一种从火水母刺细胞毒液中提取的多肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及海洋生物技术和医药领域，具体涉及一种从火水母刺细胞毒液中提取 的多肽及其应用。
【背景技术】
[0002] 北部湾火水母（Tamoya alata Uchida)是仅分布在我国北部湾海域的一种大型 剧毒水母，触腕长且具有大量的刺丝囊细胞，内含主要活性成分为蛋白质/多肽的毒液，与 人或动物接触时该刺细胞会扎入皮肤，可深入到真皮部位，并释放细胞内贮存的毒素，造成 蛰伤。根据受伤严重程度不同，受害者被蛰处即时出现皮肤红肿、刺痛、流血、皮肤溃烂等现 象，严重者虚弱，发热，呕吐，甚至死亡。宄其原因，水母触腕的刺细胞内含有大量的水母毒 素，主要是结构新颖的蛋白类物质。
[0003] 水母种类不同，其生理结构以及体内所含的毒素成分和活性也存在较大差异，这 就致使不同种类水母的毒素的分离纯化工作难以效仿，只能通过繁杂的试验摸索得到。所 以水母毒素的分离纯化工作具有很大的难度。发明人对火水母毒液进一步研宄，从该毒液 中可以分离出一种具有显著抗肿瘤活性的多肽，该毒液具有显著的抗肿瘤活性，相应活性 成分是一种蛋白质。
[0004] 鼻咽癌是发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤。是我国高发恶性肿瘤之一，发病 率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首。鼻咽癌大多对放射治疗具有中度敏感性，放射治疗是鼻咽癌 的首选治疗方法。但是对较高分化癌，病程较晚以及放疗后复发的病例，手术切除和化学药 物治疗亦属于不可缺少的手段。因此，亟需一种保守的治疗方法是亟需解决的技术问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优 点。
[0006] 本发明还有一个目的是提供一种从火水母刺细胞毒液中提取的多肽，其能够抑制 鼻咽癌肿瘤细胞株CNE-1，CNE-2生长，诱导鼻咽癌肿瘤细胞株CNE-2凋亡。
[0007] 本发明还有一个目的是提供一种所述多肽的提取方法，操作简单，分离步骤少，适 宜于快速分离；分离条件温和，能最大程度地保存所得蛋白质的抗肿瘤活性。
[0008] 本发明还有一个目的是提供一种所述多肽的应用。
[0009] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种从火水母刺细胞毒液中 提取的多肽，氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0010] 一种从火水母刺细胞毒液中提取的多肽的提取方法，从火水母刺细胞毒液中提取 毒液蛋白，之后依次使用Histrap SP强阳尚子交换柱和Histrap Q强阴尚子交换柱从毒液 蛋白中分离如权利要求1所述的多肽。
[0011] 优选的是，所述的从火水母刺细胞毒液中提取多肽的提取方法，还包括以下步 骤：
[0012] 步骤一、从活的火水母取触腕，与0-4°C的去离子水按照体积比为I : 1-1. 5混合， 搅拌、静置后，取沉淀重复2-4次，第一次离心，收集沉淀物；
[0013] 步骤二、将步骤一得到的沉淀物与总磷酸盐浓度为0. 025mol/L，pH为5. 5-6. 5的 磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液按照质量体积比Ig : 40-60mL混合，超声波破碎，第二 次离心，收集上清液，得到毒液蛋白；
[0014] 步骤三、取步骤二得到毒液蛋白，用总磷酸盐浓度0. 025mol/L，pH为5. 5-6. 5的磷 酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液稀释3-5倍，使之缓慢流经Histrap SP强阳离子交换柱， 按照4-6倍柱体积加入氯化钠浓度为0. 035-0. 045mol/L、pH为5. 5-6. 5的第一磷酸盐缓冲 溶液进行第一次淋洗，然后按照4-6倍柱体积加入氯化钠浓度为0. 045-0. 060mol/L、pH为 5. 5-6. 5的第二磷酸盐缓冲溶液进行第二次淋洗，收集淋洗液得到第二淋洗液；
[0015] 步骤四、取步骤三得到第二淋洗液进行缓冲溶液置换，变更缓冲溶液为总磷酸盐 浓度为〇. 〇25mol/L，pH为7. 5-8. 5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，使之缓慢流经 Histrap Q强阴离子交换柱，按照4-6倍柱体积加入氯化钠浓度为0· 020-0. 040mol/L、pH 为7. 5-8. 5的第三磷酸盐缓冲溶液进行第三次淋洗，然后按照4-6倍柱体积加入氯化钠浓 度为0. 040-0. 050mol/L、pH为7. 5-8. 5的第四磷酸盐缓冲溶液进行第四次淋洗，收集淋洗 液得到第四淋洗液；
[0016] 步骤五、取步骤四得到的第四淋洗液进行第三次离心超滤浓缩，收集上清液，减压 冷冻干燥，即得所述多肽。
