专利名称：:白僵菌发酵生产苦马豆素的工艺的制作方法
技术领域：
：本发明属于发酵工程
技术领域：
：，特别涉及一种白僵菌发酵生产苦马豆素的工艺。
背景技术：
：苦马豆素的抗肿瘤活性、免疫增强作用及其抗辐射作用是十分明显的，不容质疑。然而制约苦马豆素作为抗肿瘤药物研发，产品产业化，最终走向临床用药的关键是苦马豆素纯品的来源十分匮乏，远远不能满足人们研究的需要。苦马豆素的来源目前有三种途径，(1)从植物中提取分离苦马旦素植物中苦马豆素含量本身很低，仅为0.02%左右，且植物资源受自然因素的影响较大，过度采收会造成草地植被破坏，使草地沙化、退化，不利于草地生态的保护，这样就使得通过植物提取苦马豆素的生产量十分匮乏；(2)人工合成苦马豆素受合成路线及分离技术的限制，使得苦马豆素的来源也十分有限；(3)从真菌菌丝体及其培养液中提取分离苦马豆素基于上述两种途径存在的问题，该途径成为目前的重要研究方向，在文献中也有记载。在中国专利公开号为"CN1396263"，公开日为"2003年2月12日"，发明创造的名称为"生物发酵提纯苦马豆素的工艺"中就介绍了这样的方法。但它存在的问题是①其所采用的微生物菌株是自行从自然界豆科植物屮分离、筛选的可产生苦马豆素的豆类丝核菌7-3菌株(代号)，但没有公开豆类丝核菌7-3菌株的具体获得方法和途径，也没有公开该豆类丝核菌7-3菌株的具体生物学特性、标准、以及品质鉴定方法，同领域的普通技术人员无法按说明书的内容重复实现；②其中采用了柱层析法，该工艺方法成本高，不适宜大规模的工业化生产。因此，采用生物发酵生产苦马豆素，不仅产量高，提取成本低，而且可保护环境，有利于产业化生产。苦马豆素提取工艺中涉及的升华技术，是物质苦马豆素本身所具有，是不以人的主观意志为转移的。因此，现有的苦马豆素提取工艺专利，最后得到纯品都是采用升华技术。
发明内容本发明提供一种白僵菌发酵生产苦马豆素的工艺，以克服现有技术存在的难以再现和成本高的问题。为了克服现有技术存在的问题，本发明采用的技术方案是一种白僵菌发酵生产苦马豆素的工艺，依次包括下述步骤-一、白僵菌的生物发酵，得菌丝体;二、菌丝体中苦马豆素的提取①菌丝体总浸膏提取用超声波法得菌丝体提取浓縮液。②苦马豆素粗品提取；上述得到的菌丝体提取浓縮液，先用浓氨水调pH910，滤去不溶物得到碱水液，碱水液先用46倍量(v/v)的丁醇反复萃取，回收丁醇得到浸膏，所得浸膏用46%(v/v)草酸溶解Ph值为24，滤去不溶物得到酸水液，依次分别用1.52.5倍量(v/v)的氯仿、乙酸乙酯、丁醇萃取除去杂质，再用浓氨水调至pH为912，得到的碱水液依次分别用1.52.5倍量(v/v)的氯仿、乙酸乙酯萃取除杂；剩余液用410倍量的饱和丁醇反复萃取46次，减压回收溶剂得到苦马豆素粗品。③苦马豆素纯品提取称取苦马豆素粗品，用46倍重量体积比(w/v)的碱性氯仿反复溶解处理，减压回收溶剂得到膏状物。所得的膏状物用2倍量(w/v)的蒸馏水溶解，依次用23倍量(v/v)的氯仿、乙酸乙酯萃取除去杂质后挥干。④升华得苦马豆素纯品。上述步骤一中，是在无菌状态下，将白僵菌接种于生物发酵用改良克氏合成I号培养基，2(TC25T通气发酵培养1014天，收集菌丝体，干燥，备用；所述改良克氏合成工号培养基的配方组成为可溶性淀粉10g，糊精10g，硝酸钾2g，磷酸氢二钾2g，氯化钠2g，硫酸镁0.05g，碳酸钙0.02g，硫酸亚铁0.01g，酪蛋白O.3g，DL-赖氨酸O.lg，疯草水提取物5g，水1000ml，并添加少量消泡矿物油。上述步骤二①中，称取一定量的菌丝体，置超声循环提取机，加58倍量的70%乙醇，20KHz超声波室温处理，每次0.51小时，更换溶媒相同条件下超声波提取23次，收集提取液，减压回收溶剂，得到菌丝体提取浓縮液。