自组装的肽两亲物和用于生长因子传递的相关方法

专利名称:自组装的肽两亲物和用于生长因子传递的相关方法
自组装的肽两亲物和用于生长因子传递的相关方法
本申请要求2003年12月5日提交的申请序列号为60/527，504的优先权权益，该申请通过参考整体并入本文。
由于美国能源部对西北大学(Norttiwestern University)的资助(资助号 DE-FG02-00ER54810)，美国政府对该发明拥有某些权利。
背景技术：
生长因子在细胞特化中发挥着重要作用，并且是在体内有希望控制干细胞分化或重新激活休眠的生物过程的因子，这两者都可能导致无功能组织的再生。生长因子从细胞位点或损伤处快速降解并迅速扩散掉。因此，一种结构(architecture)或支架(scaffold) 可用于将生长因子保留在这样的位置，以便以可控的方式释放到周围的细胞。
在分子水平设计的用于组织再生的材料在高端医学领域中正在引起人们的极大兴趣。合成的聚合物和生物聚合物的支架已经被研究，所述合成聚合物包括基于L-乳酸或乙醇酸的聚合物，所述生物聚合物包括胶原、纤维蛋白或藻酸盐。生长因子已经通过物理的方法被捕获到水凝胶这样的聚合物中，共价连接到或利用静电结合到阴离子聚合物或者结构诸如肝素上。这些系统和相关系统的缺陷或者涉及对结合的生长因子的非特异性，或者涉及需要降解共价键以获得期望的效果。最近，已经对天然和合成支架进行了修饰，以含有在胞外蛋白质中发现的肽，其促进以受体为基础的与细胞的相互作用并且已经被用于促进细胞粘附或分化。
在自组装中的进展为生物材料的分子设计提供了新的机会。两亲性分子组装单元 (building blocks)可以在含水环境中被组装，形成具有明确限定的和多样的化学结构的支架。在文献中已经报道了各类基于肽的两亲物，包括两亲肽和在一端或两端用疏水性组分(例如，烷基尾(alkyl tails))功能化的肽。两亲肽已经显示出可以形成各种超分子结构，比如纳米带(nanotape)、带(ribbons)、纤维和扭带(twisted ribbon)。这些结构源于在两亲性分子之间片层的形成。特殊的例子是两亲肽嵌段共聚物，其形成具有强烈依赖于各个肽嵌段二级结构的特性的胶。在一端携带有烷基尾的肽两亲物的例子包括衍生自胶原中发现的肽模体(motif)的两亲物，其导致形成三螺旋单元，三螺旋单元形成球状或盘样胶束结构，这取决于尾的长度和尾的数量。另一类型具有两个尾，每个末端一个。这类两亲物显示出淀粉样行为，因为一旦增加浓度，它们便从随机的卷曲转变为片类型的构象，导致形成纤维状结构。已有反向平行排列的纯肽纳米结构的报道，有一个报道报道了两个修饰的肽两亲物，其在非天然的烷基化季铵盐的促进下以反平行排列的方式聚集。
一类肽两亲物(PAs)公开在两个同时在审申请中的其中一个或两个中，所述肽两亲物包括连接到肽单元(P印tide block)的线性疏水尾，所述肽单元包括β-片形成片段、溶解性所需的带电荷残基，和生物学表位。烷基尾被连接到肽的N-端，表位片段被置于C-端。一旦应用触发因素(trigger)，诸如ρΗ或离子浓度变化，这些PA分子可以在含水介质中自组装成纳米纤维。烷基链位于纤维的核心，表位展示在周围，用于细胞相互作用。已被掺入到PA分子中的表位模拟胞外基质蛋白，并通过细胞信号传导促进细胞粘附或分化。也已经显示，具有不同的表位和互补电荷的两种不同的PA分子可以被共组装成同样的纳米纤维。参见2003年2月18日提交的同时在审申请序列号10/368，517(国际公开号WO 03/070749)和2002年11月14日提交的申请序列号10Λ94，114(国际公开号WO 03/054146)，它们每一个都通过参考整体并入本文。
然而，这样的PA化合物通常通过固相合成制备而得，肽组分由C-端至N-端产生。疏水组分与N-端的连接，提供了在所得到的胶束纳米纤维组装物(micellarnanofiber assembly)的外围具有自由酸或酰胺基团的PA化合物，由于各种表位或肽序列常常需要自由的N-端以实现生物活性，这样的PA化合物对于生长因子相互作用将是无效的。发明概述
根据前面的描述，本发明的目标是提供两亲性肽化合物、其组装的组合物和/或其用于影响各种生长因子的生物利用度的相关方法，从而克服了现有技术的各种不足和缺点，包括前面提到的那些不足和缺点。本领域技术人员理解的是，本发明的一个或多个方面可以满足某些目标，而一个或多个其他方面可以满足其他的目标。从全面考虑的话，不必每一个目标都等同地适用于本发明的每一个方面。因此，对于本发明的任一方面，下面的目标可以看作选择。
