专利名称：疯草中苦马豆素的提纯工艺的制作方法
一、所属领域本发明属于天然产物化学研究领域，涉及天然产物提取、分离和鉴定方法，特别涉及一种疯草中苦马豆素的提纯工艺。
国内对疯草有毒成分的研究起步较晚。20世纪80年代初期，国内学者主要进行了草地疯草种类、种群地理分布的资源调查。80年代中期开始了疯草有毒成分的分离研究，1989年曹光荣等首次从我国黄花棘豆中分离鉴定出苦马豆素，并证明是其主要有毒成分。在随后的十几年间，主要是曹光荣课题组及其培养的博士、硕士研究生围绕我国甘肃棘豆、黄花棘豆、茎直黄芪、宽苞棘豆变异黄芪等疯草系统地开展了研究工作，相继取得了一些突破性进展，主要有从多种疯草类植物中分离并鉴定出苦马豆素；多种疯草类植物中苦马豆素的定量分析；改进了苦马豆素的提取工艺及其参数；此项研究成果，在1996年获得农业部科技进步三等奖。
国外分离提纯苦马豆素的主要技术工艺是先将植物样品在有机溶剂中浸提，再将浸提物过阳离子交换柱和琼脂糖凝胶柱，最后重结晶获得苦马豆素。其不足是提取率低，不能批量生产。国内在苦马豆素提纯的主要技术工艺方面尚属空缺。
针对上述现有技术中存在的缺陷和不足，本发明的目的在于，提供一种疯草中苦马豆素的提纯工艺，本提纯工艺采用阳离子交换柱层析、硅胶柱层析，分段升华等技术，最后获得苦马豆素，这样可使苦马豆素的提取率增加，产品纯度提高。增强市场的竟争力，促进苦马豆素作为抗肿瘤药物及免疫增强剂等开发的产业化。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是，疯草中苦马豆素的提纯工艺，其特点是，根据苦马豆素的基本理化特性，首先采用阳离子交换法提取出大极性生物碱粗品，再用碱性氯仿抽提，抽提部分经硅胶柱层析分离得到苦马豆素粗品，最后分步升华获得苦马豆素纯品。
本发明的具体提纯工艺分以下五个阶段完成第一步，浸膏提取阶段用工业甲醇从疯草类植物中提取出有机成分总浸膏。
第二步，粗生物碱提取阶段采用阳离子交换法提取出粗生物碱。
第三步，苦马豆素粗品提取阶段采用溶剂抽提法提取出苦马豆素粗品。
第四步，苦马豆素提取阶段采用硅胶柱层析提取出苦马豆素。
第五步，苦马豆素纯化阶段采用分步升华法提取出苦马豆素纯品。
本发明的提纯工艺提取成本低，产品纯度高，且苦马豆素提取率明显优于国外技术。
本发明以我国西北草原上丰富的疯草类植物—黄花棘豆、甘肃棘豆、小花棘豆、茎直黄芪、变异黄芪等为材料，根据苦马豆素的基本理化特性，采用阳离子交换法提取出大极性生物碱粗品，再用碱性氯仿抽提，抽提部分经硅胶柱层析分离得到苦马豆素粗品，最后分步升华获得苦马豆素纯品。
1.苦马豆素的提纯原理苦马豆素属多羟基吲哚里西啶类生物碱，分子量小，极性大，易溶于水、甲醇、乙醇、碱性氯仿等，易吸潮，且具有升华特性。本技术工艺根据苦马豆素的基本理化特性，首先采用阳离子交换法提取出大极性生物碱粗品，再用碱性氯仿抽提，抽提部分经硅胶柱层析分离得到苦马豆素粗品，最后分步升华获得苦马豆素纯品。2.苦马豆素提纯的工艺路线第一步植物样品(疯草草粉)中有机总成分提取。称取一定量的疯草草粉，用5-10倍量工业甲醇反复冷浸提取4-6次，每次冷浸7天，过滤，合并甲醇液，减压回收甲醇得浸膏。
第二步生物碱粗品提取。回收甲醇所得的浸膏，用10-50倍(重量/体积)量1N盐酸反复多次溶解，过滤，直到最后一次酸水液生物碱检查阴性为止。合并滤液，用浓氨水调pH4-5，通过氢型阳离子交换树脂柱，先用无离子水洗脱到流出液为无色，再用1N氨水洗脱，收集碱性洗脱液，回收溶剂，抽干得生物碱粗品。
