专利名称:非还原性糖类生成酶及其制备和应用的制作方法
非还原性糖类生成酶及其制备和应用
本发明涉及一种新的非还原性糖类生成酶，以及它的制备和应用。更具体地说，涉及这样一种新的还原性糖类生成酶:当其作用于一种或多种具有3个或3个以上的葡萄糖聚合度的还原性淀粉部分水解产物时，生成一种具有海藻糖结构的非还原性糖类，还涉及这种酶的制备，以及能够产生这种酶的微生物。本发明还涉及含有可由这种酶制备的以海藻糖结构为末端单元的非还原性糖类的组合物，含有上述非还原性糖类的还原性比较低的糖类，和/或由这种糖类所制备的海藻糖。
海藻糖或α，α-海藻糖长期以来一直被认为是由葡萄糖单元组成的非还原性糖类。正如在 Advance in Carbohydrate Chemistry, 18 卷，第 201-225 (1963)中(由美国的 Academic Press 出版)和在 Appliedand Environmental Microbiology,第 56 卷，3213-3215页(1990)中所公开的,海藻糖广泛存在于微生物、蘑燕和昆虫中，但含量较低。由于非还原性糖类包括不会与具有氨基的物质，如氨基酸和蛋白质反应的海藻糖，所以它们即不会引起氨基-羰基反应，也不会改变含有氨基酸的物质。因此，非还原性糖类被认为可以使用而不用担心会引起不理想的褐变和变质。因为上述原因，就迫切需要建立一种制备这种还原糖的方法。
在海藻糖的传统制备方法中，和在日本专利公开号N0.154, 485, 75中所公开的，采用的微生物，或者如日本专利公开号N0.216，695/83中提出的，同时采用麦芽糖酶-和麦芽糖磷酸化酶将麦芽糖转化成海藻糖。然而，前一种方法不适于工业规模的制备，因为海藻糖在作为原材料的微生物中的含量以干固体物计(d.s.b.)低于15w/w% (“w/w%”的表达形式在说明书中可简化为％，除非另有说明)，且分离和提纯步骤复杂。而后一种方案具有如下缺点:
(i)因为海藻糖是通过葡萄糖-1-磷酸生成的，作为底物的麦芽糖不能以较高的浓度使用；(ii)因为磷酸化酶促反应体系是可逆反应，所以目的产物海藻糖的产量较低；
(iii)要保持该反应体系的稳定和顺利延续其酶促反应实际上是困难的。
关于海藻糖的制备，在“Food Chemicals”，N0.88，67-72页(1992年8月)上题为“Current Status of Starch Application Developmentand Related Problems，，的章节中的标题为“Oligosaccharides”的专栏中有报道:“尽管海藻糖具有广泛的用途，但是通过直接糖转移反应或水解反应的酶促制备海藻糖的方法在本领域被认为从科学上来讲是不可能的。”因此，以淀粉为材料酶促制备海藻糖的方法被认为从科学上讲是极为困难的。
业已知道，由淀粉材料，如液化淀粉、环状糊精和麦芽寡糖制备的淀粉的部分水解产物通常以还原性末端基团为末端单元。在说明书中，这种淀粉的部分水解产物被称为“非还原性的淀粉部分水解产物”。这种还原性淀粉部分水解产物的还原能力通常表达为以其干固体物重计的“葡萄糖当量(DE)值”。 业已知道，还原性淀粉部分水解产物中那些具有较高的DE值的产物通常具有较低的分子量和粘度，以及较高的适宜甜度和反应性，且易与含有氣基的物质如氣基酸和蛋白质反应，使其品质发生不理想的揭变、发臭和变质。
还原性淀粉部分水解产物的这些不利特性根据其DE值有所变化，且还原性淀粉部分水解产物与其DE值之间的关系是极为重要的。甚至在本领域中一直认为要打破这种关系是不可能的。
打破这种关系的唯一途径是一种在较高的氢压下通过氢化还原性淀粉部分水解产物将其还原性末端基团转化成羟基而将这种水解产物制成非还原性糖类。不过，这种方法需要高压灭菌锅并耗费大量的氢和能源，而且还需要较高的水平的控制或安全设施以免发生灾难。还原性部分淀粉水解产物与所得产物不同，因为前者由葡萄糖单元组成，而后者，即所得淀粉部分产物的糖醇则是由葡萄糖和山梨醇组成，当将其用在人体上时可能导致出现消化紊乱或腹泻症状。因此，迫切需要建立一种降低甚至消除还原性淀粉部分水解产物的还原能力而又不改变以葡萄糖单元作为其组分糖的状况的方法。
本发明的目的是要提供一种新的非还原性糖类及其应用，并由还原性淀粉部分水解产物来制备，以使打破传统上认为的还原性部分淀粉部分水解产物和其DE值之间的关系，并揭示这种非还原性糖类的新用途。
为达上述目的，本发明人广泛筛选了能产生一种新的非还原性糖类生成酶的微生物，当这种酶作用于还原性淀粉部分水解产物时，可生成具有海藻糖结构的非还原性糖类。