本发明的一个目标是提供两亲肽化合物，该化合物包括在其N-端连接着许多表位序列中的一个或多个表位序列的肽组分，所述表位序列能够与一种或多种生长因子发生非共价相互作用，这样的表位可以包括噬菌体展示方法的识别产物或衍生自噬菌体展示方法的识别产物。
本发明的另一个目标是提供包括由一个或多个前述两亲肽化合物形成的组装物 (assembly)的组合物，用于呈递连接到其上的表位结合序列，这样的组合物可以包括缺少此类表位序列的其他两亲肽化合物。
本发明的目标也可以是提供进一步包括对应于被连接的表位序列的一个或多个生长因子的一种或多种前述组合物，此类组合物能够进行自组装，用于生长因子传递和释放。
本发明的目标也可以是提供前述两亲肽化合物的一种或多种组合组装物 (compositional assemblies)，以及其用于影响生长因子生物利用度和/或干细胞分化的用途。
通过本概述和下面某些实施方案的描述，本发明的其他目标、特征、益处和优点将变得明显，并且对于具有用于生长因子传递的肽组合物和支架或结构的知识的本领域技术人员来说将是非常明显。从上面的描述以及随附的实施例、数据、附图和所有可从中获得的合理推论——单独考虑或者与并入本文的参考文献一起考虑，这些目标、特征、益处和优点将变得明显。
部分地，本发明可以涉及包括肽组分和疏水组分的两亲肽化合物，肽组分包括噬菌体展示方法中的生长因子识别产物。一种或多种此类识别产物在肽组分的N-端附近或接近N-端处直接与肽组分偶联或键合，疏水组分在肽组分的C-端附近或接近C-端处直接与肽组分偶联或键合。此识别产物可以选自提供与生长因子的一种或多种结合相互作用的表位序列，这样的产物/序列和相应的生长因子包括但不限于在下面更充分描述的那些。本发明的化合物和/或其肽组分可以基本上是线性或分支的，此类分支构型和其制备
4如在共同在审的申请“Branched PeptideAmphiphiles, Related Epitope Compounds and Self-Assembled Structures Thereof”中公开的，其在2004年12月6日与本申请一起提交，该专利通过参考整体并入本文。
部分地，本发明也可以涉及包括许多此类两亲肽化合物的组合物，每一种化合物的肽组分在生理PH时具有净电荷。此类组合物还可以包括许多在生理pH时具有互补的净电荷的两亲肽化合物，此种化合物缺少生长因子识别产物，这样，此种化合物的氨基酸序列相比包括识别产物的化合物的相应氨基酸序列，具有更短的长度或更少的数量。结果，此类化合物的胶束组装物，在合适的介质中，提供了一种或多种识别产物的增强的提呈，所述识别产物从胶束组装物的大概外围延展开来。此种被增强的提呈可以用于影响和/或控制一种或多种生长因子的生物利用度。因此，本发明的各种组合物和其相关的方法可以被用于干细胞环境，以便与一种或多种生长因子非共价相互作用或结合，无论该生长因子是由干细胞产生的，还是与一种或多种前述组合物一同被传递到细胞环境中的。
不论任何组成用途或应用，取决于期望的柔性、电荷和/或分子间相互作用的或结合的能力，本发明的肽两亲物可以包括具有各种不同长度或序列的肽组分。此种化合物的疏水组分也可以变化(例如约C6至大于约C22的烷基或取代的烷基，饱和的或不饱和的， 等等)，此组分仅仅受所得的两亲性特征和对此类化合物的组合物或组装物的影响限制。
本发明的一个实施方案是组合物，其包括每一个都具有结合表位 (bindingepitope)的肽两亲物和没有结合表位的填充肽两亲物的混合物。该混合物能够形成自组装的纳米纤维或其他胶束，其由填充肽两亲物和具有结合表位的自组装的肽两亲物组成。组合物中的肽两亲物具有烷基尾部分、β片部分和带电荷的部分。优选地，具有结合表位的肽两亲物上的表位具有来源于噬菌体展示方法的序列，并且比填充肽两亲物长。
本发明的另一实施方案是自组装纳米纤维或其他自组装胶束的组合物或系统，其包括具有结合表位的肽两亲物和填充肽两亲物。带有结合表位的肽两亲物优选比填充肽两亲物长。在自组装结构中，具有结合表位的肽两亲物优选从自组装纳米纤维或胶束的表面突出来。优选地，具有结合表位的肽两亲物能够与生长因子或其他肽、氨基酸或核酸通过非共价键发生相互作用，更优选地，生长因子和表位之间的非共价键相互作用不会与生长因子与胞外受体的结合竞争。
