一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式及建立方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式及建立方法。
【背景技术】
[0002]人类及哺乳动物的毛发、牙齿、指甲、汗腺，鸟类的羽毛，鱼类的鳞片、下咽齿、触须等都属于皮肤附件，而皮肤附件的发育对于人类来说至关重要，而且皮肤附件发育不良患者具有家族遗传性，目前在小鼠、鱼等也发现有此类现象，通过遗传学研宄已证实，皮肤附件的发育主要由EDA家族基因调控。
[0003]Eda (Eetodysplasin)及受体Edar与TNF相关联，属于TNF超家族成员，EDA信号是通过Eetodysplasin、EDAR、EDARADD来调节，在鱼类到人类的脊椎动物皮肤附件调控中形成了一个TNF配体-受体-适体家族。EDA信号通路首次在人类外胚层发育不良综合症发现。无汗或少汗型外胚层发育不良(EDA)是外胚层发育不良群体中最普遍的一种症状，主要影响两种或更多种皮肤附件的形态发生。
[0004]EDA主要影响毛发、牙齿和集中外分泌腺包括汗腺、睑板腺和包皮腺。作为一种遗传学疾病，EDA以X-连锁隐性、常染色体显性和隐性等形式发生。1875年达尔文首次在他的书《The variat1ns of animals and plants under domesticat1n》中描述了 X-连锁形式，详细地记录了一个受影响印第安家族皮肤附件的表型和男性特有的遗传模式。100多年以后在病人中发现了三种基因各种形式的变异，其中X-连锁万伽基因突变在案例中占90%以上，其余案例主要是及况财卩品⑷堪因比较罕见的常染色体显性遗传。大量的结果证明EDA、EDA靡堪因编码了参与皮肤附件发育的TNF配体-受体-适体家族。Eetodysplasin是一个由X性染色体连锁的万伽基因编码的二型跨膜蛋白，其在细胞外区域包含一个短的胶原部分(colIagen)和一个TNF域。在接近collagen区有弗林蛋白酶(furin)位点，产生可溶性的EDA配体，再形成有活性的配体三聚体。目前已经发现在TNF、collagerufurin切割和跨膜位点发生错义或阅读框内的缺失突变，会引起EDA综合症。TNF是Eetodysplasin的功能结构域，然而在病人中发现的一些突变显示，collagen区也有很重要的作用，该区域包含19个G-X-Y重复，在阅读框内的2个G-X-Y重复或4个G-X-Y重复的缺失虽然不影响TNF域的功能，但同样可以导致EDA综合症。比较基因组学和遗传学研宄发现人、鼠、鱼、非洲爪蟾、鸡、牛、黑猩猩等EDA、EDAR、谨琢在进化过程中高度保守。
[0005]目前发现相似的自发突变动物模型有突变的青鏘鱼、沒况突变的狗和牛，Tabby, Downless/Sleek和Crinkled小鼠突变体。人的及况基因突变和自然突变的tabby小鼠的表型一致，表现为毛囊数量的下降或缺失以及汗腺管与牙齿发育的缺陷。皮肤附件表现为物种特异性，相对于哺乳动物的毛发、汗腺，鱼类主要是骨板、鳞片等。Colosimo等(2005年)研宄发现，在三刺鱼从海洋到淡水的过渡中EDA也参与骨板模式的适应性进化。小鼠的EDA-Al可以使淡水三刺鱼骨板恢复与海洋三刺鱼的一致的模式，进一步指出万伽基因对于皮肤附件平行进化的适应性(可塑性)。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式。
[0007]本发明所要解决的另一个技术问题是提供该鳞片缺失斑马鱼模式的建立方法。
[0008]为解决上述问题，本发明所述的一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式，其特征在于:该模式是指包含EDA基因外显子4位点碱基插入的鳞片缺失斑马鱼。
[0009]如上所述的一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式的建立方法，包括以下步骤:
⑴利用Ensemble在线数据库，查找斑马鱼EDA基因序列no:ENSDARG00000074591并下载，在该序列查找PAM序列即5’ -GGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG-3’，在EDA基因外显子找到的靶向作用序列为TTAGGCAAGAAAGGGCCCCC【TGG】，并设计并设计突变检测引物F_eda:ttgttttgcttctcatcagttg 和突变检测引物 R-eda: tttgctctgctgcttcactc ；
⑵目标序列的野生型等位基因的测序验证:
随机选取5枚24hpf野生型斑马鱼胚胎，提取基因组DNA模板，然后用F-eda和R_eda进行PCR扩增，得到片段长度为358bp的PCR扩增产物I，该PCR扩增产物I以所述突变检测引物F-eda直接测序，以表明目标基因组序列和数据库中的序列一致，无SNP应用重叠；⑶构建sgRNA:
⑷建立eda-sgRNA模板:
以PCR法获得sgRNA的体外转录的模板，该模板序列如下:TAATACGACT CACTATA^nAGGCAAGAAA GGGCCCCCgt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaacttgaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt t ；
