人已经合成了一些BTH的衍生物，部分化合物显示出诱导烟草抗烟草花叶病毒(简称TMV)的活性(范志金等，苯并噻二唑衍生物及其合成方法和诱导抗病活性的筛选，中华人民共和国国家发明专利，申请号200510013111.7，公开号CN1680342A;范志金等，新型苯并噻二唑衍生物及其合成方法和诱导烟草抗烟草花叶病毒的活性，中华人民共和国国家发明专利，申请号200510014378.8)，这类化合物的结构通式可表示如在国内外专利文献公开的苯并噻二唑衍生物中，除了申请者自己申请的专利以外均未涉及其诱导烟草抗烟草花叶病毒(简称TMV)的活性，也未进行过相关的诱导抗病生物活性筛选的研究，为了进一步寻找具有更高诱导活性的新型BTH衍生物，为构效关系(QSAR)研究奠定基础，本发明专利在前期研究的基础上进一步进行结构修饰，合成了10个未见文献报道的新化合物。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供诱导烟草抗烟草花叶病毒的苯并噻二唑衍生物及其合成方法和诱导烟草抗TMV活性的筛选，其筛选体系包括离体的筛选和活体的诱导活性的筛选以及苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的测定和抑菌活性的筛选。
背景技术：
[0006]本发明解决该技术问题所采用的技术方案是诱导烟草抗烟草花叶病毒的苯并噻二哇衍生物的化学结构通式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中和R2分别是氢、吡啶_2-基、1，3-噻唑-2-基、4，6_二甲基嘧啶_2_基、正丙基、异丙基、正丁基、1-氰基_1，2-二甲基丙基、l-氰基_1，2，2-三甲基丙基、苯甲酰基、&和R2以及与羰基相联的氮原子共同组成含5碳原子和1个氮原子的六元环哌啶环，杂氮原子的间位或对位具有乙氧羰基的取代基。其具体的化学结构式表示如下I.苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰胺衍生物类<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>[0012]本发明的诱导烟草抗烟草花叶病毒的苯并噻二唑衍生物的合成方法如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>具体分为以下歩骤A.苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的制备在500mL的三口瓶中加入所需量的苯并[1，2，3]噻二唑_7_甲酸、及经过无水处理的甲苯、DMF和二氯亚砜，每克苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸约加入7.4mL经过无水处理的甲苯、0.037mL的DMF和0.7mL的二氯亚砜，缓慢升温度至8090°C，保持此温度继续反应6小时，冷却后过滤，滤液减压蒸除多余的二氯亚砜并脱溶得产品苯并[1，2，3]噻二唑_7-甲酰氯，产品无须纯化并保存在干燥器中备下一步反应直接使用；B.诱导烟草抗烟草花叶病毒的苯并[1，2，3]噻二唑衍生物的制备苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰胺衍生物的制备在100mL的三口瓶中加入5mmo1胺、绝对无水四氢呋喃25mL和6mmo1氢化钠，制备相应胺的钠盐悬浮液，回流3小时并冷却混合物，在冰浴下滴加5mmo1苯并[1，2，3]噻二唑_7_甲酰氯的15mL绝对无水四氢呋喃溶液，冷却下搅拌2小时，逐渐升温并回流6小时，冷却后过滤，滤液在旋转蒸发仪上减压浓縮，用硅胶柱层析纯化得纯品，所用洗脱剂为609(TC的石油醚和乙酸乙酯，它们的体积比为3:l，上述化合物的用量可以按相应比例扩大或縮小；本发明的苯并噻二唑衍生物诱导烟草抗烟草花叶病毒活性的筛选方法如下I.标准植物诱导抗病激活剂的选择选择苯并噻二唑(BTH)和噻酰菌胺(TDL)为标准的植物诱导抗病激活剂，离体筛选采用500iig/mL;活体诱导效果的评价采用100iig/mL或0.lmol/L的浓度；II.