自组装的纳米纤维或胶束的组合物可以构成水凝胶，其可以进一步包括非共价结合到具有结合表位的纳米纤维肽两亲物上的生长因子。这样的生长因子可以在体外加入， 或可以是体内患者损伤位置的那些生长因子。与自组装的肽两亲物相互作用的生长因子可以包括但不限于骨形态发生蛋白、转化生长因子、血管内皮生长因子、神经营养蛋白和促有丝分裂因子如FGF-2、shh(Sonic hedgehog)蛋白和Wnt蛋白。在纳米纤维水凝胶中，组合物可以包括细胞诸如但不限于干细胞。优选地，通过与胞外受体的相互作用或通过纳米纤维基质的降解，与自组装的肽两亲物发生非共价相互作用的生长因子被释放到周围组织或细胞。除了细胞，其他治疗用化合物也可以被封装在水凝胶中或结合到水凝胶上。在纳米纤维水凝胶内，这些化合物可以包括但不限于消炎剂、化学治疗剂或它们的组合。优选地， 通过与胞外受体的相互作用或通过纳米纤维基质的降解，与自组装的肽两亲物非共价相互作用的生长因子被释放到周围组织或细胞。
本发明的另一实施方案是制备自组装的肽两亲物纳米纤维或胶束的方法，包括通过混合或合并具有结合表位的肽两亲物和填充肽两亲物进行自组装，其中所述具有结合表位的肽两亲物长度上比所述填充肽两亲物长。通过加入多价离子，加入带互补电荷的肽两亲物，或通过脱水，或加入酸或碱到肽两亲物中，可以形成纳米纤维或胶束。在形成水凝胶的情形中，优选通过加入多价离子或在细胞介质或体液中已经存在的离子，形成胶束或纳米纤维。优选地，具有结合表位的肽两亲物具有通过噬菌体展示方法获得的序列。
本发明的另一实施方案是治疗组织的方法，包括给予需要使组织再生的患者的某一位置以纳米纤维或其他自组装胶束，所述纳米纤维或其他自组装胶束包括携带用于非共价结合到生长因子的表位的肽两亲物。纳米纤维和它们的水凝胶可以包括细胞诸如但不限于干细胞。除了细胞，其他治疗化合物也可以封装在水凝胶或结合到水凝胶。这些化合物可以包括但不限于消炎剂、化学治疗剂或这些的组合。优选地，通过与胞外受体的相互作用或通过基质的降解，与自组装结构非共价结合的生长因子被释放到所述位置。优选地，含有生长因子和/或干细胞的自组装胶束或纳米纤维被施用到带有损伤的患者的某一位置，诸如但不限于损伤的骨、软骨、脊髓、脑组织、神经或这些的组合。
本发明的另一实施方案是包括烷基尾部分的肽两亲物，所述烷基尾部分连接到形成β片的肽部分的第一端，所述形成β片的肽部分也具有第二端。肽两亲物的表位肽部分被连接到形成β片的肽部分的第二端，这样，表位可用于与其他分子或蛋白质发生非共价相互作用。优选地，表位具有获自噬菌体展示过程的序列。肽两亲物可以选择性地包括带电荷的部分，其具有两端，在形成β片的部分的第二端和表位肽部分之间形成连接。
本发明的另一实施方案包括用于将生长因子释放到细胞的组装物或系统，其包括由自组装的肽两亲物制备的支架，至少一部分的肽两亲物包括用于与生长因子非共价结合的肽表位，其中生长因子结合表位从纳米纤维表面伸出。表位的氨基酸序列衍生自噬菌体展示过程。此支架也可以包括干细胞，可以用于使组织生长、使组织再生、或支持在患者中的组织移植的方法中。除了细胞，其他治疗用化合物也可以封装在支架的水凝胶中或结合到支架的水凝胶。这些化合物可以包括但不限于消炎剂、化学治疗剂或它们的组合。该方法包括将支架插入患者的某一位置，或体内形成支架。支架包括具有用于与生长因子非共价结合的肽表位的自组装肽两亲物，其中所述表位从支架的纳米纤维表面突出，或通过噬菌体展示方法制备，并从支架将生长因子释放到所述支架的周围细胞。
被描述的结合生长因子的水凝胶在再生和移植医学领域具有若干应用。所述组合物、制备方法和使用它们的方法，可以容易地扩展到肽两亲物上的针对其他生长因子的其他表位，因此可使广泛种类的组织再生或支持患者中移植的组织。例如，因为ΒΜΡ-2和 TGF-β 1分别在充质干细胞的造骨细胞和软骨形成分化中发挥重要作用，本发明的自组装的胶束可以被用于骨和软骨的再生。第二，ΒΜΡ-2也在脑和背脊髓的形成中发挥重要的作用。因此，所述凝胶也可以与神经干细胞联合使用，用于损伤的脊髓的再生和/或在中风的情形中用于修复损伤的脑区域。