上述步骤二中，可采用快速薄层色谱技术监测，跟踪苦马豆素的走向，所述的薄层色谱监测技术是采用自制硅胶GF254薄层板或商品化硅胶GF254薄层板(青岛海洋化工厂分厂生产)点样，氯仿甲醇14%氨水(70:26:4，体积比)或乙醇乙酸乙酯(4:1，体积比)上行法展开，双氧水/l(F。醋酐/Ehrlich's试剂喷雾显色。上述步骤二④中，经9095。C油浴减压梯度升华得到苦马豆素纯品。本发明使苦马豆素原材料来源更为便利，有利于工厂化批量生产，使生产成本大幅度降低,最终为促进苦马豆素在抗肿瘤药物及免疫增强剂等方面的产业化提供物质保障。下通过表1来说明本发明与现有技术相比的优点表1白僵菌生物发酵生产苦马豆素工艺与现有技术对比性试验提取生产公开曰期提取方法所用原料成本(万/g)周期(天/周期)提取率Cmg/kg)备注豆类丝核菌发酵提取自行分离的豆类丝核菌了-3(未鉴定)发酵菌丝体1021152003.02.12生物发酵提纯苦马豆素工艺，公告号CN1396263疯-争中苦马豆素的提取lt肃棘豆(青海)2028152003.02.12疯草中苦马豆素的提纯工艺，公黄花棘豆(宁夏〕152892003.02.12告"CN1396161毛瓣棘豆(西藏)252882003.02.12宽苞棘豆(青海)2528122003.02.12急弯棘豆(靑海)252872003.02.12冰川棘豆(西藏)252872003.02.12茎直黄芪(西藏〉252862003.02.12变异黄芪(宁夏)828182003.02.12-种从疯草中提取马豆素的新方法，冰川棘豆(西藏〉1020262007.10.10-种从疯草中提取马豆素的新方法，，公告号CN101050214白僵菌发酵提取(购买于中国农业科学院微生物菌丝体51480本发明的技术具有以下几个优点:①菌种的来源和质量有保障本发明专利所使用的白僵菌菌株是从我国西部草地生长的疯草类特有植物及其生长环境(土壤)中分离筛选的产苦马豆素菌株-白僵菌，或从中国农业科学院微生物菌种保存中心购买的标准菌株一白僵菌，是经过中国农业科学院微生物菌种保存中心鉴定的。②可替代草地疯草植物资源，不破坏草地植被本发明专利采用生物发酵技术生产苦马豆素，不需采集大量疯草，不破坏草地植被，有利于生态保护，克服植物疯草资源的匮乏问题。③生产产量率高、提取成本低，提取周期短，产品纯度达》98%，，利用白僵菌发酵系统生产并提纯苦马豆素，使苦马豆素来源更为便利，有利于产业化批量生产，为促进苦马豆素在抗肿瘤药物及免疫增强剂研发方面提供物质保障。④安全、环保本发明专利所用的试剂，如乙醇，乙酸乙酯，丁醇、草酸、氨水毒性很低，达到国家环保要求。具体实施方式为了容易理解本发明，以下结合附图和发明人给出的具体对比试验例以及对本发明工艺制备的产品的具体指标检测数据，来对本发明进一步详细说明。1、从白僵菌菌丝体中提取苦马豆素的稳定性试验由于不同批次的发酵培养，使得菌丝体中的苦马豆素量也有差异。采用本发明技术进行了不同批次的放大发酵培养下菌丝体中苦马豆素的提纯，提取结果见表2。菌丝体中苦马豆素纯品的平均提取率为80mg/kg。表2菌丝体中苦马豆素提取结果<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2、用本发明的工艺提取的苦马豆素纯品的光谱数据及技术指标①苦马豆素紫外(UV)光谱数据UV入max:289(1og4.67)，249(1og3.83)。②苦马豆素红外(IR)光谱数据IRmax(KBr，cm-1):3423(0-H)，2943，2891(C-H)，28282724(Bohlmann带)，1072(C-0)吸收峰。③苦马豆素GC光谱数据苦马豆素分子结构中含有羟基，与单糖结构相似，因此GC直接进样不出峰，所以要进行GC分析必须首先制备成硅醚衍生物。苦马豆素用100u1吡啶溶解，用100y1BSTFA+TMCS(99:1)室温处理30min，形成TMS衍生物。在0.32mmX30mSE-30毛细管柱(具注入柱)进行气相色谱。柱温从120。C逐渐升高至300°C，5°C/min，13.77min出峰。