离体直接抗病毒活性的筛选方法将供试化合物配制成含微量表面活性剂土温80的500iig/mL溶液，用磷酸缓冲液将TMV病毒粗提液稀释至适宜的浓度，摩擦接种TMV后，将叶片沿中脉对剖，左右半叶分别浸入供试化合物溶液和清水中，分别代表处理和空白对照，30分钟后取出，置23±1°C的光照下保湿培养，3天后观察其产生枯斑的数量，记录发病情况，按下式计算出供试化合物抗TMV的直接相对效果，每一处理设3次重复，除空白对照外再设计标准药剂处理对照；测试化合物的相对效果分为4级A、B、C、D，具体数据为，A级相对效果>50%，为优；B级相对效果3050%，为良；C级相对效果2030%，为中；D级相对效果<20%，为差，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中，X为化合物对TMV的直接抑制率或相对效果，单位％CK为清水对照半叶的平均枯斑数，单位个A为药剂处理半叶的平均枯斑数，单位个；III.活体诱导抗病毒活性的筛选方法将苗龄一致的普通烟，3盆为一组，分别于接种前7天前处理过的烟苗，处理方式包括喷施供试化合物溶液2到3次，每次20mL，第7天于新长出的烟叶上摩擦接种TMV，将烟苗置于其生长适宜温度及光照下培养3天后，检查发病情况，综合病斑数目按下式计算出供试化合物对TMV的诱导抗病毒效果，每一处理设3次重复，对照分空白对照和标准药剂处理对照2种；测试化合物的相对效果分为4级A、B、C、D，具体数据为A级诱导效果>70%，为优；B级诱导效果7050%，为良；C级诱导效果3050%，为差；D级诱导效果<30%视为无诱导效果，CK-I<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>[0028]其中，R为新化合物对烟草抗TMV的诱导效果，单位％CK为清水对照叶片的平均枯斑数，单位个I为经化合物诱导处理后叶片的平均枯斑数，单位个；IV.杀菌活性的筛选方法采用菌体生长率测定法(Myceliumgrowthratetest)，具体过程是，取5mg样品溶解在适量二甲基甲酰胺内，然后用含有一定量吐温20乳化剂水溶液稀释至500iig/mL的药剂，将供试药剂在无菌条件下各吸取lmL注入培养皿内，再分别加入9mL培养基，摇匀后制成50iig/mL含药平板，以添加lmL灭菌水的平板做空白对照，用直径4mm的打孔器沿菌丝外缘切取菌盘，移至含药平板上，呈等边三角形摆放，每处理重复3次，将培养皿放在24士rC恒温培养箱内培养，48小时后调查各处理菌盘扩展直径，求平均值，与空白对照比较计算相对抑菌率。供试病原真菌包括小麦赤霉(Gibberellazeae)、番燕早疫(Alternaria)、戸等著枯(Phomaasparagisolani)、苹果轮纹(Physalospor即iricola)禾口花生揭斑(Cercosporaarachidicola)。本发明的有益效果是苯并噻二唑是一种标准的植物诱导抗病激活剂，利用申请者前一发明专利建立筛选体系，在成功诱导了烟草植株对TMV产生很好的抗病毒活性的基础上，本发明进一步成功的运用了该体系进行诱导抗病活性的筛选，并进一步进行抑菌活性的筛选，筛选结果发现部分化合物具有较好的诱导烟草抗烟草花叶病毒的活性和抑制病原真菌生长的活性。本发明将通过特定制备和生物活性测定实施例更加具体地说明苯并噻二唑类衍生物的合成和生物活性，但所述实施例仅用于具体的说明本发明而非限制本发明，具体的实施方式如下实施例1苯并[1，2，3]噻二唑-7_甲酰氯的制备在500mL的三口瓶中加入27.Og苯并[1，2，3]噻二唑_7_甲酸，200mL经过无水处理的甲苯，lmL的DMF，20mL的S0C12，缓慢升温度至8090°C，保持此温度继续反应6小时，冷却后过滤，滤液减压脱溶得产品苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯28g，产品无须纯化并保存在干燥器中备下一步反应直接使用。实施例2化合物B2的合成和结构鉴定在100mL的三口瓶中加入0.47g2_氨基吡啶、绝对无水四氢呋喃25mL和0.32g氢化钠，制备相应胺的钠盐悬浮液，常温搅拌1.5小时，滴加lg苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的15mL绝对无水四氢呋喃溶液，常温搅拌2小时，反应完后过滤，减压脱溶得粗产物0.52g，收率41.1%，用硅胶柱层析纯化得纯品，所用洗脱剂为6090°C的石油醚和乙酸乙酯，它们的体积比为2:1。测定熔点和^NMR，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，该化合物^NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，MS测定出现相应M+l的m/z峰，IR出现相应的骨架吸收峰，紫外扫描的最大吸收峰出现在380.Onm和280.Onm处。