如上讨论，在某些实施方案中，本发明利用混合的纤维的延伸途径来掺入能够通过选择性非共价相互作用结合生长因子的ΡΑ。这样，生长因子的生物利用度可以通过调整结合强度和结合位点的数量来进行调节。取决于结合的局部化效果(localizing effect of binding)或者导致生长因子失活的结合效果是否更占主导优势，生长因子的起始浓度将或者被提高或者被降低。在任一情况下，生长因子的释放都可以被维持较长的时期。为了促进结合表位被生长因子识别，可以制备表位从纤维表面延伸出来的PA。利用噬菌体展示，可以确定结合表位的必需氨基酸序列。为了示范性阐释的目的，选择的生长因子包括骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和转化生长因子i31(TGF-i31)。BMP-2等参与骨的形成以及脑和背脊髓的发育，而TGF-β 1参与软骨形成和平滑肌细胞的分化。相应的胶将被用于控制充质干细胞的分化。已经表明充质干细胞在体外和体内分化为各种谱系(lineages)比如骨、 软骨、脂肪、肌肉细胞和心肌。下面说明了在BMP-2的影响下，分化为骨谱系。
在控制充质干细胞分化为期望的成骨细胞系时，相对于将生长因子加入到介质中，凝胶是较优的。此外，结合凝胶(binding gels)最初抑制向所有其他谱系的分化。该行为被认为由降低的生长因子生物利用度导致，或者由细胞更具渐进性暴露于结合凝胶中的这些生长因子导致。最后，也在结合凝胶中发现了一些α-平滑肌表达。这表明，延长暴露于ΒΜΡ-2或缺少推动分化完成的因子可能对该群体的同质性(homogeneity)具有负面影响。最终，当存在结合序列以调节其生物利用度时，内源性产生的BMP-2水平似乎是足够的。
生长因子结合PAs与常规的填充PAs之间成功的共组装使得能够产生能够结合生长因子，将它们保持在凝胶中并调节它们的生物利用度的水凝胶。相比那些在缺少结合 PA时被分化的充质干细胞，当充质干细胞在携有结合PAs的胶中被分化时，最初获得了更加同质的特化细胞群。取决于它的应用，其他填充PA对于改变凝胶的物理特性可能是期望的，并且其他结合序列对于优化结合强度可能是需要的。此外，本发明示范的方法允许通过简单地将多种结合PAs与填充物混合，掺入多种信号。更可能地，需要多种生长因子以进一步优化干细胞的分化。暴露于多种生长因子的充质干细胞的分化目前正在被研究。很可能地，通过选择对生长因子具有不同的结合常数的结合物，可以实现多生长因子系统中的暂时释放。此外，对描述的系统进行了体内研究。最后，在此提供的方法可以容易地延伸到与细胞募集、特化或维持有关的任何生长因子或蛋白，从而使它成为再生医学中极有前景的方法。


图1说明了包括表位序列的代表性的PA，以及用于与其组装的互补PA。某些实施方案的详细描述
本发明描述了基于自组装的肽两亲物(PAs)的系统，该系统能够通过特异性非共价相互作用来结合生长因子。生长因子在细胞信号传导中发挥着重要作用，并因此在体内作为非常有用的因子可以用于控制干细胞分化、支持移植组织的整合，和/或特定的分子或生理过程，或重新激活休眠的生物过程，这些可以导致无功能组织的再生。在体内生长因子快速降解并从损伤位置迅速扩散掉。因此，需要这样的一种支架，其将生长因子保留在损伤位置，以可控的方式将生长因子释放到周围的细胞。基于自组装的肽两亲物的水凝胶已显示出能够实现胞外基质(ECM)的若干功能，即，促进细胞粘附和控制分化。本发明涉及用能够以特异性的方式结合生长因子的肽序列修饰这些EMC替代物，所述生长因子包括但不限于骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、转化生长因子β l(TGF-i3 1)、VEGF和IL-6。这些生长因子肽序列可以通过噬菌体展示技术获得，偶联到肽两亲物以形成结合肽两亲物(binding peptide amphiphiles)。结合肽两亲物和填充肽两亲物(filler peptideamphiphiles)可以自组装形成水凝胶，其可以被塑造成一定的形状，并用作组织修复的支架。可选择地，结合肽两亲物和填充肽两亲物可以在体内或体外被引入细胞或组织样品中，并在该样品中自组装成水凝胶。
如上讨论，本发明的肽两亲物可以包括烷基尾、形成β -片的肽序列和生物活性肽序列。前两个部分(blocks)形成胶束纤维，诸如但不限于纳米纤维，其在合适的条件下 (加入多价离子进行中和)，形成水凝胶或其它溶剂填充的湿凝胶。优选地，生物活性表位是部分带电荷的，以获得溶解性，但是该电荷可以随宽范围的序列如整联蛋白结合序列、神经活性序列等而变化。而且，具有互补电荷的肽两亲物共同自组装形成混合的纤维。该原理可以被用来制备由常规PAs和较长的携带生长因子结合表位序列的PAs组成的纳米纤维， 其中结合序列从纤维表面延伸出来。通过利用随机化肽文库的噬菌体展示——其使用组合选择过程获得强结合序列，获得期望的生长因子结合序列。通过基质的降解、结合到胞外受体或它们的组合，生长因子的释放将被诱发。