第三步苦马豆素粗品提取。第二步得到的生物碱粗品，先用分析纯甲醇溶解，过滤，残渣弃取，甲醇液减压回收溶剂，所得浸膏再用碱性氯仿抽提，合并氯仿液，最后回收氯仿得苦马豆素粗品。
第四步苦马豆素分离。采用硅胶柱层析，干法上样，氯仿—甲醇—氨水—水梯度洗脱，TLC检测，合并苦马豆素部分，减压抽干，得浅黄色粉末样苦马豆素。
第五步苦马豆素纯化。第四步得到的浅黄色粉末样苦马豆素，采用分步升华法获得苦马豆素纯品。
发明人给出了以下的实施例，但本发明不限于这些实施例。
实施例1甘肃棘豆中苦马豆素的提取第一步，浸膏提取阶段甘肃棘豆干草粉5kg，用30升工业甲醇冷浸提取4次，每次冷浸7天，过滤，合并甲醇液，减压回收甲醇得到总浸膏680g，出膏率为13.6％。
第二步，粗生物碱提取阶段680g总浸膏用6800mL1N盐酸反复多次研溶，过滤，直到最后一次酸水液改良碘化铋钾检查呈阴性反应为止，合并酸水液。所得酸水液用浓氨水调pH至4-5，通过氢型阳离子交换树脂柱，先用上样量的100倍量无离子水洗脱至无色，再用20倍量1N氨水洗脱，收集碱性流出液，减压回收溶剂得62.56g生物碱粗品，出碱率为1.3％。
第三步，苦马豆素粗品提取阶段62.56g生物碱粗品先用分析纯甲醇溶解，过滤，回收溶剂，浸膏再用碱性氯仿抽提，直到抽提液检不出苦马豆素为止，合并抽提液，减压回收氯仿提取出苦马豆素粗品4g，提取率为0.08％。
第四步，苦马豆素提取阶段4g苦马豆素粗品与等量的柱层析用硅胶拌样，干法上样，氯仿—甲醇—氨水—水梯度洗脱，每20mL收集1份，共收集300组份，TLC检查合并同类，提取出苦马豆素0.5g。
第五步苦马豆素纯化阶段0.5g苦马豆素于特制的升华管中抽真空拉干，置油浴，采用分步升华法得到苦马豆素纯品75mg，提取率为0.0015％。
实施例2黄花棘豆中苦马豆素的提取第一步浸膏提取阶段黄花棘豆干草粉11.5kg，用70升工业甲醇冷浸提取6次，每次冷浸7天，过滤，合并甲醇液，减压回收甲醇得到总浸膏1600g，出膏率为13.9％。
第二步粗生物碱提取阶段1600g总浸膏用16000mL1N盐酸反复多次研溶，过滤，直到最后一次酸水液改良碘化铋钾检查呈阴性反应为止，合并酸水液。所得酸水液用浓氨水调pH至4-5，通过氢型阳离子交换树脂柱，先用上样量的100倍量无离子水洗脱至无色，再用20倍量1N氨水洗脱，收集碱性流出液，减压回收溶剂得127g生物碱粗品，出碱率为1.1％。
第三步苦马豆素粗品提取阶段127g生物碱粗品先用分析纯甲醇溶解，过滤，回收溶剂，浸膏再用碱性氯仿抽提，直到抽提液检不出苦马豆素为止，合并抽提液，减压回收氯仿提取出苦马豆素粗品5g，提取率为0.0043％。
第四步苦马豆素提取阶段g苦马豆素粗品与等量的柱层析用硅胶拌样，干法上样，氯仿—甲醇—氨水—水梯度洗脱，每30mL收集1份，共收集400组份，TLC检查合并同类，提取出苦马豆素0.58g。
第五步苦马豆素纯化阶段0.58g苦马豆素于特制的升华管中抽真空拉干，置油浴，采用分步升华法得到苦马豆素纯品105mg，提取率为0.0009％。
实施例3甘肃棘豆中苦马豆素的提取第一步浸膏提取阶段甘肃棘豆干草粉20kg，用100升工业甲醇冷浸提取4次，每次冷浸5天，过滤，合并甲醇液，减压回收甲醇得到总浸膏2230g，出膏率为11.2％。