实施例3化合物B4的合成和结构鉴定在100mL的三口瓶中加入0.50g2_氨基噻唑、绝对无水四氢呋喃25mL和0.23g氢化钠，制备相应胺的钠盐悬浮液，常温搅拌1.5小时，滴加lg苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的15mL绝对无水四氢呋喃溶液，常温搅拌2小时，反应完后过滤，减压脱溶得粗产物0.71g，收率54.2X，用硅胶柱层析纯化得纯品，所用洗脱剂为609(TC的石油醚和乙酸乙酯，它们的体积比为5:1。测定熔点和^NMR，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，该化合物^NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，MS测定出现相应M-1的m/z峰，IR出现相应的骨架吸收峰，紫外扫描的最大吸收峰出现在327.0nm和264.Onm处。实施例4B8的合成和结构鉴定在lOOmL的三口瓶中加入O.62g4，6_二甲基嘧啶_2_胺、绝对无水四氢呋喃25mL和0.23g氢化钠，制备相应胺的钠盐悬浮液，常温搅拌1.5小时，滴加lg苯并[1，2，3]噻二唑_7-甲酰氯的15mL绝对无水四氢呋喃溶液，常温搅拌2小时，反应完后过滤，减压脱溶得粗产物O.82g，收率58.6%，用硅胶柱层析纯化得纯品，所用洗脱剂为6090°C的石油醚和乙酸乙酯，它们的体积比为3:1。测定熔点和1！1NMR，其化学结构式和理化参数见表l和表2，由表1和表2可见，该化合物^NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，MS测定出现相应M+1的m/z峰，IR出现相应的骨架吸收峰，紫外扫描的最大吸收峰出现在296.Onm和268.Onm处。实施例5B9的合成和结构鉴定在lOOmL的三口瓶中加入0.79g哌啶_3_羧酸乙酯、绝对无水四氢呋喃25mL和0.23g氢化钠，制备相应胺的钠盐悬浮液，常温搅拌1.5小时，滴加lg苯并[1，2，3]噻二唑_7-甲酰氯的15mL绝对无水四氢呋喃溶液，常温搅拌2小时，反应完后过滤，减压脱溶得粗产物0.71g，收率44.5%，用硅胶柱层析纯化得纯品，所用洗脱剂为6090°C的石油醚和乙酸乙酯，它们的体积比为2:1。测定熔点和力NMR，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，该化合物^NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，MS测定出现相应M+1的m/z峰，IR出现相应的骨架吸收峰，紫外扫描的最大吸收峰出现在315.Onm和236.Onm处。实施例6BIO的合成和结构鉴定在lOOmL的三口瓶中加入0.79g哌啶_4_羧酸乙酯、绝对无水四氢呋喃25mL和0.23g氢化钠，制备相应胺的钠盐悬浮液，常温搅拌1.5小时，滴加lg苯并[1，2，3]噻二唑_7-甲酰氯的15mL绝对无水四氢呋喃溶液，常温搅拌2小时，反应完后过滤，减压脱溶得粗产物1.OOg，收率62.6%，用硅胶柱层析纯化得纯品，所用洗脱剂为6090°C的石油醚和乙酸乙酯，它们的体积比为4:1。测定熔点和力NMR，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，该化合物^NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，MS测定出现相应M+Na的m/z峰，IR出现相应的骨架吸收峰，紫外扫描的最大吸收峰出现在316.Onm和236.Onm处。实施例7Bll的合成和结构鉴定在lOOmL的三口瓶中加入O.74g2_氨基_2，3_二甲基丁烷腈、20m11，2_二氯乙烷，1.64ml三乙胺，常温搅拌下滴加lg苯并[1，2，3]噻二唑_7-甲酰氯的10mLl，2-二氯乙烷溶液，常温搅拌2小时，反应完后溶液分别用盐酸，饱和碳酸氢钠水溶液，水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压脱溶得粗产物O.87g，收率63.5X，用硅胶柱层析纯化得纯品，所用洗脱剂为6090。C的石油醚和乙酸乙酯，它们的体积比为4:1。测定熔点和1！1NMR，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，该化合物^NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，MS测定出现相应M-1的m/z峰，IR出现相应的骨架吸收峰，紫外扫描的最大吸收峰出现在316.0nm和236.0nm处。