现有的技术是将生长因子捕获在水凝胶中，将它们共价连接到聚合系链 (polymeric tethers)内(W0 03/040336和美国专利公开号0020007217)，或通过静电将它们连接到阴离子聚合物(W0 0/13710)或肝素(W0 00/64481)。该系留系统(tethered system)的缺点是制备复杂，并且可能发生生长因子不能接触到胞外受体的情况。捕获的生长因子和与阴离子聚合物复合的生长因子被相对快速地释放，很难对持续释放进行控制。 例如，结合到阴离子聚合物的生长因子在8小时内被释放。肝素结合系统是非特异性的(例如，有可能与血清中存在的因子发生不期望的结合)，并且局限于一部分(subset)的生长因子。有利地，本发明被设计成仅仅与期望的生长因子以一定的结合强度形成复合体，该结合强度足够高以将生长因子保留在结合状态，但是又足够弱，弱到它不会竞争与胞外受体的结合。
本文描述的发明的一个方面是，它可以被用于利用噬菌体展示技术获得结合生长因子的肽序列，以及随后制备携带这些结合序列的肽两亲物。通过噬菌体技术制备的生长因子可以包括骨形态发生蛋白、转化生长因子β 1、神经营养蛋白和促有丝分裂因子 FGF-2, shh(Sonic hedgehog)蛋白和Wnt-3a。这些生长因子蛋白被偶联到更短的肽两亲物，以形成携带生长因子表位的较长的肽两亲物。这些携带生长因子表位的PAs，或结合肽两亲物，与较短的填充或互补填充PAs共组装，产生结合表位从表面延伸出来的纳米纤维， 其随后在加入多价离子或PH变化时可以形成水凝胶。然后，或者与封装在水凝胶中的细胞诸如但不限于干细胞一起，或者单独地，产生的水凝胶可以用作传递载体，用于体内组织再生。除了细胞，其他治疗用化合物也可以封装在水凝胶或键合到水凝胶。这些化合物包括但不限于消炎剂、化学治疗剂或它们的组合。
噬菌体展示可以被用于产生针对特定目标的分子探针，并用于分析和操作蛋白-配体相互作用。噬菌体展示被用于测定将结合到目标分子诸如但不限于氨基酸、肽、生长因子、酶和各种核酸的氨基酸序列、肽或蛋白质。使用商业文库，噬菌体展示可以在物理吸附到微量滴定孔板的目标分子如生长因子上实施。优选地，该文库由噬菌体组成，其中， G3衣壳蛋白的N末端延伸有1至约13或更多个随机的氨基酸，在该方式中每一种可能的氨基酸组合都存在。该文库被暴露于目标分子诸如生长因子，然后非特异性结合的噬菌体用洗涤剂溶液洗脱。回收结合的噬菌体后，将该群体在例如大肠杆菌(E.Coli)中扩增，再重
8复该过程两次，其中使用严紧性不断增加的洗脱条件。结合噬菌体的最终群体得以很好的富集，可以对若干克隆的DNA测序，从而鉴定出展示在这些噬菌体上的氨基酸序列。随后， 可以进行ELISA分析，以评估分离出的克隆的相对结合强度。固态合成被用于制备肽，用于使用鉴定出的氨基酸序列制备结合肽两亲物。
在本发明的填充PAs和结合表位肽两亲物中的肽组分可以包括天然存在的氨基酸和人工的氨基酸。也考虑整合入人造氨基酸诸如β或Y氨基酸和那些含有非天然侧链的氨基酸，和/或其他类似的单体诸如羟基酸，其效果是在这个方面中相应的组分是肽样的，并且自组装形成胶束诸如纳米纤维。
本发明的各种肽两亲物可以用本领域技术人员熟知的制备技术合成，包括公开在前述的整入本文的出版物WO 03/054146中的那些技术，和对那些最初由Hartgerink等 (参见例如 J. D. Hartgerink, E. Beniash 和 S. I. Stupp, Science 294，1683-1688，2001)描述的方法的修改，该文献也通过参考整体并入本文。也在本发明实践中被考虑的是分支肽两亲物，对于它们，本发明的合成方法和表位可以被使用。分支肽两亲物可以使用前述的共同在审申请中公开的方法和组合物制备，该在审申请于2004年12月6日与本申请同时提交，其内容通过参考整体并入本文。具有结合表位的此类分支肽两亲物可以自组装成纳米纤维。分支肽两亲物将具有连接到形成β片的肽部分的第一末端的烷基尾部分，在第二末端连接到包括一个或多个肽分支的表位肽部分。该肽包括分支氨基酸和带电荷的肽部分。 分支的表位肽部分可以被连接到该肽两亲物的形成β片的肽部分的第二末端。分支肽的结合表位序列可以源自噬菌体展示过程。在这些参考文献中阐述的合成方案可以用于本发明。肽两亲物可以是它们的充分质子化的形式、部分质子化的形式或作为酸或碱加成盐。一般而言，此类肽两亲物可以通过标准的固相肽化学制备，如在前述的整合入本文的参考文献中描述的或在本文中描述的。取决于期望的两亲物组成或肽序列，可以使用已知的程序和合成技术或其直截的修饰，对这些合成的方法进行修饰，如本领域技术人员知道的和意识到的。
填充肽(filler peptides)，图1中显示的类型的填充肽，优选在长度上比携带结合表位的肽两亲物短，以便由这些肽两亲物的组合自组装的纳米纤维中的生长因子结合表位从纳米纤维的表面伸出。互补的填充肽两亲物具有来自氨基酸的侧链基团，其通过酸碱或其他类型的键合与填充肽的那些侧链基团发生相互作用。
来自噬菌体展示过程的肽序列可以被用作肽两亲物上的结合位置或表位，用于与肽和分子非共价结合，所述肽和分子包括但不限于生长因子、酶、核酸(RNA、DNA)和氨基酸。尽管噬菌体展示优选用于获得表位序列，但也可以使用用于鉴定或测定结合表位的序列的其它互补方法，诸如但不限于酵母杂交系统。这些结合肽或表位可以被连接到形成β 片的肽的自由端、带电荷肽的自由端或间隔肽(spacerp印tide)的自由端。
肽两亲物设计可以包括简单的疏水尾，其用于产生该分子的圆锥形状的细长部分，以便该肽两亲物的自组装。优选地，疏水尾是烷基链，其可以是各种尺寸的，但优选长度大于6个碳原子。烷基尾被共价结合到肽两亲物的形成β片的结构片段上。
β片肽结构片段可以被用于将所述尾基团共价偶联到噬菌体肽；或带电荷的肽、 间隔肽和噬菌体肽；或带电荷的肽和噬菌体肽。β片肽结构片段的一端与所述尾共价结合，它的另一端与各种肽的氨基酸序列结合。如果期望进行交联，半胱氨酸氨基酸可以被用于任何片段中，但是优选用于结构性β片片段中。如果交联是不期望的，其它疏水氨基酸诸如但不限于丙氨酸、丝氨酸或亮氨酸可以被用于该区域(例如SLSL或ΑΑΑΑ，如本文中更详细描述的)。该无半胱氨酸的系统可能更适合于体内生物学应用，以控制纳米纤维基质的降解速率。对该系统的SLSL修饰可被期望导致更缓慢的纳米纤维自组装，这可以被用来控制支架的体内组装。不希望受到理论的限制，认为体积大的亮氨酸侧链可能需要更多的时间来组装成纤维。减缓的自组装也可能在功能性的原位环境诸如手术室中具有更大的应用，在这种情况下纳米纤维的延迟形成可能是有利的。形成β片结构的片段也可以包括由甘氨酸或其他氨基酸组成的柔性连接物。当该结构性片段包括疏水氨基酸时，它和烷基尾可以被看作疏水片段。当该结构性片段包括亲水氨基酸时，它和亲水头基团可以被看作亲水片段。
形成β片的单元优选包括那些可以相互作用以形成β片的疏水氨基酸和有助于构成基本上圆锥形状的肽两亲物的疏水性氨基酸。对于伸出的肽两亲物，该单元中的氨基酸的数量可以被选择，以提供比用于形成纳米纤维的填充肽两亲物长的肽两亲物，以及为键合肽两亲物上的肽提供可及性(accessibility)。在该片段中可以有约4至约10个氨基酸，最优选约6个氨基酸。对于形成β片的片段，合适的氨基酸可以包括但不限于甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸和其它可以以类似的化学和结构方式用于肽两亲物中的非天然存在的氨基酸。带电荷的片段存在于结合肽两亲物中，其赋予了该肽两亲物在含水环境中的溶解性，含水环境优选在患者的某一位点。带电荷的肽片段可以包括提供这种溶解性和允许进行自组装的那些氨基酸和它们的组合，并且为了改变肽两亲物的溶解性，不限于极性氨基酸诸如E或K和这些的组合。该片段中可以有约2至约7个氨基酸，优选有约3或4个氨基酸。该片段的第一端连接到结构肽，它的第二端被用于与来源于噬菌体展示方法的肽键合。间隔基团肽也可以被包含到肽两亲物中。该间隔可以包括氨基酸诸如但不限于S和G，该间隔可以包括1至约6个氨基酸。当在噬菌体上展示的肽具有自由的 N-端时，用于肽两亲物的典型合成方案可以被修改以提供自由的N-端。这可以通过合成天冬氨酸衍生物来实现，天冬氨酸衍生物的侧链可以用十二烷胺官能化。将该氨基酸偶联到 Wang-resin,这使得能够通过经典的固态Fmoc-化学完成PA合成，而无需进一步将N-端官能化。自由的PA可以通过用95% TFA/2. 5%水H. 5%三异丙基硅烷处理获得。通过下述步骤可以除去残留的TFA 将PA溶解在3mM HC1，在室温中平衡1小时，然后冻干。使用电喷雾质谱术可以确认是否成功地合成了这些分子。
利用体液中存在的离子和/或加入的离子/试剂来促进自组装，携带有生长因子表位的肽两亲物可以在患者某位点处进行体内自组装。可选择地，携带生长因子结合表位的合适的肽两亲物的组合物被倒入模子(mold)中并自组装，用来形成待被替代或再生的组织或骨的形状的支架。模制的支架可以被插入需要修复或再生治疗的患者中的某一位置处。在组织移植的情况下，携带生长因子结合表位的肽两亲物可以在模子中形成支持结构或基质，并在患者中用作移植的组织的支持物。肽两亲物纳米纤维或其支架可以包括细胞诸如但不限于干细胞。其他治疗用化合物可以封装入水凝胶或与水凝胶键合。这些化合物可以包括但不限于消炎剂、化学治疗剂或这些的组合。
携带有生长因子结合表位的肽两亲物与更短的β片结构肽-带电荷的肽酸-作末端的填充肽两亲物的共组装物可以被用来制备本发明的纳米纤维和支架。不受限制地，携带有不同的生长因子结合表位的一种或多种肽两亲物可以被使用，并且多种填充肽两亲物可以被用于制备本发明的支架和纳米纤维。相对于填充肽两亲物，在本发明的支架和纳米纤维的制备中，携带有生长因子结合表位的肽两亲物的数量可以不受限制的变化。自组装的胶束和纳米纤维可以用NOE和FT4R光谱、圆二色谱表征；纳米纤维纤维网络可以使用透射电子显微镜来可视化。
通过选择表位的肽序列可以制备具有结合表位的肽两亲物，所述表位能够通过非共价相互作用与生长因子或其他肽诸如但不限于氨基酸或核酸相互作用。生长因子或其他肽与携带结合表位的肽两亲物之间的非共价相互作用的程度被选择，这样，该表位不与胞外受体竞争生长因子或其他肽，或相比胞外受体该表位与生长因子或其他肽具有较小的结合亲和力。被动释放(passive release)实验可以被用于表征以及随后改变各种具有生长因子结合表位的纳米纤维的亲和力。该表征可以在预封闭的微量滴定板中，在含有生长因子的自组装纳米纤维凝胶上进行。这些凝胶可以通过下述步骤制备首先以合适的比例混合2%的PAs溶液，随后用TBSWl1稀释。然后可以加入生长因子，接着加入2当量的多价离子以诱发凝胶化和自组装。可以分析上清液的生长因子含量，以评价此类凝胶的生长因子结合能力。
尽管对于组织生长和其他治疗来说，结合表位对各种肽具有比附近细胞或组织的胞外受体小的亲和力是优选的，但也考虑到，可能期望肽两亲物的结合表位强有力地化学结合于流体或细胞样品中的肽、生长因子、酶或核酸或其他分子。在这种情况下，携带有合适的表位的结合肽两亲物可以自组装并固定在表面上，以形成传感器涂层或移除介质 (removal media)。由这些强结合肽两亲物自组装形成的水凝胶可以被模制，以便插入患者的某一位置处或用于过滤系统。水凝胶可以被用于除去某一位置诸如患者关节或肿瘤或患者体液中的目标肽，比如HGF或VEGF。本发明实施例
下面的非限制性实施例和数据阐述了关于本发明的化合物、组合物和/或方法的各方面和特征，包括各种两亲肽化合物——有或无能够与生长因子非共价相互作用的表位序列——的合成，此类化合物或组合物的自组装，以及其影响生长因子生物利用度和干细胞分化的用途。与现有技术相比，本发明的化合物、组合物和/或方法是令人吃惊的、意想不到的和出乎意料的。尽管本发明的效用通过若干化合物/组合物和组装物的应用来举例说明，本领域技术人员理解的是，用其他化合物、组合物和/或组装物也能获得可媲美的结果，这是与本发明的范围相称的。
所有的树脂和Fmoc-I-氨基酸获自Novabiochem(San Diego, CA)所有用于固相合成的试剂是合成级的，获自Applied Biosystems (Foster City，CA)。所有其他试剂获自 Aldrich Chemical Co. (Milwaukee，WI)，并且收到后便使用。用于固相肽合成的溶剂获自 Applied Biosystems,并且是肽合成级的。其他溶剂获自FisherScientif ic，并且收到后便使用，除非另外指明。
使用Applied Biosystems 433A自动肽合成仪合成PA。在室温中，在VariarHnova 500MHz 分光计上获得NMR谱。在Micromass Quattro II Triple QuadrupoleHPLC/MS/MS质谱仪上采集电喷雾质谱。在带有Jasco PTC-348WI帕尔帖效应温度控制器的Jasco J-715 分光偏振计上记录CD谱。FTHR谱在BioRad FTS-40FT-IR机器上操作，400_4000nm，分辨率为2CHT1。成KBR小球。
圆二色谱光谱术。径长0. Icm的石英池被用于所有实验。记录300至190nm的每一光谱，扫描速度lOOnm/min，响应时间2秒钟，带宽lnm，平均超过5次扫描。除非另外指明，样品在水中被制备0. lmg/mL的浓度。
酸-碱滴定。用Fisher Accumet pH 计，在 pH 2-10 范围内，对 PAs 1-4 进行 pKa 滴定，浓度为3. 5mg/mL,在IOOmM KCl中。对于酸性PAs 2和4，以1_5 μ L的增量，加入0. IN Κ0Η，以低pH开始；而对于碱性PAs 1和3，以1-5 μ L的增量，加入0. IN HC1，以高pH开始。
NMR NOE光谱术。以5mg/mL的浓度，将PAs 1-6溶解在d6_DMS0中。在 D20中，以0.1s的混合时间和1 次扫描测量NOESY光谱，每种PA的浓度为10或 15mg/mL, 11的摩尔比。对于FT-IR研究，冻干水中重量比为2 %的样品，然后压
权利要求
1.一种分离的肽，其具有式YPVHPST。
2.一种分离的肽，其具有式LPLGNSH。
3.一种化合物，其具有式 C15H31CO-VVVAAAKKK(SEQ ID NO 3) ο
4.一种化合物，其选自 V3A3K3S(i3LPLGNSH(SEQ ID NO :27)和 V6K3SG3YPVHPST(SEQ ID NO 26)。
5.一种化合物，其选自 C15H31C(0)-Val-Val-Val-Ala-Ala-Ala-Lys-Lys-Lys-0H、C15 H31C (0) -Val-Val-Val-Ala-Ala-Ala-Glu-Glu-Glu-OH、NH2-Lys-Lys-Lys-Val-Val-Val-Va I-Val-Val-Asp (NHC12H25) -NH2、NH2-Glu-Glu-Gly-Ala-Ala-Ala-Val-Val-Val-Asp (NHC12 H25)-NH2、NH2-Thr-Ser-Pro-His-Val-Pro-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Lys-Lys-Lys-Val-Val-Val-Val-Val-Val-Asp(NHC12H25)-NH2 禾口NH2-His-Ser-Gly-Gly-Leu-Pro-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Lys-Lys-Lys-Ala-Ala-Ala-V al-Val-Val-Asp(NHC12H25)-NH2。
6.一种控制干细胞分化成软骨细胞的方法，该方法包括将所述干细胞与包含胶束组装物的组合物接触，所述胶束组装物包含肽两亲物，所述肽两亲物具有长度为6至22个碳原子的烷基链的疏水组分、选自YPVHPST (SEQ ID NO 7)和LPLGNSH (SEQ ID NO 8)的肽组分以及在其之间选自V3A3K3 (SEQ ID NO 3)、V3A3E3 (SEQ ID NO 4)和V6K3的β _片形成单元
7.权利要求
6的方法，其中所述肽组分是YPVHPST(SEQ ID NO :7)。
8.权利要求
6的方法，其中所述肽组分是LPLGNSH(SEQ ID NO :8)。
9.权利要求
6的方法，其中所述β-片形成单元是V3A3K3(SEQ ID NO3)或V6K3。
10.权利要求
6的方法，其中所述肽两亲物具有式V3A3K3SG3LPLGNSH(SEQIDNO 27)或 V6K3SG3YPVHPST (SEQ ID NO :28)。
11.权利要求
6的方法，其中所述组合物还包括生长因子TGF-β1。
12.权利要求
6的方法，其中所述组合物还包括生长因子ΒΜΡ-2。
专利摘要
本发明提供了两亲肽化合物、此类化合物的胶束组装物和相关的应用方法，所述两亲肽化合物包括一个或多个用于与一种或多种相应的生长因子发生结合相互作用的表位序列。
文档编号C12N5/077GKCN102225964SQ201110097467
公开日2011年10月26日 申请日期2004年12月6日
发明者G·A·席尔瓦, H·A·贝安娜, J·J·J·M·唐纳斯, S·G·安东尼, S·I·斯图普 申请人:西北大学