④苦马豆素质谱(MS)光谱数据EI-MSm/e:173(M+)，155(M-H20)，138(M-H20-0H)，116(M-2H20-0H)，115，113(基峰)，96，84，72，43(母核裂解碎片峰)。⑤苦马豆素氢谱(1HNMR)和碳谱(13C腿R)光谱数据1H湖R(400M，D20，ppm):S4.340(m，J=2.0and8.0Hz,H-2)，S4.245(dd，J=4.0and5.6Hz，H-l)，53.792(td，J=4.4and10.4Hz，H-8)，S2.896(m，H-5eq),S2.868(dd，J=2.0and8.0Hz，H-3eq),S2.543(dd,J=8.0and11.2Hz,H-3ax)，52.031(m，H-7eq)，SI.945(m，H-8a)，SI.918(m，J=3.6and12.8Hz，H-5ax)，δ1.708(br，d,J二13.6Hz,H-6eq)，δ1.504(qt，J=4and13.2Hz，H—6ax),δ1.228(qd，J=4andl2.8Hz，，H-7ax);13CNMR(400M，D20，卯m):δ75.1(C-2),δ72.0(C-l)，δ71.4(C—8)，δ68.7(C—8a)，δ62.9(C—3)，δ54.0(05〉，δ34.8(C-7),δ25.5(C—6)。苦马豆素白色针状结晶，分子量为173，熔点144145℃，纯度≥98%。UV、IR、GC、MS、應R光谱数据与苦马豆素标准光谱数据完全吻合。表3苦马豆素的技术性能指标指标体系技术性能外观白色细针状结晶熔点144145℃分子量173酸离解常数Pka7.4生化特性a甘露糖甙酶高效、专一抑制剂硅胶GF254板点样，乙酸乙酯一乙醇(1:4，体积比)展开，薄层层析特性R,值O.45处有一紫红色斑点红外光谱(IR)有典型的Bohlmanband吸收质谱(MS)分子离子峰为173气相色谱(GC)BSTFA+TMCS衍生物保留时间13.77min保质期无菌抽真空分装，密封保存于-4℃冰箱，保质期3年色谱纯度(％)≥98%下面通过发明人给出的具体实施例来进一步说明本发明的提取工艺。该工艺中采用的白僵菌可以是来源于我国西部草地生长的疯草类特有植物及其生长环境(土壤)中分离筛选的产苦马豆素菌株-白僵菌，或从中国农业科学院微生物菌种保存中心保存的标准菌株一白僵菌(BeauveriabassianaVuill)，编号为ACCC30112，也可以是其它渠道获得的白僵菌。白僵菌菌株的保存与传代将白僵菌接种于高氏合成一号培养基(Gause'ssyntheticNol)培养基，培养46天，待菌种充分生长发育后，置-20℃低温冰箱保存，每12个月传代一次；所述的高氏合成一号培养基的配方组成为硝酸钾lg，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，磷酸氢二钾O.5g，氯化钠O.5g，可溶性淀粉20g，琼脂20g，水1000ml。实施例1:一、白僵菌的生物发酵将白僵菌在无菌状态下，接种于2L生物发酵用改良克氏合成I号培养基，25℃通气培养14天，收集菌丝体130g，干燥，备用。所述改良克氏合成I号培养基的配方组成为可溶性淀粉10g，糊精10g，硝酸钾2g，磷酸氢二钾2g，氯化钠2g，硫酸镁0.05g，碳酸钙，硫酸亚铁0.01g，酪蛋白0.3g，DL-赖氨酸O.lg，疯草水提取物5g，水1000ml，并添加2.5g的消泡矿物油。二、菌丝体中苦马豆素的提取①菌丝体总浸膏提取准确称取菌丝体130g置入70%乙醇溶液1250mL，20KHz超声波室温处理4次，每次1小时，收集乙醇提取液合并。收集的提取液减压回收溶剂，得到菌丝体浓縮液300mL。