第二步粗生物碱提取阶段2230g总浸膏用15000mL1N盐酸反复多次研溶，过滤，直到最后一次酸水液改良碘化铋钾检查呈阴性反应为止，合并酸水液。所得酸水液用浓氨水调pH至4-5，通过氢型阳离子交换树脂柱，先用上样量的100倍量无离子水洗脱至无色，再用30倍量1N氨水洗脱，收集碱性流出液，减压回收溶剂得219.1g生物碱粗品，出碱率为1.095％。
第三步苦马豆素粗品提取阶段219.1g生物碱粗品先用分析纯甲醇溶解，过滤，回收溶剂，得浸膏155.4g，再用碱性氯仿抽提，直到抽提液检不出苦马豆素为止，合并抽提液，减压回收氯仿提取出苦马豆素粗品15g，提取率为0.075％。
第四步苦马豆素提取阶段15g苦马豆素粗品与等量的柱层析用硅胶拌样，干法上样，氯仿—甲醇—氨水—水梯度洗脱，每50mL收集1份，共收集350组份，TLC检查合并同类，提取出苦马豆素2.1g。
第五步苦马豆素纯化阶段2.1g苦马豆素于特制的升华管中抽真空拉干，置油浴，采用分步升华法得到苦马豆素纯品236mg，提取率为0.0012％。
实施例4变异黄芪中苦马豆素的提取第一步浸膏提取阶段变异黄芪干草粉2kg，用10升工业甲醇冷浸提取6次，每次冷浸7天，过滤，合并甲醇液，减压回收甲醇得到总浸膏219g，出膏率为10.95％。
第二步粗生物碱提取阶段219g总浸膏用2500mL1N盐酸反复多次研溶，过滤，直到最后一次酸水液改良碘化铋钾检查呈阴性反应为止，合并酸水液。所得酸水液用浓氨水调pH至4-5，通过氢型阳离子交换树脂柱，先用上样量的100倍量无离子水洗脱至无色，再用30倍量1N氨水洗脱，收集碱性流出液，减压回收溶剂得22.797g生物碱粗品，出碱率为1.14％。
第三步苦马豆素粗品提取阶段22.797g生物碱粗品先用分析纯甲醇溶解，过滤，回收溶剂，浸膏再用碱性氯仿抽提，直到抽提液检不出苦马豆素为止，合并抽提液，减压回收氯仿提取出苦马豆素粗品2.6g，提取率为0.13％。
第四步苦马豆素提取阶段2.6g苦马豆素粗品与等量的柱层析用硅胶拌样，干法上样，氯仿—甲醇—氨水—水(70∶26∶2∶2)洗脱，每10mL收集1份，共收集200组份，TLC检查合并同类，提取出苦马豆素0.3g。
第五步苦马豆素纯化阶段将0.3g苦马豆素置于特制的升华管中，抽真空拉干，采用分步升华法得到苦马豆素纯品35mg，提取率为0.0018％。
本发明所产生的效果是1.苦马豆素提取率我国疯草类植物有44种，分布面积超过400万公顷，由于其生长的生态环境不同，使得不同种疯草类植物所含的苦马豆素量也有差异。采用本发明技术对以下疯草中苦马豆素进行了提取，提取结果见表1。
表1 我国主要疯草类植物中苦马豆素提取结果出膏率 出碱率苦马豆素提取率植物名称采样部位(％) (％) (％)甘肃棘豆(青海) 地上全草 13.6 1.3 0.0015黄花棘豆(宁夏) 地上全草 13.9 1.1 0.0009毛瓣棘豆(西藏) 地上全草 8.95 0.78 0.0008宽苞棘豆(青海) 地上全草 9.95 0.7 0.0012地上全草12.6 0.95 0.007急弯棘豆(青海)冰川棘豆(西藏) 地上全草 8.96 0.85 0.0007茎直黄芪(西藏) 地上全草 10.2 1.0 0.0006变异黄芪(宁夏) 地上全草 10.95 1.14 0.00182.苦马豆素技术指标表2列出了本发明提取的苦马豆素的技术性能指标。
苦马豆素白色针状结晶，分子量为173，熔点144～145℃，纯度≥98％。UV、IR、GC、MS、NMR光谱数据与苦马豆素标准光谱数据完全吻合。
