者对照组（组l)miR-486的表达量为0. 012846±0. 011028, IgA肾病 组(组2)为0. 272673±0. 527395, IgA肾病组miR-486的表达量显著高于健康者对照组，p < 0· 001。
[0156] 图5, IgA肾病组（组l)miR-25的表达量为0. 239375±0. 3035597,而非IgA型肾 病的肾病患者对照组(组2)为0. 064979±0. 051222, IgA肾病组miR-25的表达量显著高于 非IgA型肾病的肾病患者对照组，p < 0. 001。
[0157] 图6, IgA肾病组(组l)miR-144的表达量为0. 124129±0. 246618,而非IgA型肾 病的肾病患者对照组(组2)为0. 029361 ±0. 062052, IgA肾病组miR-144的表达量显著高 于非IgA型肾病的肾病患者对照组，p=0. 003。
[0158] 图7, IgA肾病组(组l)miR-486的表达量为0. 272673±0. 527395,而非IgA型肾 病的肾病患者对照组(组2)为0. 050362±0. 058641，IgA肾病组miR-486的表达量显著高 于非IgA型肾病的肾病患者对照组，p < 0. 001。
[0159] 如图2-7可知，IgA肾病组miR-25、miR-144以及miR-486三个指标的表达量均显 著高于健康者对照组和非IgA型肾病的肾病患者对照组，其升高与IgA肾病预警有很强关 联，可以作为IgA肾病特异性预警指标。
[0160] 7) miRNA表达量的ROC曲线分析：
[0161] 利用SPSS软件，将miRNA-25、miRNA-144以及miRNA-486三个指标联合做IgA肾 病预警价值的ROC曲线分析，结果如图8和下面表1所示。
[0162] 表1miRNA表达量的ROC曲线分析统计表
[0163]
[0164]
[0165] 从图8和表1可知：
[0166] 当miRNA-25的表达量高于0.058 (临界值）时，此时预警IgA肾病的敏感性为 81. 3%，特异性为100% ;
[0167] 和/或，miRNA-144的表达量高于0. 007 (临界值)时，此时预警IgA肾病的敏感性 为80%，特异性为100%;
[0168] 和/或，miRNA-486的表达量高于0. 025 (临界值)时，此时预警IgA肾病的敏感性 为93. 8%，特异性为90. 9%。
[0169] AUC (曲线下面积）可以评价预警的准确性，即AUC越大，预警正确的准确性越高。 ROC曲线下面积值在I. 0和0. 5之间，当面积值在0. 9以上时有很好的准确性。本发明的 ROC曲线下面积值皆在0. 9以上，表明本发明具有很好的准确性，可信度非常高。
[0170] 95%CI指AUC的95%置信区间，即AUC落在这一范围内的可能性为95%，可知本发 明的准确性非常可靠。
[0171] P值就是用于判断错误的概率，一般认为P值小于0. 05,即为小概率事件，它在 一次试验中几乎不可能发生，就可以认为判断是正确的。本发明的P值均小于0. 0001，即 为本发明预警该患者为IgA型肾病，而该患者实际上不是(犯错误）IgA型肾病的机率小于 0.01%，几乎不可能发生，说明本发明判断的准确性非常高。
[0172] 本发明还将上述三个miRNA :miRNA-25、miRNA-144以及miRNA-486表达量的联合 指标进行ROC曲线分析，结果如图9和下面表2所示。
[0173] 表2miRNA表达量的联合指标的ROC曲线分析统计表
[0174]
[0175] 从图9和表2可知：
[0176] 当三个miRNA :miRNA-25、miRNA-144以及miRNA-486表达量的三个联合指标一起 检测时，当上述三个联合指标中有一个高于它们各自的临界值，即可预警IgA肾病，而且通 过联合可进一步提高预警的敏感性至89. 9%，而预警的特异性为100%。因此，本发明可以提 供一种非常准确的预警IgA肾病的检测方法。
[0177] 从图2-4中可知，用荧光定量PCR检测尿沉渣miRNA时，IgA肾病患者miRNA-25、 miRNA-144和miRNA-486的表达量显著高于健康者对照组，p < 0. 001，差异具有显著的统 计学意义。
[0178] 从图5-7中可知，用荧光定量PCR检测尿沉渣miRNA时，IgA肾病患者miRNA-25、 miRNA-144和miRNA-486的表达量显著高于非IgA型肾病的肾病患者对照组(膜性肾病，系 膜增殖性肾炎，微小病变肾病，局灶节段性肾小球硬化，膜增生性肾小球肾炎)，P < 〇. 001， 差异具有显著的统计学意义。
[0179] 图2-7表明，尿沉渣中IgA肾病组miRNA-25、miRNA-144和miRNA-486的表达量不 仅显著高于健康者对照组，而且显著高于非IgA型肾病的肾病患者对照组，是IgA肾病特异 性的 miRNAs。
