专利名称:一种广谱抑制癌细胞生长的蚯蚓蛋白及其编码序列的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域，特别是涉及蚯蚓中一种可广谱抑制癌细胞生长的蛋白质的多核苷酸序列，以及由此多核苷酸编码的蛋白质序列，此外，还涉及所述蛋白质的制备方法及其抑癌活性等。
背景技术：
蚯蚓俗称地龙，具有解热、镇惊、降压、抑菌及活血化瘀等功效，已广泛应用于中医中药中治疗多种疾病。到了上世纪80年代，又陆续报道蚯蚓抽提物对多种癌细胞具有抑制作用，并在初步临床应用中取得了一定的抑癌效果(第四军医大学学报，1986，7(2)85；中国肿瘤临床，1991，18(2)131；山西医学院学报，1995，26(2)81；生物化学与生物物理学报，2002，34(5)576)。
但是，对蚯蚓中抑制癌细胞生长的有效成份及其作用机理却至今未见报道。鉴于蚯蚓中抑癌成分的潜在应用前景，迫切需要对其进行基础及开发应用研究。
发明内容本发明的第一个目的是提供蚯蚓中一种可广谱抑制癌细胞生长的蛋白质。
本发明的第二个目的是提供编码所述蛋白质的多核苷酸序列。
本发明的第三个目的是提供制备所述蛋白质的方法。
本发明的第四个目的是提供所述蛋白质的抑癌用途及其它用途。
在本发明的第一方面，提供一种分离的蚯蚓EFE6多肽，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；或(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个(较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑癌功能的由(a)衍生的多肽。
在本发明的一个优选例中，该多肽是具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽。
本发明的第二方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码所述多肽的多核苷酸；或(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
在本发明的一个优选例中，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
在另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO1所示的序列。
在另一优选例中，所述的多核苷酸可以是对编码所述多肽的基因进行人工定点突变后所获得的基因突变体的DNA核苷酸序列。
本发明的第三方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。
本发明的第四方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体。
本发明的第五方面，提供一种多肽的制备方法，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；或(b)从培养物中分离出蚯蚓EFE6多肽。
本发明的第六方面，提供一种能与所述的蚯蚓EFE6多肽特异性结合的抗体。
本发明的第七方面，提供一种药物组合物，它含有安全有效量的所述的多肽以及药学上可接受的载体。
本发明的第八方面，提供了本发明所述的蚯蚓EFE6多肽的用途，它被用于(a)制备治疗癌症的药物；(b)制备具有酯酶活性的药物；或(c)制备具有纤维蛋白溶解活性的药物。
本发明的其它方面由于本文技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案。
图1显示了从蚯蚓中分离的广谱抑癌蛋白质的SDS-PAGE图谱，其中泳道1为抑癌蛋白质，泳道2为标准分子量蛋白质。
图2显示了蚯蚓抑癌蛋白质在HPLC中的层析图谱。
图3显示了蚯蚓抑癌蛋白质的PCR扩增条带，泳道1为DNA标准，泳道2为PCR扩增产物。
图4显示了蚯蚓抑癌蛋白质的基因序列及其编码的蛋白质序列。
图5显示了蚯蚓抑癌蛋白质在原核表达载体(PGEX4T-1)中的构建过程。
图6显示了蚯蚓抑癌蛋白质表达产物的SDS-PAGE图谱(图6A)和Western图谱(图6B)。
图7显示了蚯蚓抑癌蛋白质对几种癌细胞生长的抑制作用。
具体实施方式本发明人经过广泛而深入的研究，首先从蚯蚓中分离得到一种广谱抑制癌细胞生长的蛋白质，基于此完成了本发明。
更具体的，本发明人首先从威廉腔环蚓(Metaphire guillelmi)抽提物中分离到一种分子量24744.67道尔顿的广谱抑制癌细胞生长的蛋白质，测定了此蛋白质N端的一段氨基酸序列为NH2-I-L-G-G-Q-D-A-S-P-G-(SEQ ID NO3)，并以此为依据合成了相应的引物，然后从蚯蚓中分离有关的mRNA为模板，经反转录获得cDNA，用PCR法扩增和克隆了蚯蚓抑癌蛋白质的基因，测定了此基因的全序列，然后将蚯蚓抑癌蛋白质的编码序列插入合适载体并转入合适的宿主细胞中，表达及分离重组的蚯蚓抑癌蛋白质，并通过Westren印迹分析加以鉴定。本发明人将此蛋白命名为“EFE6蛋白”。
本发明人除了从威廉腔环蚓中分离纯化得到了所述抑癌蛋白质外，还从其它的蚯蚓品种中分离得到了所述抑癌蛋白质，例如，赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)等。
