改进的l-哌啶甲酸的分离方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及氨基酸的分离方法，具体涉及一种改进的L-哌啶甲酸的分离方法。
【背景技术】
[0002] L-哌啶甲酸又名L-高脯氨酸，是L-赖氨酸的衍生物，可作为医药中间体或生物尼 龙的生产前体。目前，国内外L-哌啶甲酸的生产多采用化学合成、光催化和生物催化方式。 生物催化过程温和，且产物专一，极具应用潜力。日本Mercian制药公司利用重组氨转移酶 LAT和同类的P5C还原酶将L-赖氨酸转化为L-哌啶酸。尽管如此，生物法获得的L-哌 啶甲酸的分离纯化，国内却尚无报道。
[0003] 专利《201510268919. 3》中公开了一种L-哌啶甲酸的分离方法，该专利中以碱性 溶液作为洗脱剂，在实验室小量实验时取得较高的纯度和收率；但是在放大实验中，其纯度 和收率有所下降，并且该专利中待分离液通过催化树脂的流速为0. 4~3mL/min，速度较慢， 在工业应用上存在一定的限制。
【发明内容】
[0004] 本发明的对上述L-哌啶甲酸的分离方法作了改进，提供一种改进的L-哌啶甲酸 的分离方法，采用酸性溶液进行洗脱，分离速度快，操作规模大，适合工业化应用。
[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的： 一种改进的L-哌啶甲酸的分离方法，将含L-哌啶甲酸的待分离液通过催化树脂，树脂 吸附饱和后，以酸性溶液作为洗脱剂对树脂进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液结晶、干燥得 到L-哌啶甲酸。
[0006] 含L-哌啶甲酸的待分离液通过催化树脂的流速为4~6mL/min。所述催化树脂为 D103-MTBE催化树脂或者WS-3催化树脂。
[0007] 催化树脂填充量为每克湿树脂吸附0. 1-0. 2gL-哌啶甲酸。
[0008] 所述酸溶液为0? 5-6% (v/v)的盐酸。
[0009] 含L-哌啶甲酸的待分离液通过催化树脂的流速优选为4mL/min。
[0010] 所述碱性溶液优选体积浓度为5%的盐酸。
[0011] 本发明所述的结晶和干燥的方法可以为本领域公知的各种方法，包括但不限于溶 剂蒸发、真空蒸发、低压真空干燥等。
[0012] 发明人在实验中发现D103-MTBE或者WS-3催化树脂能够高效分离L-哌啶甲酸， 并且待分离液中可以包含磷酸盐、L-赖氨酸等杂质。所述待分离液可以为微生物发酵生产 L-哌啶甲酸所得的混合液，也可以为其他合成途径所得。本发明提供的分离方法，适用于将 L-哌啶甲酸与某些理化特性与其相似的化合物例如磷酸盐、L-赖氨酸等分开，在树脂吸附 洗脱之前可以先对待分离溶液做适当去杂处理，比如过滤。
[0013] 由于本发明采用的是树脂吸附-洗脱来将L-哌啶甲酸与某些理化特性与其相似 的化合物分开，因此本发明对所述含L-哌啶甲酸的待分离液中的L-哌啶甲酸浓度没有特 别限定。一般地优选待分离液中含有的L-哌啶甲酸浓度为5-30g/L，pH值为7. 0-8.0。[0014] 发明人采用盐酸进行洗脱，洗脱流速快，缩短分离时间，并且经过盐酸洗脱后的树 脂再生更为简单。
[0015] 有益效果： 本发明提供的改进的L-哌啶甲酸的分离方法，采用酸性溶液进行洗脱，分离速度快， 并且方便后续树脂再生，适合工业化应用。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 述本发明，而不是限制本发明的范围。
[0017] L-哌啶甲酸溶液的制备 用发酵法制备：发酵底物为L-赖氨酸25 g/L，用50mM磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）调整发酵液口!1为7.0-8.0。培养方法：将重组^^〇^8121(0￡3)(他1?1 &〇￥1叩，了1叩 Wang, Zhen Wang, Jiao Feng, Kequan Chen, Yan Li, Ouyang Pingkai. Enhanced conversion of L-lysine to L-pipecolic acid using a recombinantEscherichia colicontaining lysine cyclodeaminase as whole-cell biocatalyst[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2015，http://dx.doi.Org/doi:10.1016/」.111〇1〇3吐.2015.05.001)接入种子培养基(胰蛋白胨1(^/1，酵母提取物58/1，他(：11(^/ L，用ImMNaOH溶液调整培养基pH为7.0-8.0)，在37 °C、200 rpm下培养18小时。20%的 接种量接入1L发酵罐中的发酵培养基中，400 rpm、37°C下培养48小时。放罐时，L-哌啶 甲酸的产量是10-20 g/L，然后将发酵液通过分子量50 KDa的超滤膜去掉菌体和大部分蛋 白质，得到的溶液作为以下实施例中进行L-哌啶甲酸分离的待分离液。