结果，从日本冈山市和Soja市的土壤中分别分离出了根瘤菌属(Rhizobium)的新微生物，命名为“Rhizobium Sp.M-1I”,和节杆菌属(Arthrobacter)的新微生物,命名为iiArthrobacter Sp.Q36” ；并发现上述微生物能产生非还原性糖生成酶，当这种酶作用于还原性淀粉部分水解产物时，能生成具有海藻糖结构的非还原性糖类，而且当这种酶作用于还原性淀粉部分水解产物时容易制备出所需要的非还原性糖类。
我们还发现，通过先将这种酶作用于还原性淀粉部分水解产物再将所得非还原性糖类用葡萄糖淀粉酶或α-葡萄糖苷酶处理可很容易地制备出海藻糖。这样，本发明人完成了这一发明。此外，我们还从常规微生物中广泛筛选了能产生这种酶的微生物。
结果发现，短杆菌属(Brevibacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、微珠菌属(Micrococcus)、弯曲杆菌(Curtobac`terium)和土杆菌属(Terrabacter)的微生物与根瘤菌属和节杆菌属的微生物一样能产生这种非还原性糖类生成酶，并且我们完成了这一发明。另外，我们建立了制备含有这种非还原性糖类及含非还原性糖类的还原性较低的糖类和/或由这种糖类制成的海藻糖的组合物如食品、化妆品和药品的制品方法，而且我们完成了这一发明。
本发明所涉及的微生物Rhizobium sp.Μ-11以及Arthrobacter sp.Q36分别于1994年6月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉，武汉大学内)，其保藏号分别为 CCTCC M94031 和 CCTCC M94030。
图1表示温度对由根瘤菌属的Rhizobium SP.M-1l菌获得的非还原性糖类生成酶的活性的影响。
图2表示pH值对由根瘤菌属的Rhizobium SP.M-1l菌获得的非还原性糖类生成酶的活性的影响。
图3表示由Rhizibium SP.M-1l菌获得的非还原性糖类生成酶的热稳定性。
图4表示由Rhizibium SP.M-1l菌获得的非还原性糖类生成酶的pH稳定性。
图5表示温度对由节杆菌属的Arthrobacter SP.Q36菌获得的非还原性糖类生成酶的活性的影响。
图6表示pH值对由Arthrobacter SP.Q36菌获得的非还原性糖类生成酶的活性的影响。
图7表示由Arthrobacter SP.Q36菌获得的非还原性糖类生成酶的热稳定性。
图8表示由Arthrobacter SP.Q36获得的非还原性糖类生成酶的pH稳定性。
本发明涉及一种新的非还原性糖类生成酶，以及它的制备和应用。本发明还涉及能够产生这种酶的微生物，用这种酶所制备的非还原性糖类含有所说非原性糖类的相对低还原性糖类，由这些糖类制备的海藻糖、以及含有这些糖类和海藻糖的之一和两者的组合物。
本发明人广泛筛选了能够产生一种新的非还原性糖类生成酶的微生物，当这种酶作用于还原性淀粉部分水解产物时能生成具有海藻糖结构的非还原性糖类，最终发现了目标微生物。
现在，本发明人首先阐述 该根瘤菌属微生物，即本发明的“Rhizobium Sp.M_ll”菌的鉴定试验。该试验是按照在“Bisebutsu-no-Bunvu1-to-Dotei” (微生物分类和鉴定)中所述方法进行的。该书由Takej Hasegawa编辑，由日本科协出版社出版，日本，东京1985)。结果如下:
A.形态学
当在27°C在营养琼脂中培育时细胞的特征:
一般呈 0.6 0.8 X 1.0 1.5 μ m 的杆状；
一般单独存在，但偶尔也以偶联或接合形式存在；
不表现出多形性；
具有游动性、不产孢子性和鞭毛；
不耐酸；
革兰氏染色:阴性；
胞襄:无；
异染粒:有；
能积累多羟丁酸。
B.培养特性
(I)当在27°C在营养琼脂板中培养时所形成的菌落的特征形状:在培养24小时之后圆形菌落的直径为1.5mm左右；
边缘:完整；
突出物:平均或半球形；
光泽:有；
表面:光滑；
颜色:乳白色半透明；
(2)在27°C温度下，在含有葡萄糖和胰蛋白胨的琼脂板上培养时所形成菌落的特征
乳白色半透明菌落具有类粘蛋白；
(3)在27°C温度下，在含有酵母抽提物和甘露醇的琼脂板上培养时所形成菌落的特点
形状:培养5天后，圆形菌落的直径为3mm左右；[0048]颜色:乳白色半透明菌落具有类粘蛋白；
(4)在27°C温度下，在含有酵母抽提物、甘露醇和刚果红的琼脂板上培养时所形成菌落的特征
呈浅桃红色且基本上不吸收刚果红；
(5)在27°C的温度下，在含有酵母抽提物、甘露醇和2W/v% NaCl的琼脂板上生长;
(6)在27°C温度下，在营养琼 脂斜面上培养时所形成菌落的特征
生长:令人满意；
形状:丝状；并且
(7)在27°C温度下在营养明胶上穿刺培养时不会液化明胶。
C.生理特性
(I)硝酸还原作用:阳性
(2)反硝化作用:阴性
(3)甲基红测验:阴性
⑷VP-测验:阴性
(5)吲哚生成:阴性
(6)硫化氢生成:阳性
(7)淀粉水解:阴性
(8)柠檬酸的利用:阳性
(9)无机氮源的利用:
利用了铵盐和硝酸盐；
(10)色素的生成:未生成可溶的色素；
(11)脲酶:阳性
(12)氧化酶:阴性
(13)过氧化氢酶:阳性
(14)生长条件:在ρΗ5.5-9.0和温度4_35°C范围内生长；
(15)需氧情况:需氧；
(16)碳源的利用和酸的生成
权利要求
1.制备如下式所示非还原性糖类或者含有该非还原性糖类的糖组合物的方法，
Gn-T 其中，符号“G”表示葡萄糖残基；“η”为一个或多个整数；“T”表示α，α-海藻糖， 该方法包括步骤: (a)将淀粉物质部分水解，获得含有直链淀粉和/或麦芽寡糖的还原性淀粉部分水解产物； (b)将能够形成如上式所示非还原性糖类的酶作用于步骤(a)中所述还原性淀粉部分水解产物，以形成所述非还原性糖类或者含有该非还原性糖类的糖组合物；和 (C)收集所得到的非还原性糖类或者含有该非还原性糖类的糖组合物； 其中步骤(b)中所述能够形成如上式所示非还原性糖类的酶来自从根瘤菌属(Rhizobium)、节杆菌属(Arthrobacter)、短杆菌属(Brevibacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、微珠菌属(Micrococcus)、弯曲杆菌(Curtobacterium)和土杆菌属(Terrabacter)的微生物中选择的微生物,而且具有以下物理化学特性: (1)作用 当作用于具有3个或3个以上葡萄糖聚合度的一种或多种还原性淀粉部分水解产物时，生成以海藻糖结构为末端单元的非还原性糖类； (2)最适温度 当在pH 7.0条件下培养60分钟时为35-40°C ； (3)最适pH 当在40°C温度下培养60分钟时为pH 6.4-7.2 ； (4)热稳定性 当在pH 7.0培养60分钟时在高达35-40°C的温度下是稳定的； (5)pH稳定性 当在25°C培养16小时时，在5.5 11.0的pH范围是稳定的； (6)分子量 通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测得为76，000-87, 000道尔顿； (7)等电点(PI) 在利用两性电解质进行等电电泳时为3.6-4.6 ； 所述酶具有一个或多个从下组中选择的部分氨基酸序列: (1)X1-精氨酸-苏氨酸-脯氨酸-X2-丝氨酸-苏氨酸-酪氨酸-精氨酸-亮氨酸，其中“X/’指缬氨酸或甲硫氨酸，“X2”指丙氨酸或缬氨酸；
(2)Gly-Val-Glu-Asp-Thr-Ala-Phe-Phe-Arg-Tyr-；
(3)Leu-Val-Gln-Leu-Thr-Met-Pro-Gly-Val-Pro-;和
(4)Glu-Gly-Arg-X3-Ser-X4-Tyr-Ala-X5-Ala,其中 “X3” 指 Gly 或 Gln:“X4” 指 Pro 或Arg ;“X5” 指 Val 或 Glu。
2.如权利要求
1所述的方法，其中用选自由α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶和α-葡糖苷酶组成的组的一种或者多种酶将步骤(C)中所述非还原性糖类进一步水解。
3.如权利要求
1所述的方法，其中步骤(c)还包括将所得到的混合物中的残余还原性糖类氢化成糖醇类。
4.如权利要求
1所述的方法，其中步骤(c)还包括将所得到的混合物用离子交换剂进行柱层析，以除去杂质。
专利摘要
公开了一种新的非还原性糖类生成酶及其制备和应用。这种酶可从Rhizobium Sp.M-11(FERMBP4130)和Arthrobacter Sp.Q36(FERM BP-4316)等微生物的培养物中获取，当其作用于还原性淀粉部分水解产物时可生成具有海藻糖结构的非还原性糖类。当葡萄糖淀粉酶和α-葡糖苷酶作用于这种非还原性糖类时，易于产生海藻糖。这种非还原性糖类和海藻糖可广泛应用于食品、化妆品和药品中。
文档编号C12N9/24GKCN101186939 B发布类型授权 专利申请号CN 200710180720
公开日2013年5月29日 申请日期1994年6月27日
发明者丸田和彥, 久保田伦夫, 杉本利行, 三宅俊雄 申请人:株式会社林原生物化学研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (1),