在本发明中，术语“EFE6蛋白”、“EFE6多肽”或“蚯蚓抑癌蛋白EFE6”可互换使用，都指具有蚯蚓抑癌蛋白质EFE6氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的蚯蚓抑癌蛋白质EFE6。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的EFE6蛋白或多肽”是指EFE6多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白质、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化EFE6蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。EFE6多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括EFE6蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然EFE6蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白质原序列，或与抗体IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“EFE6多肽”指具有EFE6蛋白活性的SEQ ID NO2序列的多肽。该术语还包括具有与EFE6蛋白相同功能的、SEQ ID NO2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括了EFE6蛋白的活性片段和/或活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与EFE6 DNA杂交的DNA所编码的蛋白质、以及利用抗EFE6多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含EFE6多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了EFE6多肽的可溶性片段。通常，该片段具有EFE6多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供EFE6蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然EFE6多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“EFE6蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ IDNO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码EFE6蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的EFE6核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白质(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白质序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki等，Science 1985；2301350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或EFE6蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的EFE6多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码EFE6多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，EFE6多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J BioChem.2633521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含EFE6编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白质。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白质沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的EFE6蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)直接做为药物治疗因类似EFE6蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗EFE6蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组EFE6蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激EFE6蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对EFE6 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于EFE6基因产物或片段。