[0018]L-哌啶甲酸和L-赖氨酸的浓度是通过美国Alltech1500型高效液相色谱仪检 测。检测条件为屮代￥&11(：18色谱柱（250\4.6_，1.(1.5 11111);柱温：30°〇；流动相： 0. 4% (v/v)三氟乙酸水溶液；流速：0. 5ml/min;检测器：蒸发光散射检测器（ELSD);检测器 温度：120°C;载气：氮气(纯度99. 9%);载气流速：4L/min;进样体积：10yL。
[0019] L-哌啶甲酸纯度为L-哌啶甲酸在结晶、干燥所得固形物中的质量百分比。
[0020]L-哌啶甲酸收率为结晶、干燥后所得L-哌啶甲酸与初始待分离L-哌啶甲酸的质 量百分比。
[0021] 实施例1 本实施例对上述发酵法制备得到的含L-哌啶甲酸的发酵液作进一步分离提纯，含L-哌啶甲酸的发酵液中L-哌啶甲酸10g/L，L-赖氨酸2g/L，磷酸盐50mM。
[0022] 用100gD103-MTBE催化树脂填充固定床，平衡后将含L-哌啶甲酸的待分离液上 柱，流速4mL/min，1 L后吸附饱和，然后用0.5% (v/v)盐酸进行洗脱，洗脱液体积为1. 5 L，经HPLC测定洗脱液中L-哌啶甲酸浓度为7. 87g/L。结晶、干燥后L-哌啶甲酸产品纯度 99. 8%，收率 98. 4%。
[0023] 实施例2 本实施例对上述发酵法制备得到的含L-哌啶甲酸的发酵液作进一步分离提纯，含L-哌啶甲酸的发酵液中L-哌啶甲酸30g/L，L-赖氨酸5g/L，磷酸盐20mM。
[0024] 用1000gD103-MTBE催化树脂填充固定床，平衡后将含L-哌啶甲酸的待分离液上 柱，流速6mL/min，2750ml后吸附饱和，然后用6%(v/v)盐酸进行洗脱，洗脱液体积为2900 ml，经HPLC测定洗脱液中L-哌啶甲酸浓度为25. 45g/L，结晶、干燥后L-哌啶甲酸产品纯 度 99. 2%，收率 99. 6%。
[0025] 实施例3 本实施例用于说明本发明提供的分离L-哌啶甲酸的方法。
[0026] 本实施例对上述发酵法制备得到的含L-哌啶甲酸的发酵液作进一步分离提纯， 含L-哌啶甲酸的发酵液中L-哌啶甲酸5g/L，L-赖氨酸15g/L，磷酸盐100mM。
[0027] 用50 gD103_MTBE催化树脂填充固定床，平衡后将含L-哌啶甲酸的待分离液上 柱，流速4 ml/min，220 ml后吸附饱和，然后用5% (v/v)盐酸进行洗脱，洗脱液体积为400 ml，经HPLC测定洗脱液中L-哌啶甲酸浓度为3. 88g/L，结晶、干燥后L-哌啶甲酸产品纯度 99.5%，收率 99. 6%。
[0028] 实施例4 本实施例用于说明本发明提供的分离L-哌啶甲酸的方法与氨水洗脱方法的比较。
[0029] 分别用500gD103-MTBE催化树脂，填充固定床，平衡后将2L浓度为20g/L的 L-哌啶甲酸溶液上柱，流速5 mL/min，吸附饱和后，然后分别用0. 4% (v/v)氨水，或5% (v/ v)盐酸进行洗脱，结晶、干燥后测定L-哌啶甲酸的纯度和收率，结果见表1。
[0030] 表 1 :
【主权项】
1. 一种改进的L-哌啶甲酸的分离方法，其特征在于：将含L-哌啶甲酸的待分离液通 过催化树脂，树脂吸附饱和后，以酸溶液作为洗脱剂对树脂进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱 液结晶、干燥得到L-哌啶甲酸。2. 根据权利要求1所述的改进的L-哌啶甲酸的分离方法，其特征在于：含L-哌啶甲 酸的待分离液通过催化树脂的流速为4~6mL/min。3. 根据权利要求1所述的改进的L-哌啶甲酸的分离方法，其特征在于：所述催化树脂 为D103-MTBE催化树脂。4. 根据权利要求1所述的改进的L-哌啶甲酸的分离方法，其特征在于：所述催化树脂 为WS-3催化树脂。5. 根据权利要求1所述的改进的L-哌啶甲酸的分离方法，其特征在于：所述酸溶液为 0? 5-6% (v/v)的盐酸。6. 根据权利要求1所述的改进的L-哌啶甲酸的分离方法，其特征在于：所述催化树脂 填充量为每克湿树脂吸附〇. 1-0. 2 g L-哌啶甲酸。7. 根据权利要求1所述的改进的L-哌啶甲酸的分离方法，其特征在于：所述含L-哌 啶甲酸的待分离液中含有的L-哌啶甲酸浓度为5-30 g/L。8. 根据权利要求2所述的改进的L-哌啶甲酸的分离方法，其特征在于：含L-哌啶甲 酸的待分离液通过催化树脂的流速为4 mL/min。9. 根据权利要求5所述的改进的L-哌啶甲酸的分离方法，其特征在于：所述酸性溶液 为5% (v/v)的盐酸。
【专利摘要】本发明公开了一种改进的L-哌啶甲酸的分离方法，将含L-哌啶甲酸的待分离液通过催化树脂，树脂吸附饱和后，以酸性溶液作为洗脱剂对树脂进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液结晶、干燥得到L-哌啶甲酸。含L-哌啶甲酸的待分离液通过催化树脂的流速为4~6mL/min。所述催化树脂为D103-MTBE或者WS-3催化树脂。所述酸性溶液为0.5-6%（v/v）的盐酸。该方法简单、方便，以盐酸洗脱方便树脂的再生，节约生产成本。
【IPC分类】C07D211/60
【公开号】CN104974076
【申请号】CN201510475733
【发明人】陈可泉, 何珣, 孙阳, 欧阳平凯
【申请人】南京工业大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年8月6日