[0180] 为了分别找到三个指标预警IgA肾病的临界值(或阈值)，及其对应的敏感性和特 异性，将三个miRNAs的表达量带入ROC曲线分析，可得图8和表1。从图8和表1中可知， 上述三个指标分别单独预警IgA肾病时，均有较好的敏感性和特异性，其中miRNA-25的敏 感性为81. 3%，特异性为100% ;miRNA-144的敏感性为80%，特异性为100% ;miRNA-486的敏 感性为93. 8%，特异性为90. 9%。且预警的准确性较高（AUC > 0. 9)。
[0181] 由于发现miRNA-25和miRNA-144预警IgA肾病的特异性非常好（为100%)，而敏 感性相对较差，为了提高本发明预警IgA肾病的敏感性，提高预警效率，本发明的遂进行了 并联实验(联合检测)，即当上述三个指标中有一个高于它们各自的临界值，即可预警IgA肾 病。从图9和表2可知，通过联合检测三个指标，可将预警的敏感性进一步提高至89. 9%， 而预警的特异性仍为1〇〇%。因此，本发明可以提供一种非常准确的预警IgA肾病的检测方 法。
[0182] 实施例2
[0183] 为进一步检验本发明的实用性和准确性，发明人随机抽取新入院未行肾组织活检 (即将要做)的肾病患者10人，及性别、年龄匹配的健康者10人，随机编号，参照实施例1的 技术方案进行检测，预警出IgA型肾病患者6人。待起一周后肾组织活检结果出来，IgA型肾 病患者也为6人，与本发明预警的结果完全一致，而其它4名非IgA型肾病的肾病患者(膜 性肾病2人，微小病变肾病1人，局灶节段性肾小球硬化1人)与10名健康者的上述miRNAs 表达量差异无显著统计学意义。由此，进一步表明本发明的实用性强，准确性高。
[0184] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于IgA肾病检测方法的建立，其特征在于，包括： S10、采集IgA型肾病患者、非IgA型肾病的肾病患者以及健康者的尿液； S20、检测尿液中miRNA的表达量； S30、利用2_A 相对定量法比较所述miRNA的表达量； S40、对所述miRNA的表达量进行ROC曲线分析。2. 根据权利要求1所述的用于IgA肾病检测方法的建立，其特征在于，所述miRNA为 miRNA-25、miRNA-144 以及 miRNA-486 中的至少一种。3. 根据权利要求2所述的用于IgA肾病检测方法的建立，其特征在于，检测所述 miRNA-25、miRNA-144以及miRNA-486的表达量是通过选自荧光定量PCR、Taqman探针以及 LightCycle探针中的至少一种方法进行的。4. 根据权利要求3所述的用于IgA肾病检测方法的建立，其特征在于，所述荧光定量 PCR 为 SYBR Green 荧光定量 PCR。5. 根据权利要求4所述的用于IgA肾病检测方法的建立，其特征在于， MiRNA-25 的引物为：CAUUGCACUU⑶CUCGGUCUGA ; 和 / 或，MiRNA-144 的引物为：UACAGUAUAGAUGAUGUACU ; 和 / 或，MiRNA-486 的引物为：UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG。6. 根据权利要求5所述的用于IgA肾病检测方法的建立，其特征在于，还包括管家基因 的引物为：AAAGCAGGCUUUAAAGGAACCU。7. 根据权利要求6所述的用于IgA肾病检测方法的建立，其特征在于，所述miRNA-25 的临界值为〇. 058 ; 和/或，所述miRNA-144的临界值为0. 007 ; 和/或，所述miRNA-486的临界值为0. 025。8. -种用于IgA肾病检测的方法，其特征在于，所述方法是根据权利要求1~7中任一 项所述的方法建立的方法，包括以下步骤： 米集尿液； 检测尿液中miRNA-25、miRNA-144以及miRNA-486中至少一个的表达量； 判断miRNA-25、miRNA-144或miRNA-486的表达量是否高于其各自的所述临界值。9. 根据权利要求8所述的用于IgA肾病检测的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR为 SYBR Green 荧光定量 PCR。10. -种用于IgA肾病检测的系统，其特征在于，所述用于IgA肾病检测的系统利用权 利要求8或9所述的用于IgA肾病检测的方法进行检测，所述系统包括： 尿液采集装置，以采集尿液； miRNA检测装置，以检测尿液中miRNA的表达量。
【专利摘要】本发明公开了一种用于IgA肾病检测的系统、方法及方法的建立，其中，所述建立方法包括：S10、采集IgA型肾病患者、非IgA型肾病的肾病患者以及健康者的尿液；S20、检测尿液中miRNA的表达量；S30、利用2-ΔΔct相对定量法比较所述miRNA的表达量；S40、对所述miRNA的表达量进行ROC曲线分析。本发明的检测样本是尿液，而不是肾组织，最明显的优势就是具有无创伤检测的特点，由于检测时无明显禁忌症，可以适用于所有患者的检测。
【IPC分类】C12M1/34, C12Q1/68
【公开号】CN104975075
【申请号】CN201410143612
【发明人】蔡广研, 陈香美, 段智余
【申请人】中国人民解放军总医院
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年4月10日