较佳地，指那些能与EFE6基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制EFE6蛋白的分子，也包括那些并不影响EFE6蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的EFE6基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的EFE6基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达EFE6蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature.256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断EFE6蛋白功能的抗体以及不影响EFE6蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用EFE6基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与EFE6基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗EFE6蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的EFE6蛋白。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与EFE6蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断EFE6蛋白的产生或活性。
抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如EFE6蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭EFE6蛋白阳性的细胞。
多克隆抗体的生产可用EFE6蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
利用本发明蛋白质，通过各种常规筛选方法，可筛选出与EFE6蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明蛋白质及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果，尤其是可用于抑制肿瘤或肿瘤细胞(体内或体外)的生长。
肿瘤例子包括但并不限于各种实体肿瘤，如肺癌、小细胞肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、乳房癌、前列腺癌、睾丸癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫颈癌。较佳地，所述的肿瘤选自下组肺癌、肝癌、乳房癌、或前列腺癌。
通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于癌症方面的治疗。在使用本发明EFE6蛋白时，还可同时使用其他治疗剂，如紫杉醇等。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明EFE6多肽以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的EFE6蛋白施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
EFE6蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于EFE6蛋白的无表达或异常/无活性的EFE6蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的EFE6蛋白，以抑制内源性的EFE6蛋白活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将EFE6基因转移至细胞内。构建携带EFE6基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook等，分子克隆实验指南)。另外重组EFE6基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。
抑制EFE6 mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。
能与EFE6蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对EFE6蛋白分子进行标记。
本发明还涉及定量和定位检测EFE6蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的EFE6蛋白水平，可以用作解释EFE6蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断EFE6蛋白起作用的疾病。
一种检测样品中是否存在EFE6蛋白的方法是利用EFE6蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与EFE6蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在EFE6蛋白。
EFE6蛋白的多聚核苷酸可用于EFE6蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，EFE6蛋白的多聚核苷酸可用于检测EFE6蛋白的表达与否或在疾病状态下EFE6蛋白的异常表达。如EFE6 DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断EFE6蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用EFE6蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测EFE6蛋白的转录产物。
