利用家蚕后部丝腺合成分泌人血清白蛋白的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种家蚕合成分泌外源蛋白的方法，尤其是涉及利用转基因技术的一 种利用家蚕后部丝腺合成分泌人血清白蛋白的方法。
【背景技术】
[0002] 成熟的人血清白蛋白分子由585个氨基酸残基组成，分子量为66. 5KDa，是一种可 溶性的非糖基化球蛋白。人血清白蛋白存在于人血清中，占血清总蛋白量的50%以上，具有 维持人体血液胶体渗透压，以及运输代谢产物和化学药物的作用。人血清白蛋白在现代医 学中是一个重要的生物制品，用于血容量扩充剂，补充人体蛋白质，维持正常的血液循环。 对于因失血、创伤及烧伤等引起的休克，脑水肿及大脑损伤所致的脑压升高，防治低蛋白血 症、肝硬化、肾病等有特殊的疗效。人血清白蛋白还具有解毒作用，参与脂类代谢、血浆中微 溶物质的运输、维持血液酸碱平衡等。目前，全球白蛋白销售量高达600吨，每年销售额为 30亿美元以上。中国市场1999年销售量为66吨，年销售额在30亿元人民币左右。国内 目前人血清白蛋白的市场缺口约10亿元人民币。在1999年北京、天津、上海、南京、西安等 10个地区98家医院的药品使用金额排行榜中，人血清白蛋白排列第二位，并根据动态统计 被列为具有发展余地大、进口量比重大、进口额高的几十种药品的首位。
[0003] 人血清白蛋白在人类的医疗过程中起着重要作用，但白蛋白药品市场的现状却令 人担忧。目前人血清白蛋白的主要来源仍然是采用人血分离纯化获得，但献血人群中常常 存在乙肝、丙肝、获得性免疫缺陷综合症（AIDS)等血液传播性疾病患者，生产白蛋白的过 程中不可避免地会把一些病原物质带入最后成品，而目前国内的技术手段还不能对产品进 行多次提纯，市售的白蛋白纯度为95- 97%，致使静脉滴注后过敏反应频繁发生。
[0004] 家蚕饲养在我国有悠久的历史，技术非常深厚，发展和应用家蚕生物反应器生产 广大群众用得起的生物药物非常符合我国国情。所以，将重要经济价值的基因导入家蚕基 因组，利用丝腺器官具有高效合成蛋白质的能力，育成一批能够高效率大规模生产高附加 值的外源蛋白，并依靠家蚕本身的繁殖续代能力维持家蚕种系，大幅度提升家蚕经济价值， 开创蚕桑生产新局面，具有极大的经济效益和广阔的应用前景。
[0005] 家蚕后部丝腺分泌合成的蚕丝蛋白占整个茧层重的70% -80%，表达效率高，并 且具有组织特异性表达的特点。后部丝腺表达的可溶性人血清白蛋白可以直接用磷酸盐缓 冲液提取，有利于人血清白蛋白保持生物活性，而且能够方便提纯。利用高效、优质、安全的 转基因家蚕丝腺生物反应器生产人血清白蛋白，是利国利民的新举措。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于利用转基因家蚕技术将人血清白蛋白基因导入家蚕基因组内， 并在家蚕后部丝腺细胞中特异表达，提供一种利用家蚕后部丝腺合成分泌人血清白蛋白的 方法，开发出能合成分泌人血清白蛋白的家蚕，通过家蚕后部丝腺细胞分泌的人血清白蛋 白可以在茧层中用磷酸盐缓冲液直接提取，为提高人血清白蛋白的生产效率、降低生产成 本奠定基础。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：
[0008] (1)采用分子生物学方法构建家蚕合成分泌人血清白蛋白的质粒pBHSA，质粒 pBHSA包含有作为外源基因的人血清白蛋白基因；
[0009] (2)采用显微注射转基因家蚕方法将pBHSA质粒及能够提供piggyBac转座酶的 辅助质粒PHA3PIG质粒按浓度比1 :1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，利用 piggyBac转座子将人血清白蛋白基因插入到家蚕基因组内；
[0010] ⑶蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代，此代为G1代，在 G1代蚕卵的转青期，通过荧光体视显微镜观察筛选出单眼表达红色荧光DsRed标记基因的 转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代；
[0011] (4)G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基 因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；
[0012] (5)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾相互交配， 制成G4代；
[0013] (6)从G4代开始选择红眼表型纯合的蛾区饲养，采用单蛾育，同蛾区蚕蛾交配，经 连续3代同样方法的选择、交配，育成红眼基因和人血清白蛋白基因纯合、后部丝腺细胞能 够合成分泌人血清白蛋白的转基因家蚕；
[0014] (7)通过家蚕后部丝腺细胞合成分泌人血清白蛋白，并随家蚕吐丝结茧行为进入 蚕茧。
[0015] 如图1所示，所述的质粒pBHSA是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基 因以用于质粒的扩增和筛选，质粒pBHSA包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR 以用于目的片段转座以及两个转座臂PBL和PBR之间的两个功能表达框，一个功能表达框 是3XP3启动子启动的红色荧光蛋白基因表达框，即3XP3Promoter-DsRed-SV40,以用作 转基因阳性家蚕的筛选标记；另一个功能表达框是包含蚕丝素蛋白轻链基因启动子、丝素 蛋白轻链基因信号肽、六个组氨酸标签His-Tag、肠激酶酶切位点DDDDK氨基酸序列、人血 清白蛋白基因（HAS编码基因）和家蚕丝素蛋白轻链基因3'末端的表达框，即FibroinL chainPromoter-FibroinLchainsignalpeptide-Histag-DDDDK-HSA-FibroinLchain PolyA，六个组氨酸标签His-Tag用于提纯外源蛋白，肠激酶酶切位点DDDDK氨基酸序列用 于去除六个组氨酸标签。
[0016] 如图2所示，所述的辅助质粒pHA3PIG质粒包含Amp抗性基因、piggyBac 转座子的一个转座臂PBR、A3启动子启动的piggyBac转座酶的表达框，即 A3Promoter-transposase_SV40 〇
[0017] 所述的人血清白蛋白基因在家蚕后部丝腺细胞特异表达，在家蚕丝素蛋白轻链信 号肽的作用下，分泌到后部丝腺腺腔，并依次进入中部丝腺和前部丝腺，直到蚕茧。
[0018] 本发明是先构建家蚕合成分泌人血清白蛋白的载体pBHSA质粒，再利用显微注射 转基