实施例8B14的合成和结构鉴定在100mL的三口瓶中加入0.83g2_氨基_2，3，3_三甲基丁烷腈、20m11，2_二氯乙烷，1.64ml三乙胺，常温搅拌下滴加lg苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的10mLl，2-二氯乙烷溶液，常温搅拌2小时，反应完后溶液分别用盐酸，饱和碳酸氢钠水溶液，水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压脱溶得粗产物0.56g，收率38.9%，用硅胶柱层析纯化得纯品，所用洗脱剂为6090。C的石油醚和乙酸乙酯，它们的体积比为3:1。测定熔点和1！1NMR，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，该化合物^NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，MS测定出现相应M+1的m/z峰，IR出现相应的骨架吸收峰，紫外扫描的最大吸收峰出现在315.Onm和236.Onm处。实施例9BW5的合成和结构鉴定在100mL的三口瓶中加入0.82g苯甲酰异丙胺、绝对无水四氢呋喃20mL和0.23g氢化钠，制备相应胺的钠盐悬浮液，常温搅拌1小时后回流4小时，冷却至常温后滴加lg苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的10mL绝对无水四氢呋喃溶液，常温搅拌1小时后回流2小时，冷却后过滤，减压脱溶得粗产物0.7g，收率44.1%，用硅胶柱层析纯化得纯品，所用洗脱剂为609(TC的石油醚和乙酸乙酯，它们的体积比为16:1。测定熔点和1！1NMR，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，该化合物^NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，MS测定出现相应M-1的m/z峰，IR出现相应的骨架吸收峰，紫外扫描的最大吸收峰出现在380.Onm处。实施例10BW8的合成和结构鉴定在100mL的三口瓶中加入0.64g苯甲酰正丁胺、绝对无水四氢呋喃20mL和0.23g氢化钠，制备相应胺的钠盐悬浮液，常温搅拌1小时后回流4小时，冷却至常温后滴加0.72g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的lOmL绝对无水四氢呋喃溶液，常温搅拌1小时后回流2小时，冷却后过滤，减压脱溶得粗产物0.68g，收率56.1%，用硅胶柱层析纯化得纯品，所用洗脱剂为6090。C的石油醚和乙酸乙酯，它们的体积比为15:1。测定熔点和^NMR，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，该化合物^NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，MS测定出现相应M-1的m/z峰，IR出现相应的骨架吸收峰，紫外扫描的最大吸收峰出现在380.Onm和260.Onm处。实施例11BW16的合成和结构鉴定在100mL的三口瓶中加入0.83g苯甲酰正丙胺、绝对无水四氢呋喃20mL和0.21g氢化钠，制备相应胺的钠盐悬浮液，常温搅拌1小时后回流4小时，冷却至常温后滴加0.83g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的lOmL绝对无水四氢呋喃溶液，常温搅拌1小时后回流2小时，冷却后过滤，减压脱溶得粗产物0.72g，收率52.9%，用硅胶柱层纯化得纯品，所用洗脱剂为6090。C的石油醚和乙酸乙酯，它们的体积比为15:1。测定熔点和^NMR，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，该化合物^NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，MS测定出现相应M-1的m/z峰，IR出现相应的骨架吸收峰，紫外扫描的最大吸收峰出现在324.Onm和234.Onm处。实施例12本发明的苯并[1，2，3]噻二唑衍生物诱导烟草抗烟草花叶病毒的效果烟草生物测定试验的结果见表3，表3表明，标准的植物诱导抗病激活剂BTH和噻酰菌胺以及本发明的大部分苯并[1，2，3]噻二唑衍生物在离体条件下均对TMV无抑制作用，但BTH和噻酰菌胺能诱导烟草产生对TMV很好的抗性；初步的生物测定结果表明，本发明的苯并[1，2，3]噻二唑衍生物BW5在500iig/mL时具有58%的抗病毒活性，100yg/mL时具有86%的诱导烟草抗TMV的活性，所有化合物在0.lmmol/L浓度下仍具有很好的诱导活性，大于55%，其中B4的诱导活性与BTH基本相当。