检测EFE6基因的突变也可用于诊断EFE6蛋白相关的疾病。EFE6蛋白突变的形式包括与正常野生型EFE6 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白质的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。简而言之，根据本发明EFE6蛋白的cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，MendelianInheritance in Man(可通过与Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。更具体的，本发明人首先从威廉腔环蚓(Metaphire guillelmi)抽提物中分离到一种分子量24744.67道尔顿的广谱抑制癌细胞生长的蛋白质，测定了此蛋白质N端的一段氨基酸序列为NH2-I-L-G-G-Q-D-A-S-P-G-(SEQ ID NO3)，并以此为依据合成了相应的引物，然后从蚯蚓中分离有关的mRNA为模板，经反转录获得cDNA，用PCR法扩增和克隆了蚯蚓抑癌蛋白质的基因，测定了此基因的全序列，然后将蚯蚓抑癌蛋白质的编码序列插入合适载体并转入合适的宿主细胞中，表达及分离重组的蚯蚓抑癌蛋白质，并通过Westren印迹分析加以鉴定。本发明人将此蛋白命名为“EFE6蛋白”。
本发明人除了从威廉腔环蚓中分离纯化得到了所述抑癌蛋白质外，还从其它的蚯蚓品种中分离得到了所述抑癌蛋白质，例如，赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)等。本发明的蛋白质可为治疗癌症相关疾病提供新的治疗途径，因而具有巨大的应用前景。
本发明所述的蚯蚓抑癌蛋白质EFE6的其它生物活性，是指该蛋白质还具有水解BAEE(苯甲酰精氨酸乙酯)的酯酶活性和水解纤维蛋白及纤维蛋白原的纤维蛋白溶解活性。
本发明的主要优点在于从繁杂的蚯蚓抽提物中纯化到单一纯度的抑癌蛋白质，此抑癌蛋白质对培养的正常细胞是无毒或低毒的。本发明同时克隆到蚯蚓抑癌蛋白质的基因，分析测定了基因序列，并成功地进行了表达，这不仅为开发研究蚯蚓抑癌蛋白质的基因工程产品创造了良好的条件，也为开发蚯蚓抑癌蛋白质针剂应用于临床治疗肿瘤疾病提供了必要的化学结构资料，因而具有巨大的应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 从蚯蚓中分离纯化天然的抑癌蛋白质在实验中本发明人主要采用了威廉腔环蚓进行抽提并分离纯化，获得了具有抑癌活性的组份。此外还采用了赤子爱胜蚓，也获得了相同的结果。
以威廉腔胜蚓为例，取鲜活蚯蚓若干，洗净后经机械捣碎，加入冰冷的丙酮或乙醇脱水，所得沉淀晾干，即为粗蚯蚓粉，储藏-20℃冰箱中备用。
取粗蚯蚓粉若干，加两倍体积的水浸泡过夜，次日以5000rmp冷冻离心，收集上清液并装入透析袋对水透析24h，再在5000rmp离心，上清液经冷冻干燥成冻干粉，纯化时取冻干粉少许以缓冲液溶解，然后经离子交换和凝胶过滤层析分离，得到单一的抑癌蛋白质组份，具体地，依据下列两种鉴定方法确定为单一组份。
本发明人对获得的抑癌蛋白质组份进行了HPLC分析，结果为单一峰，见图2。
本发明人对获得的抑癌蛋白质组份进行了SDS-PAGE分析为单一条带，见图1。
实施例2 蚯蚓抑癌蛋白质N-端10个氨基酸序列测定纯化的蚯蚓抑癌蛋白质样品在PE491蛋白质测序仪上经过10个循环，测得的N-端氨基酸序列为ILGGQDASPG。
实施例3 引物的设计和合成根据实施例2测得的蚯蚓抑癌蛋白质的N-端序列，设计上游寡核苷酸兼并引物为5’AT(T/C/A)CT(T/C/A/G)GG(T/C/A/G)GG(T/C/A/G)CA(A/G)GA(T/C)GC3’(SEQ ID NO4)(括号内为兼并核苷酸)，由于缺乏蚯蚓抑癌蛋白质的C-端氨基酸序列信息，下游引物选用OligdT20，引物合成委托上海生工生物工程公司完成。
实施例4 总RNA的提取取蚯蚓体腔内组织100mg，在液氮中研磨成粉，加1ml Trizol试剂继续研磨成匀浆，然后转移至离心管内，4℃，12000g离心10min，上清液吸入新的离心管，25℃水浴5min，加入0.2ml氯仿，充分振荡15s，25℃水浴5min，4℃12000g离心15min，取上层水相加0.5ml异丙醇，25℃水浴10min，4℃12000g离心10min，收集沉淀，用1ml 75％乙醇洗涤，4℃7500g离心5min，敞口于空气中干燥5-10min，使乙醇充分挥发，加入100μl水溶解，58℃水浴10min，-70℃保存。
实施例5 RT-PCR扩增蚯蚓抑癌蛋白质基因以实施例4中制得的蚯蚓总RNA为模板，利用Invitrogen公司的试剂盒(kit)进行反转录，按操作说明书进行。
使用实施例3中的合成引物，从上述所得cDNA为模板，进行PCR扩增，总反应体系25μl，其中模板1μl，上游引物2μl(250pM/μl)，OligdT(10pM/μl)0.5μl，高保真酶0.5μl(5u/μl)，dNTP(2.5mM)2μl，反应条件是先94℃变性3min，然后进入循环，94℃25s，51℃退火45s，72℃延伸1.5min，进行31个循环，最后72℃保温10min，取PCR产物进行1％琼脂糖电泳检查，扩增出一条约1000bp的DNA片胶，见图3。产物以氯仿抽提，乙醇沉淀回收，溶于10μl的灭菌水中。
实施例6 蚯蚓抑癌蛋白质的基因克隆。
取PCR回收产物2μl与T-载体1μl连接，转化，经蓝白斑筛选，酶切和PCR鉴定，获得阳性克隆。
实施例7 蚯蚓抑癌蛋白质基因的鉴定实施例6中获得的阳性克隆委托博亚公司测定，基因全序列和编码的蛋白质序列见SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，或见图4。该成熟蛋白的cDNA编码717个核苷酸(序列中未列出起始密码子和终止密码子)，即239个氨基酸。
