南美白对虾肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的荧光定量pcr检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种南美白对虾肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的荧光定量PCR检测方法。该方法包括以下步骤：（1）南美白对虾肝胰腺样品总RNA的提取；（2）以总RNA为模板反转录合成cDNA；（3）荧光定量PCR扩增SOD和PO特异性序列：选用特异性引物，PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃变性30s、60℃退火15s、72℃延伸30s；（4）根据测得的SOD、PO及内参基因β-actin的ct值，计算出SOD和PO的相对含量。本发明不仅可以同时测定多个免疫相关因子，而且引物特异性好，扩增效率高，提高了检测的准确性。
【专利说明】南美白对虾肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的荧光定量PCR检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于水生动物免疫学分子检测技术，具体涉及采用荧光定量PCR相对定量技术实时检测南美白对奸超氧岐化酶(superoxide dismutase, SOD)和酹氧化酶(phenoloxidase, PO)基因的表达，为评估免疫增强剂、不同养殖条件对虾免疫状态的影响提供参考依据。
【背景技术】
[0002]南美白对虾属甲壳类动物，其免疫主要为非特异性免疫，包括体液免疫中的一些非特异性的酶或因子来进行的。抗氧化酶是无脊椎动物机体非特异性免疫的一个重要方面，其中SOD是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为O2和H2O2的酶。SOD是抗氧化系统中起关键作用的酶，不仅具有清除体内自由基的作用，而且在机体免疫调节中具有重要的作用。PO又被称为酪氨酸酶，是一种含铜的氧化还原酶，在对虾血细胞内以酚氧化物酶原(Prophenoloxidase,proPO)的形式存在,是一条单一的多肽链，可被激活为60kD和62kD具PO活性的酶分子。PO能够催化单酚羟化成二酚，再把二酚氧化成醌，醌在非酶促条件下形成反应终产物黑色素。但反应链的短暂中间产物拥有很高生物毒性，能够抑制病原体胞外蛋白酶以及几丁质酶的活性，属于一种酶级联反应系统，在南美白对虾抵抗病原菌侵袭过程中具有重要作用。
[0003]目前大多检测南美白对虾免疫活性因子是通过采集血清，采用生化反应方法检测免疫相关酶。由于采集过程及检测过程，酶活性极易受外界环境的影响，常导致检测结果波动性很大，检测的可 靠性受影响。酶的产生是通过基因的转录、翻译及后加工形成的，其转录水平的高低也可反映机体的免疫状态。虾肝胰腺是其血细胞产生的主要场所，肝胰腺组织免疫因子的转录表达也可作为评价机体免疫能力的指标之一。荧光定量PCR检测技术已经成为国际上检测基因表达通用的方法，能对低丰度mRNA水平进行定量分析。设计特异性强的引物以及合适的反应条件是利用荧光定量PCR检测南美白对虾免疫相关因子的关键。本发明设计的引物及反应条件可同时用于检测南美白对虾肝胰腺SOD和PO的转录相对定量表达检测，为今后准确分析其南美白对虾免疫状态提供了新的方法。该技术未见相关的专利报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是克服现有技术的不足，建立一种南美白对虾肝胰腺免疫相关因子S0D、PO的荧光定量检测方法，该方法特异性强，敏感性高，克服酶法测定易波动的问题，适合南美白对虾免疫活力的评估。
[0005]本发明解决所述技术问题的方案为:一种南美白对虾肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤，
[0006](I)南美白对虾肝胰腺样品总RNA的提取:取南美白对虾肝胰腺组织，用Trizol裂解液裂解，加入氯仿，离心得到总RNA，用DEPC水溶解RNA后测定RNA浓度和纯度；
[0007](2)以总RNA为模板反转录合成cDNA ；
[0008](3)荧光定量PCR扩增SOD和PO特异性序列:PCR反应条件为95°C预变性5min，95°C变性30s、60°C退火15s、72°C延伸30s ;所用特异性引物序列为:
【权利要求】
1.一种南美白对虾肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的荧光定量PCR检测方法，其特征在于:包括以下步骤， (O南美白对虾肝胰腺样品总RNA的提取:取南美白对虾肝胰腺组织，用Trizol裂解液裂解，加入氯仿，离心得到总RNA，用DEPC水溶解RNA后测定RNA浓度和纯度； (2)以总RNA为模板反转录合成cDNA； (3)荧光定量PCR扩增SOD和PO特异性序列:PCR反应条件为95°C预变性5min，95°C变性30s、60°C退火15s、72°C延伸30s ;所用特异性引物序列为:
2.如权利要求1所述的南美白对虾肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的荧光定量PCR检测方法，其特征在于:所述南美白对虾肝胰腺样品总RNA提取的具体步骤为: 取南美白对虾完整肝胰腺组织，加入500 μ L Trizol裂解液，研磨、匀浆后，取50 μ L匀浆液加入ImL Trizol继续裂解，其余匀浆液置-80°C保存备用；或将完整肝胰腺在液氮中速冻后，置于_80°C保存，使用时，将组织全部碾磨后，取IOOmg加入ImL Trizol裂解，其余组织粉末置_80°C保存备用； 取出的50 μ L匀浆液或IOOmg组织粉末裂解后，离心、吸取上清至新的离心管，加入.200yL氯仿后混匀；再次离心、吸取上清至新的离心管，加入等体积异丙醇后混匀、静置；离心后弃上清，用500 μ LDEPC水配制的70%乙醇洗涤沉淀，弃去上清；用100 μ LDEPC水溶解RNA后测定RNA浓度和纯度。
3.如权利要求1所述的南美白对虾肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的荧光定量PCR检测方法，其特征在于:所述以总RNA为模板反转录合成cDNA的具体步骤为:
取 1μ g 总 RNA 为模板，加入 IOmM dNTPl μ L, 50mM Oligo (dT) 151 μ L，加 DEPC 水至总体积6.25 μ L, 65°C变性5min,冰上骤冷2min ； 上述反应液加入5 XMMLV Buffer2 μ L，RNA酶抑制剂0.25 μ L7MMLV逆转录酶0.5 μ L，.1OmM 二硫苏糖醇(DTT) I μ L，使最终反应总体积达10 μ L ; 42°C反应Ih后，65°C孵育lOmin，cDNA合成完毕，合成后的cDNA加入90 μ L无菌双蒸水稀释10倍，可立即用于后续PCR扩增，也可储于-20°C备用。
4.如权利要求1所述的南美白对虾肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的荧光定量PCR检测方法，其特征在于:所述荧光定量PCR扩增SOD和PO特异性序列的步骤为: 取合成的cDNA稀释液5 μ L作为扩增模板，分别加入2 X sybgreen反应预混液.12.5 μ L，5 μ M相应的特异性上游和下游引物各0.5 μ L，加无菌双蒸水6.5 μ L，使反应总体系达25 μ L，置于荧光定 量PCR仪上进行PCR反应。
【文档编号】C12Q1/68GK103898224SQ201410141366
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月10日 优先权日:2014年4月10日
【发明者】刘莉, 林锋, 曹铮, 蔺凌云, 叶雪平, 沈锦玉 申请人:刘莉