实施例13本发明的苯并[1，2，3]噻二唑衍生物的诱导烟草抗TMV后烟草植株体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)的提取和活性测定取经上述化合物诱导后新长出的并接种MV的烟草叶片待测，加3mL0.2mol/L硼砂缓冲液(pH8.8，含0.005mol/L的巯基乙醇，O.001mol/L的EDTA)及约样品重量1/10的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，在冰浴中匀桨。10000转/分钟，4t:下离心20分钟，上清液作酶活测定。测定系统由2mL0.2mol/LpH8.8的硼砂缓冲液。lmLO.02mol/LL-苯丙氨酸和0.8mL酶液组成。测定0D29。后，于37t:水浴反应1小时，再测定0D29。值，对照为硼砂缓冲液3mL加酶液0.8mL。蛋白质含量的测定采用考斯亮蓝G250法，以BSA为标准蛋白。PAL测定的结果见l，由附图1可见，化合物BW7、B4和B7诱导后烟草体内PAL酶活性有提高，提高的程度不如BTH诱导的结果，但比另一个标准药剂TDL的诱导效果好，B4提高的程度最高，初步可以认为B4具有较好的诱导活性，而B14不但没有提高，反而有所下降，与生物测定的结果的这一差异的原因有待进一步的研究。实施例14本发明的苯并[1，2，3]噻二唑衍生物的抑菌活性菌体生长率法测定结果见表4，表4表明，本发明合成的大部分化合物均无抑菌活性，而化合物B4具有很好的抑菌活性，其抑制效果为100%，正在进行进一步的深入研究。表l本发明化合物的理化参数<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2本发明化合物的1！1醒R和MS以及IR数据<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>[0080]表3本发明中的化合物诱导烟草抗烟草花叶病毒的活性<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>图1，经本发明合成的化合物诱导后烟草体内PAL酶活性的变化(3次实验的平均结果)。药剂浓度离体抗病毒浓度叶面谗导抗浓度叶面诱导抗名称pg/mL效果％pg/mL病毒效果％rnmol/L病毒效果％注表中数据是3次实验的平均结果表4本发明中的化合物的抑菌活性<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求一种苯并噻二唑衍生物，其特征在于它是结构式(I)的化合物，其化合物编号为B4F2007100903126C00011.tif2.权利要求1所述的苯并噻二唑衍生物B4的合成方法，其特征在于合成方法是在100毫升的三口瓶中加入0.50克2-氨基噻唑、绝对无水四氢呋喃25毫升和0.23克氢化钠，制备相应胺的钠盐悬浮液，常温搅拌1.5小时，滴加1克苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的15毫升绝对无水四氢呋喃溶液，常温搅拌2小时，反应完后过滤，减压脱溶得粗产物0.71克，收率54.2%，用硅胶柱层析纯化得纯品，所用洗脱剂为6090度的石油醚和乙酸乙酯，它们的体积比为5:1;化合物(I)的用量按相应比例扩大或縮小。3.权利要求1所述的苯并噻二唑衍生物在制备诱导烟草抗烟草花叶病毒药剂中的用途。4.权利要求1所述的苯并噻二唑衍生物在制备杀真菌药剂中的用途。专利摘要本发明提供制备一类苯并噻二唑甲酰胺类衍生物及其合成方法和直接的抗烟草花叶病毒的活性和诱导烟草抗烟草花叶病毒的活性以及其抑菌活性，涉及与碳环稠合的含1，2-二唑的杂环化合物，它们具有如下化学结构式其中包括10种取代的苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰胺衍生物。本发明公开了这些化合物的合成方法及其抗烟草花叶病毒的活性和他们诱导烟草抗烟草花叶病毒的活性以及对农业真菌的抑制作用。文档编号A01N43/828GKCN101058574B发布类型授权专利申请号CN200710090312公开日2010年5月26日申请日期2005年12月14日发明者刘秀峰,张永刚,石祖贵,聂开晟,苑建勋,范志金,范志银,鲍丽丽申请人:南开大学导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan专利引用(4),