(5)sgRNA体外转录:
以所述PCR扩增产物I为模板，用T7 RNA聚合酶进行sgRNA体外转录，得到sgRNA ;所述sgRNA经无水乙醇法沉淀后使其浓度为1000ng/ul ；
(6)Cas9 mRNA体外转录:
以U7驱动的人源化的Cas9编码序列(Mali et al.，2013.Science,339(6121):823-6)为模板，用U7 RNA聚合酶进行Cas9体外转录，然后戴帽并加尾，得到Cas9 mRNA;所述Cas9 mRNA经无水乙醇法沉淀后使其浓度为600ng/ul ；
(7)斑马鱼受精卵的显微注射及突变检测:
将所述sgRNA与所述Cas9 mRNA等量混合后，显微注入到1~2细胞期的野生型斑马鱼受精卵，待胚胎发育至24 hpf时，取5枚胚胎，制备基因组DNA模板，然后以所述突变检测引物F-eda和所述突变检测引物R-eda进行PCR扩增，得到PCR扩增产物II ;将所述PCR扩增产物II亚克隆到pEASY-T3载体中；并以T7和Sp6通用引物对转化子进行扩增，将PCR产物十个一组共两组直接送测序，测序引物为T7或Sp6其中一条；
(8)突变体鳞片发育观察及染色鉴定:
对检测有EDA基因突变的斑马鱼的鳞片发育情况进行显微观察，筛选获得EDA基因外显子4靶位点引入插入突变导致鳞片缺失突变体，对鳞片发育异常个体进行鳞片染色鉴定，以确定鳞片是否有发育缺陷。
[0010]如上所述的一种由Crisper/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式的应用，其特征在于:该鳞片缺失斑马鱼模式应用于皮肤附件相关基因功能的验证及外胚层发育不良药物的筛选。
[0011]本发明与现有技术相比具有以下优点:
1、本发明针对斑马鱼EDA基因(含8个外显子)，设计靶向作用于外显子4位点的EDA-sgRNA (见图1 )，通过构建EDA-sgRNA和Cas9 mRNA载体，反转录后注射受精卵，经PCR扩增及测序验证检测到在外显子4位点引物12个碱基的插入突变(见图2)。
[0012]2、本发明对EDA基因插入突变的个体及野生型个体进行鳞片发育情况观察及染色鉴定，发现该突变体基本上没有鳞片发育，而野生型个体鳞片覆盖全身(见图3)。
[0013]3、本发明建立的鳞片缺失斑马鱼模式在皮肤附件相关基因功能研宄、筛选治疗人类头发稀少等外胚层发育不良药物等方面具有很大的应用价值。
【附图说明】
[0014]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0015]图1为本发明的斑马鱼EDA基因及Crispr/Cas9靶位点。斑马鱼EDA基因共有8个外显子，通过在线设计筛选了在外显子4位点处的Crispr靶位点。
[0016]图2为本发明Crispr/Cas9诱导的斑马鱼万伽基因突变检测。对建立的Fl个体提取基因组，利用突变检测引物F-eda和R-eda进行扩增，并对PCR产物进行直接测序，检测是否有突变引入(A和B);另外对有突变引入的PCR产物进行TA克隆鉴定具体的突变类型(C和D)。其中:
A图为野生型斑马鱼EDA基因包含靶位点区域PCR产物测序结果，框内为靶位点；
B图为PCR产物出现双峰表示有插入或缺失突变的突变型斑马鱼检测结果；
C图为B图检测个体PCR产物T-A克隆测序结果，与野生型比较有碱基插入；
D靶位点序列比较，野生型个体靶位点序列(WT)与有15个碱基插入的突变型个体序列(MT +15bp)。
[0017]图3为本发明斑马鱼个体茜素红染色。对EDA处理的斑马鱼野生型及突变型个体进行鳞片染色鉴定鳞片发育情况，其中A为突变体斑马鱼，鳞片基本缺失；B为野生型斑马鱼，全身覆盖鳞片。
【具体实施方式】
[0018]实施例1 一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式，该模式是指包含EDA基因外显子4位点碱基插入的鳞片缺失斑马鱼。
[0019]该鳞片缺失斑马鱼模式的建立方法，包括以下步骤:
⑴利用Ensemble在线数据库，查找斑马鱼EDA基因序列no:ENSDARG00000074591并下载，在该序列查找 PAM(protospacer_adjacent motif )序列即 5’-GGNW響酬NNW'酬W'酬NNGG-3’，在EDA基因外显子找到的靶向作用序列为TTAGGCAAGAAAGGGCCCCC【TGG】，并设计并设计突变检测引物F-eda: ttgttttgcttctcatcagttg和突变检测引物R_eda:tttgctctgctgcttcactcο
[0020]⑵目标序列的野生型等位基因的测序验证:
随机选取5枚24hpf野生型斑马鱼胚胎，提取基因组DNA模板，然后用F-eda和R-eda进行PCR扩增，得到片段长度为358bp的PCR扩增产物I，该PCR扩增产物I以突变检测引物F-eda直接测序，测序效果良好，色谱图可读性好。结果表明目标基因组序列和数据库中的序列一致，无SNP应用重叠。
[0021]⑶构建sgRNA:
①载体和插入片段处理:
SgRNA构建载体用Bbsl酶切pT7-gRNA、切胶回收，得到sgRNA克隆骨架pT7_gRNA_Bbs1 IE位点作为插入片段，该