经电脑软件分析该蛋白质的分子量为24744.67，等电点为4.28。
实施例8 兔抗蚯蚓抑癌蛋白质抗体的制备取体重为2公斤左右的雄性新西兰大耳兔一只，以1mg蚯蚓抑癌蛋白质样品加弗氏完全佐剂研磨成乳胶状，在兔颈部多点注射，饲养半个月后，以1mg蚯蚓抑癌蛋白质加弗氏不完全佐剂研成乳胶状，再在兔颈部多点注射，一个月后再1mg蚯蚓抑癌蛋白质加弗氏不完全佐剂再次加强免疫，饲养半个月后颈动脉取血，4℃静置过夜，2000转离心3分钟，上清液为兔抗蚯蚓抑癌蛋白质抗体。
实施例9 蚯蚓抑癌蛋白质的基因表达和鉴定为核实该基因所编码的蚯蚓抑癌蛋白质就是天然提取的蚯蚓抑癌蛋白质，将该基因的翻译区克隆到原核表达载体PGEX4T-1(购自Pharmacia Biotech)的EcoRI和XholI酶切位点中，见图5。然后将重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导基因表达。
用实施例8中制得的兔抗蚯蚓抑癌蛋白质抗体与表达产物进行SDS-PAGE图谱和Western杂交鉴定。
结果见图6，由结果可见，所表达的蛋白质与蚯蚓抑癌蛋白质抗体能够专一性地结合。
实施例10 蚯蚓抑癌蛋白质对多种培养的癌细胞的抑制作用在本实施例中，分别选用了下列几种常规的癌细胞进行抑制试验SMCC7721(人肝癌细胞)，SW620(人结肠癌细胞)，H08910(人卵巢癌细胞)，HepG2(人肝细胞肝癌)，A549(人肺癌细胞)，BCAP-37(人乳腺癌细胞)，HeLa(人宫颈癌细胞)，BGC823(人低分化胃腺癌细胞)，T24(人膀胱癌细胞)和L1210(小鼠白血病细胞)。上述癌细胞购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库，或可购自美国ATCC。
各种细胞分为对照组和测试组，测试组中EFE6蛋白的终浓度为50μg/ml。24小时培养后，与对照组细胞相比。
结果发现，除了L1210(小鼠白血病细胞)以外，其它各个加入EFE6蛋白的测试组中癌细胞生长均发生明显抑制，可见EFE6蛋白有明显的抑癌效果，但其对L1210(小鼠白血病细胞)无作用。具体结果见图7。
实施例11 蚯蚓抑癌蛋白质的其它生物活性的测定1.检测酯酶活性以BAEE为底物测定了蚯蚓抑癌蛋白质的酯酶活性，结果表明蚯蚓抑癌蛋白质水解BAEE。测定所用BAEE溶解在pH 7.8，0.05M Tris-HCl缓冲液中，浓度为0.8×10-3M，取2.9ml底物溶液加0.1ml EFE6蛋白(终浓度为10微克/毫升)。
在253nM下测定光密度变化，经计算EFE6蛋白水解BAEE的效价为100活力单位/毫克蛋白质。
2.检测纤溶活性按Deogny所描述的纤维蛋白平板法(Clinica Chimica Acta，1975，6085)测定了蚯蚓抑癌蛋白质的纤溶活性，通过测量溶圈的面积计算纤溶活性的大小，结果表明蚯蚓抑癌蛋白质具有纤溶活性，活力达25,000mm2/mg EFE6蛋白。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求
书所限定的范围。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>一种广谱抑制癌细胞生长的蚯蚓蛋白及其编码序列<130>059726<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>717<212>DNA<213>威廉腔环蚓(Metaphire guillelmi)<400>1atcctggggg gacaggatgc ctctcctgga gagttcccgt ggcaactgtc ccagttgaga 60ggtggaagcc acagctgcgg agcctctctc ctccacgcga cagctgctct cagtgccgcc 120cactgcgtcg acggagcact cgtatcatcc gttgatgtca tcgccggtct tcatcggcga 180tcagatctta ctggaacaca gacttcagct gctgcgtcat tcagcattaa cgtgaactac 240gataacggag agggtacatt cgcacatgat atctccatca tccacctcgc cacagccatc 300gacgcctcgc cagccaacat cgcgtttttg acccttcctc cagacaacag ctatcagttt 360actggtgaca cctgcactct cagtggatgg ggacgtacat ctgccagtaa cattcttccg 420gacacgctgc agaaagtcga cattgaagta atcagcacag acgagtgcaa cgttcgtatg 480gctaccgtca ttggtgccga ctgcactgat aatcaaatcg cagttttcga tgttgccgag 540aacgagggat cgtgcaacgg tgacagcgga ggcccgatga actgccagct caatggtcag 600actgtggttg ccggaataac gtcgtgggga atccagtcgg gcggcgcctg tgcaccatcc 660tacccatctg tctacaccag gacttcagcc taccttcaat ggatcagcga caaccaa 717<210>2<211>239<212>PRT<213>威廉腔环蚓(Metaphire guillelmi)<400>2