苦马豆素UV光谱数据UVλmax289(log4.67)，249(log3.83)(参见图2)。
苦马豆素IR光谱数据IRmax(KBr)cm-13431，3370(-OH)，2946，2806(CH)，2806～2725(Bohlman band)，1074(C-O)等吸收峰(参见图3)。
苦马豆素GC光谱数据苦马豆素分子结构中含有羟基，与单糖结构相似，因此GC直接进样不出峰，所以要进行GC分析必须首先制备成硅醚衍生物。苦马豆素用100μl吡啶溶解，用100μl BSTFA室温处理30min，形成TMS衍生物。在0.32mm×30m SE-30毛细管柱(具注入柱)进行气相色谱。柱温从120℃逐渐升高至300℃，5℃/min，13.77min出峰。
苦马豆素MS光谱数据EIMSm/e173(M+)，155(M-H2O)，138(M-H2O-OH)，116，115，96，84，72，43(母核裂解碎片峰)(参见图4)。
3.本发明的提纯工艺提取成本低，产品纯度高，且苦马豆素提取率明显优于国外技术。
表2苦马豆素的技术性能指标
权利要求
1.一种疯草中苦马豆素的提纯工艺，其特征在于，根据苦马豆素的基本理化特性，首先采用阳离子交换法提取出大极性生物碱粗品，再用碱性氯仿抽提，抽提部分经硅胶柱层析分离得到苦马豆素粗品，最后分步升华获得苦马豆素纯品。
2.根据权利要求1所述的疯草中苦马豆素的提纯工艺，其特征在于，其具体提纯工艺按以下步骤进行第一步植物样品(疯草草粉)中有机总成分提取称取一定量的疯草草粉，用(5-10)倍量工业甲醇反复冷浸提取4次-6次，每次冷浸7天，过滤，合并甲醇液，减压回收甲醇得浸膏；第二步生物碱粗品提取将回收甲醇所得的浸膏，用(10-50)倍(重量/体积)量1N盐酸反复多次溶解，过滤，直到最后一次酸水液生物碱检查阴性为止；合并滤液，用浓氨水调pH4-pH5，通过氢型阳离子交换树脂柱，先用无离子水洗脱到流出液为无色，再用1N氨水洗脱，收集碱性洗脱液，回收溶剂，抽干得生物碱粗品；第三步苦马豆素粗品提取将第二步得到的生物碱粗品，先用分析纯甲醇溶解，过滤，残渣弃取，甲醇液减压回收溶剂，所得浸膏再用碱性氯仿抽提，合并氯仿液，最后回收氯仿得苦马豆素粗品；第四步苦马豆素分离采用硅胶柱层析，干法上样，氯仿—甲醇—氨水—水梯度洗脱，TLC检测，合并苦马豆素部分，减压抽干，得浅黄色粉末样苦马豆素；第五步苦马豆素纯化将第四步得到的浅黄色粉末样苦马豆素，采用分步升华法获得苦马豆素纯品。
全文摘要
本发明公开了一种疯草中苦马豆素的提纯工艺。疯草是豆科棘豆属和黄芪属有毒植物的总称，是世界范围内危害草原畜牧业生产可持续发展最严重的毒草。在我国疯草有44种，主要分布于内蒙古、宁夏、甘肃、青海、新疆、西藏、陕西、四川等省区，分布面积超过400万公顷。本发明以我国西北草原上丰富的疯草类植物——黄花棘豆、甘肃棘豆、小花棘豆、茎直黄芪、变异黄芪等为材料，根据苦马豆素的基本理化特性，采用阳离子交换法提取出大极性生物碱粗品，再用碱性氯仿抽提，抽提部分经硅胶柱层析分离得到苦马豆素粗品，最后分步升华获得苦马豆素纯品；本发明的提纯工艺分五步完成，提取成本低，产品纯度高，且苦马豆素提取率明显优于国外技术。
文档编号C07D311/58GK1396161SQ02114590
公开日2003年2月12日 申请日期2002年5月24日 优先权日2002年5月24日
发明者曹光荣, 童德文, 赵宝玉, 葛鹏斌 申请人:杨凌大农生物技术有限公司