[0017] 优选的是，所述的从火水母刺细胞毒液中提取的多肽的提取方法，还包括以下步 骤：
[0018] 步骤一、从活的火水母取触腕，与2°C的去离子水按照体积比为1 : 1.3混合，搅 拌、静置后，取沉淀重复3次，第一次离心，收集沉淀物；
[0019] 步骤二、将步骤一得到的沉淀物与总磷酸盐浓度为0. 025mol/L、pH为6. 0的磷酸 氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液按照质量体积比Ig : 50mL混合，超声波破碎，第二次离心， 收集上清液，得到毒液蛋白；
[0020] 步骤三、取步骤二得到毒液蛋白，用总磷酸盐浓度0· 025mol/L、pH为6. 0的磷酸氢 二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液稀释4倍，使之缓慢流经Histrap SP强阳离子交换柱，按照5 倍柱体积加入氯化钠浓度为〇. 040mol/L、pH为6. 0的第一磷酸盐缓冲溶液进行一次淋洗， 然后按照5倍柱体积加入氯化钠浓度为0. 055mol/L、pH为6. 0的第二磷酸盐缓冲溶液进行 第二次淋洗，收集淋洗液得到第二淋洗液；
[0021] 步骤四、取步骤三得到第二淋洗液进行缓冲溶液置换，变更缓冲溶液为总磷酸盐 浓度为0. 〇25mol/L、pH为8. 0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，使之缓慢流经经过 Histrap Q强阴离子交换柱，按照5倍柱体积加入氯化钠浓度为0· 030mol/L、pH为8. 0的 第三磷酸盐缓冲溶液进行第三次淋洗，然后按照5倍柱体积加入氯化钠浓度为0. 045mol/ L、pH为8. 0的第四磷酸盐缓冲溶液进行第四次淋洗，收集淋洗液得到第四淋洗液；
[0022] 步骤五、取步骤四得到的第四淋洗液进行第三次离心超滤浓缩，收集上清液，减压 冷冻干燥，即得所述多肽。
[0023] 优选的是，所述的从火水母刺细胞毒液中提取的多肽的提取方法，所述步骤五超 滤所使用的超滤管的截留分子量为30K。
[0024] 优选的是，所述的从火水母刺细胞毒液中提取的多肽的提取方法，所述一次离心 的操作条件为：离心力l〇〇〇G，4°C，15min ;所述二次离心的操作条件为：离心力13000G， 4°C，2h ;所述三次离心的操作条件为：离心力5000G，4°C，lh。
[0025] 优选的是，所述的从火水母刺细胞毒液中提取的多肽的提取方法，所述的第一磷 酸盐缓冲溶液和第二磷酸盐缓冲溶液均为总磷酸盐浓度为0. 〇25mol/L的磷酸氢二钠-磷 酸二氢钠缓冲溶液；第三磷酸盐缓冲溶液和第四磷酸盐缓冲溶液均为总磷酸盐浓度为 0. 025mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液。
[0026] -种从火水母刺细胞毒液中提取的多肽在制备抗鼻咽癌的药物的应用。
[0027] 本发明至少包括以下有益效果：
[0028] 第一、本发明从火水母刺细胞毒液中提取一种新的多肽，是依次经过Histrap SP 强阳离子交换柱和Histrap Q强阴离子交换柱，从毒液蛋白中分离得到的，是具有抗鼻咽癌 肿瘤活性的新蛋白，属于开创性发明；
[0029] 第二、将触腕以1 : 1-1. 5体积比浸泡在0_4°C的去离子水中，防止温度高导致 触腕蛋白变性以及便于低温下触腕自解，搅拌静置多次破坏和分解触腕的胶原蛋白和保护 层；
[0030] 第三、一次离心在1000G，4°C，15min下进行，需要将触腕完全溶解为触细胞；二次 离心在13000G，4°C，2h下进行，需要将触细胞破碎后毒液蛋白全部溶出，超声波破碎细胞 残片粒径越小需要的离心力越大；三次离心在5000G，4°C，Ih下进行，需要将经过层层分离 后得到蛋白进行浓缩；
[0031] 第四、将毒液蛋白经过Histrap SP强阳离子交换柱，弱酸性的缓冲溶液使得大部 分毒液蛋白与H+结合然后带正电荷，强阳离子交换柱吸附带正电荷的毒液蛋白，依次用氯 化钠浓度为〇· 035-0. 045mol/L的第一磷酸盐缓冲溶液和氯化钠浓度为0· 045-0. 060mol/ L的第二磷酸盐缓冲溶液淋洗，摒弃一部分不需要的蛋白，然后交换缓冲溶液为0. 025mol/ L，pH为7. 5-8. 5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，弱碱性的缓冲溶液使得大部分 蛋白质带负电荷，再经过Histrap Q强阴离子交换柱，强阴离子交换柱吸附带负电荷的 蛋白，依次用氯化钠浓度为0. 020-0. 040mol/L的第三磷酸盐缓冲溶液和氯化钠浓度为 0. 040-0. 050mol/L的第四磷酸盐缓冲溶液淋洗，获得目标蛋白；
[0032] 第五、本发明得到的多肽经过实验证明具有抗鼻咽癌活性，抑制鼻咽癌肿瘤细胞 株CNE-I，CNE-2生长，诱导鼻咽癌肿瘤细胞株CNE-2凋亡，采用本发明的方法可以大批量处 理火水母刺细胞毒液，分离出其中含有的抗肿瘤活性蛋白。操作简单，分离步骤少，适宜于 快速分离；分离条件温和，能最大