Ile Leu Gly Gly Gln Asp Ala Ser Pro Gly Glu Phe Pro Trp Gln Leu1 5 10 15Ser Gln Leu Arg Gly Gly Ser His Ser Cys Ala Ala Ser Leu Leu His20 25 30Ala Thr Ala Ala Leu Ser Ala Ala His Cys Val Asp Gly Ala Leu Val35 40 45Ser Ser Val Asp Val Ile Ala Gly Leu His Arg Arg Ser Asp Leu Thr50 55 60Gly Thr Gln Thr Ser Ala Ala Ala Ser Phe Ser Ile Asn Val Asn Tyr65 70 75 80Asp Ash Gly Glu Gly Thr Phe Ala His Asp Ile Ser Ile Ile His Leu85 90 95Ala Thr Ala Ile Asp Ala Ser Pro Ala Asn Ile Ala Phe Leu Thr Leu100 105 110Pro Pro Asp Asn Ser Tyr Gln Phe Thr Gly Asp Thr Cys Thr Leu Ser115 120 125Gly Trp Gly Arg Thr Ser Ala Ser Asn Ile Leu Pro Asp Thr Leu Gln130 135 140Lys Val Asp Ile Glu Val Ile Ser Thr Asp Glu Cys Asn Val Arg Met145 150 155 160Ala Thr Val Ile Gly Ala Asp Cys Thr Asp Asn Gln Ile Ala Val Phe165 170 175Asp Val Ala Glu Asn Glu Gly Ser Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro180 185 190Met Asn Cys Gln Leu Asn Gly Gln Thr Val Val Ala Gly Ile Thr Ser195 200 205Trp Gly Ile Gln Ser Gly Gly Ala Cys Ala Pro Ser Tyr Pro Ser Val210 215 220Tyr Thr Arg Thr Ser Ala Tyr Leu Gln Trp Ile Ser Asp Asn Gln225 230 235<210>3<211>10<212>PRT<213>威廉腔环蚓(Metaphire guillelmi)
<400>3Ile Leu Gly Gly Gln Asp Ala Ser Pro Gly1 5 10<210>4<211>20<212>DNA<213>引物<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>n＝a，t，c或g<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>n＝a，t，c或g<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>n＝a，t，c或g<400>4athctnggng gncargaygc 20
权利要求
1.一种分离的蚯蚓多肽，其特征在于，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；或(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑癌功能的由(a)衍生的多肽。
2.如权利要求
1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码如权利要求
1所述多肽的多核苷酸；或(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求
3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求
3所述的多核苷酸。
6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求
5所述的载体。
7.一种权利要求
1所述多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养权利要求
6所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出权利要求
1所述的蚯蚓多肽。
8.一种能与权利要求
1所述的蚯蚓多肽特异性结合的抗体。
9.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求
1所述的多肽以及药学上可接受的载体。
10.权利要求
1所述的蚯蚓多肽的用途，其特征在于，所述的蚯蚓多肽用于(a)制备治疗癌症的药物；(b)制备具有酯酶活性的药物；或(c)制备具有纤维蛋白溶解活性的药物。
专利摘要
本发明公开了一种新的可广谱抑制癌细胞生长的蛋白质EFE6、编码所述蛋白质EFE6的多核苷酸序列以及制备所述蛋白质的方法。本发明的EFE6蛋白首先从蚯蚓中分离得到。本发明的蛋白质具有广谱的抑癌用途，并且还具有酯酶活性和纤维蛋白溶解活性。
文档编号A61P43/00GK1990504SQ200510112490
公开日2007年7月4日 申请日期2005年12月30日
发明者刘小龙, 缪红华, 王晓明, 朱洪, 王益清, 徐丹, 周元聪 申请人:中国科学院上海生命科学研究院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan