:12h(光：暗周期），温度为 23-27°C，培养2周后，取5mL于灭菌的20mL小瓶中，盖上橡皮塞，瓶盖边缘以石蜡封口，用 注射器将lmL的乙炔注入20mL小瓶中，于30°C反应12h，然后取40yL反应后气体，待测； 每个实验组设三个重复。
[0029] 所述的选择性液体无氮液体改良培养基，其配方为：MgS04 ? 7H20, 0. 08g;CaCl2 0? 04g;K2HP04 0? 04g;NaHC03 0? 04g;Fe-EDTA2ml;TA5 2ml;VB12 0? 32ml，蒸馏水 500ml， 灭菌海水1500ml，灭菌备用。
[0030] Trace metal mix A5 (TA5) :H3B03 2. 86g；MnCl24H20 1. 81g；ZnS047H200.222g； NaMo042H20 0.39g;CuS045H20 0.079g;Co(N03)26H20 49.4mg;Distilled water 1.0L，灭菌 备用。
[0031] 空白对照组：对照容器中加入乙炔气体但是不加入蓝藻，其他同实验组。
[0032] 所有样品用气相色谱检测乙烯的生成量。
[0033]取40yL反应后气体在上海精科仪电气相色谱仪器（GC-112A)上测定乙烯峰值， 标准气乙烯的浓度为138ppm。气相色谱仪的工作条件设置为：检测室温度200°C，柱箱温 度60°C，进样口 120°C。表头载气压力氮气为0? 95kg?cnT2,氢气为0? 8kg?cnT2,空气为 0. 6kg?cnT2。乙炔还原活性计算方法为：
[0034] ARA(nmolCH?H-1 ?Culture-1) =VstXCstXAsaXVtu/Vsa/Ast/H/22. 4
[0035] 其中，Vst是注入标准气的体积（ml)，Cst是标准气的浓度，Vtu是所用试管体积 (ml)，Asa是样品乙稀峰的面积（cm)，Vsa是样品注入体积（ml)，Ast是标准气峰面积（cm)， H是培养时间。
[0036] 检测结果表明本实施例分离纯化得到的纯菌株蓝藻SCSIOX可以利用N2作为氮 源，且具有较高的生物固氮活性，纯培养条件下平均固氮活性为40±6. 4nmolN2yg^Chla。
[0037] 实施例2蓝藻吲哚乙酸产生量的测定
[0038] 测定采用salkowski比色法测定分离物产生植物生长激素类物质的能力，标准曲 线采用纯的3-IAA(3-吲哚乙酸）制作。将蓝藻SCSIOX接种于100mL选择性液体无氮液体 改良培养基（配方同实施例1)内，持续光照强度为150yE/m2/s，光照周期为12:12h(光： 暗周期），温度为25-28 °C，培养120h，每隔24h取蓝藻培养液上清5mL在10000r/min离 心10min，取上清液加比色液在黑暗中静止0.5h，取出，立即用分光光度计测定，波长是 530nm(GlickmannandDessauxY.A)。
[0039] 样品中吲哚乙酸含量（yg/mg) = (AXV1V(WXV2)X1000
[0040] 式中：A--标准曲线上查得的IAA量（y g)
[0041] VI 样品提取液体积（mL)
[0042] W--样品重量（g)
[0043]V2--样品反应液体积（mL)
[0044] 本发明获得的蓝藻SCSIOX的IAA生成量约为12. 6±0. 90yg/mg。
[0045] 实施例3菌株的16SRNA和固氮基因扩增
[0046] 选择实施例1分离纯化得到的纯菌株蓝藻SCSIOX进行DNA提取和纯化，本实 施例DNA的提取与纯化，其操作方法参考东秀珠《常见细菌系统鉴定手册》P4(l9。采用固 氮细菌的lSF/16SR(Weisenburgetal.，1991，16SribosomalDNAamplificationfor phylogeneticstudy.，Journalofbacteriology, 1991，173(2):697-703)、ITS扩增 引物 23S30R/27Fl(Tatonetal.，2003,Cyanobacterialdiversityinnaturaland artificialmicrobialmatsofLakeFryxell(McMurdoDryValleys,Antarctica):a morphologicalandmolecularapproach.ApplEnvironMicrob, 2003,69:5157 - 5169)和 nifH基因通用引物PolF/PolR(参考Polyetal.，2001，ComparisonofnifHGenePools inSoilsandSoilMicroenvironmentswithContrastingProperties，Appliedand EnvironmentalMicrobiology, 2001，67 (5): 2255-2262)进行PCR扩增：PCR反应体系如 下：
[0047] 表1PCR反应体系
[0048]
[0049]PCR扩增程序如下：94°C预变性5min，94°C变性60sec，退火温度55°C复性30sec， 72°C延伸30sec，进行35个循环后72°C延伸lOmin。取5yL的扩增产物进行电泳，电压 为100V，琼脂糖凝胶为1 %，EB泡胶，用凝胶成像系统观察泳结果并拍照，若有目的条带 的出现，则将剩余的PCR产物直接交与Invitrogen生物技术有限公司用ABIPrism3730 XLDNA分析系统测序，并将测序分析得到的16SrDNA(其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所 示），ITS(其核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示）和固氮基因序列nifH(其核苷酸序列如 SEQIDNO. 3所示）通过GenBank中的BLAST与GenBank数据库中的序列进行比对，对其 种属鉴定进行初步的确定。建立系统发育树，系统发育树如图1、图2和图3所示，从系统 发育树可以看出与蓝藻SCSIOX的16SrDNA序列具有较近亲缘关系的序列均来自席藻 PhormidiumpersicinumSAG(EF654085)，其序列具有 93. 29% 的相似性；ITS基因与颤藻 OscillatorialescyanobacteriumGollwitzPoel的相似度最高（91%)，而固氮基因与可 培养的蓝藻固氮基因相似度最高的是LyngbyalagerheimiiUTEX1930(L15550)(96%)， 表明该株蓝藻SCSIOX为一株潜在新种，其属于席藻属，将其命名为席藻（Phoridiumsp.) SCSI0X，其于2015年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，地址：中国.武 汉?武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2015307。
[0050] 实施例4蓝藻培养液在红树种子萌发和生根过程促生作用的有效性试验
[0051] 将用选择性液体无氮液体改良培养基（配方同实施例1)培养2周后的席藻 (Phoridiumsp.)SCSI0X菌液的上清液，分别取出5mL加入含有红树林植物红海榄种子的 培养瓶中，其中对照组中仅仅只加入5mL的超纯水，各三个重复，然后将其放入培养箱中， 置于12h: 12h光：黑暗周期（200yE/m2/S)的光照强度，27°C培养，20天后，点数根的条数并 且测量根的长度，结果如表2所示。
[0052] 表2不同处理组的红海榄的根数和平均根长
[0053]
[0054]如表2所示，通过实验组和对照组的生长20天后的实验结果对比可以发现，实验 组的生根数和平均根长度均明显高于对照组，根数约是对照组的1. 7倍，最长根长平均根 长为3.lcm，是CK平均根长的2. 6倍，显示了席藻（Phoridiumsp.)SCSIOX对红树植物的 生根具有较好的促生效果（根数和根长），有望应用于红树林人工林等海洋生态系统的修 复和保护中的中。
【主权项】
1?席藻（Phoridiumsp.)SCSIO X，保藏编号：CCTCC NO :M 2015307。2. 权利要求1所述的席藻SCSIO X在制备促生固氮菌肥中的应用。3. 权利要求1所述的席藻SCSIO X在制备3-吲哚乙酸中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一株席藻SCSIO X及其应用。席藻(Phoridium sp.)SCSIO X，保藏编号：CCTCC NO：M 2015307，本发明从三亚湾退化的珊瑚礁生态系统中后出现的海草泰来藻(Thalassia hemperichii)根际分离筛选到的一株蓝藻新种-席藻(Phoridium sp.)SCSIO X，其具有良好的固氮活性和能够分泌产生3-吲哚乙酸，由此该海洋来源的席藻(Phoridium sp.)SCSIO X具有促进海洋湿地植株生长的巨大潜力，在海洋微生物肥力制备和海洋生态环境修复方面具较高的价值和广阔的应用前景。CCTCC NO：M 201530720150515
【IPC分类】C12P17/10, C12N1/20, C05F11/08, C12R1/01
【公开号】CN104962506
【申请号】CN201510467881
【发明人】凌娟, 张燕英, 董俊德, 杨清松, 张渊洲, 曾思泉, 江玉凤
【申请人】中国科学院南海海洋研究所
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年7月31日