②苦马豆素粗品提取；上述得到的菌丝体提取浓縮液，先用浓氨水调pH10，滤去不溶物得到碱水液，碱水液先用4倍量(v/v)的丁醇反复萃取4次，回收丁醇得到浸膏，所得浸膏用6%(v/v)草酸溶解Ph值为2，滤去不溶物得到酸水液，依次分别用2.5倍量(v/v)的氯仿、乙酸乙酯、丁醇萃取除去杂质，再用浓氨水调至pH为9，得到的碱水液依次分别用2倍量(v/v)的氯仿、乙酸乙酯萃取除杂；剩余液用10倍量的饱和丁醇反复萃取4次，减压回收溶剂得到苦马豆素粗品。③苦马豆素纯品提取用6倍重量体积比(w/v)的碱性氯仿反复溶解处理苦马豆素粗品，减压回收溶剂的膏状物。所得的膏状物用1.5倍量,(v/v)的蒸馏水溶解，依次用2倍量(v/v)的氯仿、乙酸乙酯萃取除去杂质后挥干。④最后经9095"油浴减压梯度升华得到苦马豆素纯品9.8mg。菌丝体中苦马豆素的提取率为75.4mg/kg。一、白僵菌的生物发酵白僵菌在无菌状态下，接种于5L牛物发酵用改良克氏合成I号培养基，23。C通气培养12天，收集菌丝体328g，干燥，备用。所述改良克氏合成I号培养基的配方组成为可溶性淀粉10g，糊精10g，硝酸钾2g，磷酸氢二钾2g，氯化钠2g，硫酸镁O.05g，碳酸钙O.02g，硫磁亚铁O.()lg，酪蛋白0.3g，DL-赖氨酸O.lg，疯草水提取物5g，水1000ml，并添加2g消泡矿物油。二、菌丝体中苦马豆素的提取①菌丝体总浸膏提取准确称取菌丝体328g置入7(F。乙醇溶液3000mL,20KHz超声波室温处理4次，每次0.5小时，收集乙醇提取液合并。收集的提取液减压回收溶剂，得到菌丝体浓縮液600mL。②苦马豆素粗品提取；上述得到的菌丝体提取浓缩液，先用浓氨水调PH9，滤去不溶物得到碱水液，碱水液先用6倍量(v./v)的丁醇反复萃取5次，回收丁醇得到浸膏，所得浸膏用4%(v/v)草酸溶解Ph值为4，滤去不溶物得到酸水液，依次分别用1.5倍量(v/v)的氯仿、乙酸乙酯、丁醇萃取除去杂质，再用浓氨水调至pH为9，得到的碱水液依次分别用2.5倍量(v/v)的氯仿、乙酸乙酯萃取除杂；剩余液用4倍量的饱和丁醇反复萃取6次，减jJi回收溶剂得到苦马豆素粗品。③苦马豆素纯品提取用4倍重量体积比(w/v)的碱性氯仿反复溶解处理苦马豆素粗品，减压回收溶剂的膏状物。所得的膏状物用1.5倍量(v/v)的蒸馏水溶解，依次用3倍量(v/v)的氯仿、乙酸乙酯萃取除去杂质后挥干。④最后经9095'C油浴减压梯度升华得到苦马豆素纯品26.1mg。菌丝体中苦马豆素的提取率为79.6mg/kg。实施例3:一、白僵菌的生物发酵将白僵菌在无菌状态下，接种于IOL生物发酵用改良克氏合成I号培养基，20℃通气培养10天，收集菌丝体675g，干燥，备用。所述改良克氏合成I号培养基的配方组成为可溶性淀粉10g，糊精10g，硝酸钾2g，磷酸氢二钾2g，氯化钠2g，硫酸镁O.05g，碳酸钙O.02g，硫酸亚铁O.Olg，酪蛋白O.3g，DL-赖氨酸O.lg，疯草水提取物5g，水1000ml，并添加l.5g量消泡矿物油。二、菌丝体中苦马豆素的提取①菌丝体总浸膏提取准确称取菌丝体675g置入70%乙醇酒精溶液7000niL，20KHz超声波室温处理4次，每次0.5小时，收集乙醇提取液合并。收集的提取液减压回收溶剂，得到菌丝体浓缩液1300mL。②苦马豆素粗品提取上述得到的菌丝体提取浓縮液，先用浓氨水调pH9丄0，滤去不溶物得到碱水液，碱水液先用5倍量(v/v)的丁醇反复萃取6次，回收丁醇得到浸膏，所得浸膏用5%(v/v)草酸溶解Ph值为3，滤去不溶物得到酸水液，依次分别用2倍量(v/v)的氯仿、乙酸乙酯、丁醇萃取除去杂质，再用浓氨水调至pH为10，得到的碱水液依次分别用2倍量(v/v)的氯仿、乙酸乙酯萃取除杂；剩余液用6倍量的饱和丁醇反复萃取5次，减压回收溶剂得到苦马豆素粗品。③苦马豆素纯品提取用5倍重量的碱性氯仿反复溶解处理苦马豆素粗品，减压回收溶剂的膏状物。所得的膏状物用2倍量(v/v)的蒸馏水溶解，依次用2.5倍量的(v/v)氯仿、乙酸乙酯萃取除去杂质后挥千。④9095。C油浴减压梯度升华得到苦马豆素纯品54.6mg。菌丝体中苦马豆素的提取率为80.9mg/kg。上述三个实施例中，均采用薄层色谱监测技术来监测。所述的薄层色谱监测技术是硅胶GF254薄层板点样，氯仿甲醇:14%氨水(70:26:4，体积比)或乙醇:乙酸乙酯(4:1，体积比)上行法展开，双氧水/10%醋酐/Ehrlich's试剂喷雾显色。权利要求1、一种白僵菌发酵生产苦马豆素的工艺，依次包括下述步骤一、白僵菌的生物发酵，得菌丝体；二、菌丝体中苦马豆素的提取①菌丝体总浸膏提取用超声波法得菌丝体提取浓缩液；②苦马豆素粗品提取；上述得到的菌丝体提取浓缩液，先用浓氨水调pH9～10，滤去不溶物得到碱水液，碱水液先用4～6倍量(v/v)的丁醇反复萃取，回收丁醇得到浸膏，所得浸膏用4～6％(v/v)草酸溶解Ph值为2～4，滤去不溶物得到酸水液，依次分别用1.5～2.5倍量(v/v)的氯仿、乙酸乙酯、丁醇萃取除去杂质，再用浓氨水调至pH为9～12，得到的碱水液依次分别用1.5～2.5倍量(v/v)的氯仿、乙酸乙酯萃取除杂；剩余液用4～10倍量的饱和丁醇反复萃取4～6次，减压回收溶剂得到苦马豆素粗品；③苦马豆素纯品提取称取苦马豆素粗品，用4～6倍重量体积比(w/v)的碱性氯仿反复溶解处理，减压回收溶剂得到膏状物。所得的膏状物用2倍量(w/v)的蒸馏水溶解，依次用2～3倍量(v/v)的氯仿、乙酸乙酯萃取除去杂质后挥干；④升华得苦马豆素纯品。2、如权利要求l所述的白僵菌发酵生产苦马豆素的工艺，其特征在于所述步骤一中，是在无菌状态下，将白僵菌接种于生物发酵用改良克氏合成I号培养基，2(TC25。C通气发酵培养1014天，收集菌丝体，干燥，备用；3、如权利要求1或2所述的白僵菌发酵生产苦马豆素的工艺，其特征在于所述改良克氏合成I号培养基的配方组成为可溶性淀粉10g，糊精10g，硝酸钾2g，磷酸氢二钾2g，氯化钠2g，硫酸镁0.05g，碳酸f丐0.02g，硫酸亚铁0.Olg，酪蛋白0.3g，DL-赖氨酸O.lg,疯草水提取物5g，水1000ml，并添加少量消泡矿物油。4、如权利要求3所述的白僵菌发酵生产苦马豆素的工艺，其特征在于所述步骤二①中，称取一定量的菌丝体，置超声循环提取机，加58倍量的70%乙醇，20KHz超声波室温处理，每次0.51小时，更换溶媒相同条件下超声波提取23次，收集提取液，减压回收溶剂，得到菌丝体提取浓縮液。5、如权利要求4所述的白僵菌发酵生产苦马豆素的工艺，其特征在于所述步骤二中，可采用快速薄层色谱技术监测，跟踪苦马豆素的走向，所述的薄层色谱监测技术是采用自制硅胶GF254薄层板或商品化硅胶GF254薄层板(青岛海洋化工厂分厂生产)点样，氯仿甲醇14%氨水(70:26:4，体积比)或乙醇乙酸乙酯(4:1，体积比)上行法展开，双氧水/10。/o醋酐/Ehrlich，s试剂喷雾显色。6、如权利要求5所述的白僵菌发酵生产苦马豆素的工艺，其特征在于所述歩骤二④中，经9095。C油浴减压梯度升华得到苦马豆素纯品。专利摘要本发明属于发酵工程
技术领域：
：，特别涉及一种白僵菌发酵生产苦马豆素的工艺。本发明提供一种白僵菌发酵生产苦马豆素的工艺，以克服现有技术存在的难以再现和成本高的问题。为了克服现有技术存在的问题，本发明采用的技术方案是一种白僵菌发酵生产苦马豆素的工艺，依次包括下述步骤一、白僵菌的生物发酵，得菌丝体；二、菌丝体中苦马豆素的提取①菌丝体总浸膏提取用超声波法得菌丝体提取浓缩液；②苦马豆素粗品提取；反复萃取得苦马豆素粗品；③苦马豆素纯品提取，采用升华技术得苦马豆素纯品。文档编号C12P17/02GKCN101200745SQ200710199249公开日2008年6月18日申请日期2007年12月17日发明者刘彬慧,来航线,贺武利,赵宝玉申请人:杨凌天力生物技术有限公司导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan