干细胞培养的制作方法
【专利说明】干细胞培养
[0001] 本申请是申请日为2009年12月3日、申请号为200980156028. 1且发明名称为 "干细胞培养"的中国发明专利申请的分案申请。
[0002] 对相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求于2008年12月3日提交的美国临时申请号61/200, 808的优先权，将 该申请的全部内容结合入本文中用于所有目的。
[0004] 发明背景
[0005] 胚胎干细胞（ESCs)是多能细胞，其具有无限地自我更新和分化成身体的所有细 胞类型的能力（Thomson，J. A?等，Science (科学）282(5391) :1145-1147(1998) ;Thomson， J.A. &0dorico，J. S. ,Trends Biotechnol(生物技术趋势）18(2) :53-57(2000))。此 能力提供了希望，即有一天ESC将被用来替换损失的和损伤的细胞，并且提供常规药物所 不能达到的治疗。然而，为了充分实现hESC的临床潜力，需要建立化学成分限定的、无饲 养细胞-和动物产品、稳定的培养条件。尽管已经报道了几种化学成分限定培养基（Yao， S?等?，Proc Natl Acad Sci USA(美国国家科学院院刊）103 (18) :6907-6912(2006); Lu, J?等?，Proc Natl AcadSci USA(美国国家科学院院刊）103(15) :5688-5693(2006); Ludwig，T. E?等?，Nat BiotechnoK 自然生物技术）24(2) :185-187 (2006))，但由于细胞 在它们中的性能欠佳，它们大多仍然是不令人满意的。尤其是在这些条件下，当细胞通过胰 蛋白酶传代为单一细胞时，它们经历广泛的细胞死亡。许多介导hESC自我更新的信号传 导途径是已知的，包括 FGF，TGF-P，Wnt,等（James, D?等?，Development (发育）132(6): 1273-1282(2005) ;Xu，R. H?等.，Nat Methods(自然方法）2(3) :185-190(2005) ;Beattie， G.M?等?，Stem Cells(干细胞）23(4) :489-495(2005) ;Greber，B.，Lehrach，H.，&Adjaye， J. ,Stem Cells(干细胞）25(2) :455-464(2007) ;Sato，N?等?，NatMed(自然-医学）10(1): 55-63 (2004))。然而，它们中没有一个似乎能在此过程中充当存活因子，其分子机制是复杂 的。
[0006] 发明简述
[0007] 本发明提供了具有下式的化合物：
[0008]
[0009] 其中环A是取代的或未被取代的环烷基，取代或未被取代的杂环烷基，取代或未 被取代的芳基，或取代或未被取代的杂芳基；
[0010] 环B是取代或未被取代的杂环烷基，或取代或未被取代的杂芳基；
[0011] L1 是-C (0)-NR 2_ 或-C (0)-NR2-;
[0012] L2是键，取代或未被取代的亚烷基或取代或未被取代的杂亚烷基；并且
[0013] R1和R2独立地为氢，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，取代或未 被取代的环烷基，取代或未被取代的杂环烷基，取代或未被取代的芳基，或取代或未被取代 的杂芳基。
[0014] 在一些实施方案中，环A是取代或未被取代的芳基。
[0015] 在一些实施方案中，环A是取代或未被取代的苯基。
[0016] 在一些实施方案中，环B是取代或未被取代的杂环烷基，或取代或未被取代的杂 芳基。
[0017] 在一些实施方案中，环B是取代或未被取代的杂芳基。
[0018] 在一些实施方案中，环B是取代或未被取代的吡唑基，取代或未被取代的呋喃基， 取代或未被取代的咪唑基，取代或未被取代的异噁唑基，取代或未被取代的噁二唑基，取代 或未被取代的噁唑基，取代或未被取代的吡咯基，取代或未被取代的吡啶基，取代或未被取 代的嘧啶基，取代或未被取代的哒嗪基，取代或未被取代的噻唑基，取代或未被取代的三唑 基，取代或未被取代的噻吩基，取代或未被取代的二氢噻吩-吡唑基，取代或未被取代的硫 茚基，取代或未被取代的咔唑基，取代或未被取代的苯并噻吩基，取代或未被取代的苯并 呋喃基，取代或未被取代的吲哚基，取代或未被取代的喹啉基，取代或未被取代的苯并三唑 基，取代或未被取代的苯并噻唑基，取代或未被取代的苯并噁唑基，取代或未被取代的苯并 咪唑基，取代或未被取代的异喹啉基，取代或未被取代的异吲哚基，取代或未被取代的吖啶 基，取代或未被取代的苯并异噻唑基（benzoisazolyl)，或取代或未被取代的二甲基乙内酰 脲。
[0019] 在一些实施方案中，L2是取代或未被取代的C ^C1。烷基。
[0020] 在一些实施方案中，L2是未被取代的C ^C1。烷基。
[0021 ] 在一些实施方案中，L2是亚甲基。
[0022] 在一些实施方案中，环A是取代或未被取代的芳基；环B是取代或未被取代的杂芳 基；R 1是氢；并且L 2是未被取代的C ^C1。烷基。
[0023] 在一些实施方案中，R2是氢。
[0024] 在一些实施方案中，R1是氢或是未被取代的C^C1。烷基。
[0025] 在一些实施方案中，R1是氢。
[0026] 在一些实施方案中，所述化合物具有下式：
[0028]其中，y是0至3的整数；z是0至5的整数；X是-N =，-CH =或-CR5= ;R3, R4和 R5独立地是 CN，S (0) nR6, NR7R8, C (0) R9, NRiq-C (0) R11，NR12-C (0) -OR13, -C (0) NR14R15, -NR16S (0) 2R17, -OR18, -S (0) 2NR19,取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，取代或未被取代 的环烷基，取代或未被取代的杂环烷基，取代或未被取代的芳基，或取代或未被取代的杂芳 基，其中n是0至2的整数，其中如果z大于1，两个R 3结构部分任选地连接在一起形成取 代或未被取代的环烷基，取代或未被取代的杂环烷基，取代或未被取代的芳基，或取代或未 被取代的杂芳基；和 R6, R7, R8, R9, R10，R11，R12, R13, R14, R15, R16, R17, Ris和 R19独立地是氢，取 代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，未被取代的环烷基，取代或未被取代的杂 环烷基，取代或未被取代的芳基，或取代或未被取代的杂芳基。
[0029] 在一些实施方案中，L2是取代或未被取代的C ^C1。烷基。
[0030] 在一些实施方案中，L2是未被取代的C i-Ci。烷基。
[0031 ] 在一些实施方案中，L2是亚甲基。
[0032] 在一些实施方案中，X是-N=或-CH=。
[0033] 在一些实施方案中，z是2且邻近顶点处的两个R3结构部分连接在一起形成取代 或未被取代的杂环烷基。
[0034] 在一些实施方案中，z是1。
[0035] 在一些实施方案中，y是0或1。
[0036] 在一些实施方案中，R3是-OR 18，且Ris是氢或未被取代的C i-Ci。烷基。
[0037] 在一些实施方案中，L2是亚甲基；X是-N =或-CH = ;R 1是氢；并且y和z是0。
[0038] 在一些实施方案中，所述化合物具有下式：
[0039]
[0040]
[0043] 其中
[0044] 环D是取代或未被取代的芳基或取代或未被取代的杂芳基；
[0045] L3是-C(0)NH-或-S(0) 2NH-;
[0046] R2°是取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，取代或未被取代的环烷 基，取代或未被取代的杂环烷基，取代或未被取代的芳基，或取代或未被取代的杂芳基；
[0047] R21是-NR22R23或-OR24;
[0048] R22和R23独立地是氢，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，取代或 未被取代的环烷基，取代或未被取代的杂环烷基，取代或未被取代的芳基，取代或未被取代 的杂芳基，或连接在一起形成取代或未被取代的杂环烷基或取代或未被取代的杂芳基；
[0049] R24是取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，取代或未被取代的环烷 基，取代或未被取代的杂环烷基，取代或未被取代的芳基，取代或未被取代的杂芳基，或连 接在一起形成取代或未被取代的环烷基或取代或未被取代的杂环烷基。
[0050] 在一些实施方案中，环D是取代或未被取代的苯基。
[0051] 在一些实施方案中，R2°是取代或未被取代的烷基或取代或未被取代的环烷基。
[0052] 在一些实施方案中，R2°是取代或未被取代的C 烷基或取代或未被取代的3-7 元环烷基。
[0053] 在一些实施方案中，R2°是取代或未被取代的C Lc5烷基或取代或未被取代的3-6 元环烷基。
[0054] 在一些实施方案中，R2°是未被取代的CLc5烷基或未被取代的3-6元环烷基。
[0055] 在一些实施方案中，R22是氢；和R23是取代或未被取代的环烷基，取代或未被取代 的杂环烷基，取代或未被取代的芳基，或取代或未被取代的杂芳基。
[0056] 在一些实施方案中，R22是氢；和R23是取代或未被取代的取代或未被取代的芳基。
[0057] 在一些实施方案中，R22和R23连接在一起形成取代或未被取代的杂环烷基，或取代 或未被取代的杂芳基。
[0058] 在一些实施方案中，R22和R23连接在一起形成取代或未被取代的吡咯基，取代或未 被取代的异二氢氮杂茚基，取代或未被取代的哌啶基，或取代或未被取代的四氢喹啉基。
[0059] 在一些实施方案中，化合物具有下式：
[0060]
[0061] 其中w是0至1的整数；q是0至7的整数；R25, R26, R27和R 28独立地 为-CN，-NR29R30, -C (0) R31，-NR32-C (0) R33, -NR34-C (0) -OR35, -C (0) NR36R37, -NR38S (0) 2R39, -OR40 ，-S (0) 2NR41，-S (0) VR42,取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，取代或未被取代 的环烷基，取代或未被取代的杂环烷基，取代或未被取代的芳基，或取代或未被取代的杂芳 基,其中 V 是 0 至 2 的整数；R29, R3°，R31，R32, R33, R34, R35, R36, R37, R38, R39, R4°，R41 和 R42独立地 为氢，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，未被取代的环烷基，取代或未被 取代的杂环烷基，取代或未被取代的芳基或取代或未被取代的杂芳基，其中R 25和R26,或R26 和R27,可以连接形成取代或未被取代的环烷基，取代或未被取代的杂环烷基，取代或未被取 代的芳基，或取代或未被取代的杂芳基。
[0062] 在一些实施方案中，R28为-OR 4°，其中R4°为氢或未被取代的C i-Ci。烷基。
[0063] 在一些实施方案中，R4°为氢或未被取代的C i-C5烷基。
[0064] 在一些实施方案中，所述化合物具有下式：
[0065]
<3:
[0066] 在一些实施方案中，R2°为未被取代的C^C1。烷基。
[0067] 在一些实施方案中，R28为-OR 4°，其中R4°为氢或未被取代的C i-Ci。烷基，或被取代 或未被取代的C3-C6环烷基取代的C i-Ci。烷基。
[0068] 在一些实施方案中，q是1。
[0069] 在一些实施方案中，所述化合物具有下式：
[0070]
[0074] 本发明还提供了体外稳定分离的细胞的方法。在一些实施方案中，该方法包括使 动物细胞与足量的式I或III化合物接触以稳定所述细胞。
[0075] 在一些实施方案中，该方法进一步包括在所述化合物的存在下改变所述细胞的条 件或环境，其中在缺少所述化合物的条件下所述改变步骤会导致细胞的细胞编程变化。在 一些实施方案中，所述改变步骤包括使所述细胞解冻和使所述细胞与其他细胞解离的至少 一个。
[0076] 在一些实施方案中，所述细胞是贴壁的。在一些实施方案中，所述细胞处于混悬液 中。
[0077] 在一些实施方案中，该方法还包括确定所述细胞的表型。
[0078] 在一些实施方案中，该方法包括从动物中分离所述细胞。在一些实施方案中，所述 动物是人。在一些实施方案中，所述动物是非人动物。
[0079] 在一些实施方案中，所述化合物是式I化合物。在一些实施方案中，所述化合物是 式III化合物。
[0080] 本发明还提供了改善动物的病症的方法。在一些实施方案中，该方法包括施用足 量的式I或III化合物于需要所述方法的动物以改善所述病症。
[0081] 在一些实施方案中，所述病症选自由组织损伤、卒中和癌症组成的组。在一些实施 方案中，所述组织选自由胰腺、肝、肠、肺和肾组成的组。
[0082] 在一些实施方案中，所述病症包括移植组织或器官的至少部分排斥，在一些实施 方案中，所述移植包括骨髓、脐带血、纯化的造血干细胞或祖细胞、心脏细胞、神经细胞、胰 腺@细胞或肝细胞的移植。
[0083] 在一些实施方案中，所述化合物是式I化合物。在一些实施方案中，所述化合物是 式III化合物。
[0084] 本发明还提供了维持细胞存活的方法。在一些实施方案中，该方法包括产生分离 的干细胞、祖细胞或分化细胞；和诱导所述分离的细胞中E-钙黏着蛋白的稳定，从而维持 细胞存活。
[0085] 在一些实施方案中，所述诱导步骤包括使所述分离的干细胞与足以提高分离的干 细胞的存活率的量的式I化合物接触，与缺少所述化合物的情况相比，所述式I化合物的量 将分离的干细胞的存活率提高至少2倍。
[0086] 在一些实施方案中，所述诱导步骤包括在表面上培养所述分离的干细胞，其中包 含E-钙黏着蛋白胞外结构域的分子栓系（tether)在所述表面上。
[0087] 本发明还提供了分离的细胞群，其包含足以提高分离的细胞的存活率的量的稳定 所述细胞中的E-钙黏着蛋白的分子，与缺少所述分子的情况相比，所述分子的量将分离的 细胞的存活率提高至少2倍。
[0088] 在一些实施方案中，所述分子包含式I化合物。
[0089] 在一些实施方案中，所述细胞选自由干细胞、诱导的干细胞、多能干细胞、祖细胞、 分化细胞、P细胞和成纤维细胞组成的组。
[0090] 本发明还提供了分离的细胞群，其包含足以提高分离的细胞的存活率的量的式I 或III化合物，与缺少所述化合物的情况相比，所述式I或III化合物的量将分离的细胞的 存活率提高至少2倍。
[0091] 在一些实施方案中，所述细胞选自由干细胞、诱导的干细胞、多能干细胞、祖细胞、 分化细胞、P细胞和成纤维细胞组成的组。
[0092] 本发明还提供了维持干细胞存活的方法。在一些实施方案中，该方法包括产生分 离的细胞；和激活所述分离的细胞中的蛋白激酶C(PKC)，从而维持细胞存活。
[0093] 在一些实施方案中，所述激活步骤包括使足量的佛波醇12-肉豆蘧酸酯13-乙酸 酯（PM)与所述分离的细胞接触，从而与缺少PM时的存活率相比提高所述细胞的存活率。
[0094] 本发明还提供了分离的干细胞群，其包含足以提高分离的干细胞的存活率的量的 蛋白激酶C激活物，与缺少所述PKC激活物的情况相比，所述蛋白激酶C激活物将分离的干 细胞的存活率提高至少2倍。
[0095] 定义
[0096] 本文使用的缩写具有化学和生物学领域中它们的常规含义。
[0097] 术语"稳定细胞"是指基本上减少或消除细胞对该细胞所暴露的条件或环境中的 变化的反应。在此上下文中的"基本上减少"的含义是该反应比在缺少稳定成分（例如，本 发明的化合物）的条件下发生的反应少至少50%。
[0098]术语"改变细胞的条件或环境"是指改变温度，培养基（例如，碳源，盐浓度，生长 因子），使细胞解离成分离的细胞，使细胞解冻，或否则改变细胞的直接环境的因素。如本 文所讨论的，改变细胞的条件或环境经常改变细胞的表型或细胞编程。例如，干细胞，以及 一些其他细胞，当分离时将响应于某些变化诸如分离、解冻等而分化和/或死亡。因此，改 变条件可以减少或消除细胞活力，而如本文所述的稳定的细胞在相同的条件变化下活力基 本上不减小。细胞编程的变化也可以作为细胞对特定刺激的反应来监测，所述反应对某种 细胞类型是特征性的和/或通过一个或一组特征性基因或基因产物的表达来监测。作为非 限制性实例，已知人多能干细胞表达下面列表中的至少一些标志物和任选地全部标志物： SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81，TRA-2-49/6E，ALP，Sox2, E-钙黏着蛋白（E-钙黏着 蛋白），UTF-l，0ct4，Rexl和Nanog。当干细胞丧失多能性或否则分化时这样的表达可能会 改变。稳定的人多能干细胞在条件变化后将保持其特征性表达谱。
[0099] "分离的"细胞已经与生物体的其他细胞基本上分离或从其中纯化出来。
[0100] 术语使细胞"解离（dissociating) "是指将细胞与其他细胞或与表面（例如，培养 板表面）分离的过程。例如，细胞可以通过机械或酶学方法从动物或组织中解离。备选地， 体外聚集的细胞可以彼此解离。还在另一种备选方法中，贴壁细胞从培养板或其他表面解 离。因此解离可以涉及破坏细胞与细胞外基质（ECM)和基底（例如，培养表面）之间的相 互作用或破坏细胞之间的ECM。
[0101] "确定细胞的表型"是指评价细胞的质量或特性。表型可以包括，例如，细胞类 型-特征性基因表达，或基因表达谱，细胞对刺激或环境的反应，分化或脱分化的能力，具 有特殊的形态学等。
[0102] 当化学取代基由它们的常规化学结构式指定，从左向右书写时，它们同样包涵从 右向左书写结构所得到的化学上相同的取代基，例如，-CH 2O-等同于-0CH2-。
[0103] 术语"烷基"本身或作为另一取代基的一部分，除非另外指明，是指直链（即，无支 链）或支链，或其组合，其可以是完全饱和的，单-或多不饱和的，并且可以包括二价-和多 价基团，具有标注的碳原子数（即，C 1-C1。是指1-10个碳）。饱和烃基的实例包括，但不限 于，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、（环己基）甲 基、环丙基甲基的基团，例如，正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和异构体等。不饱和 的烷基是具有一个或多个双键或三键的基团。不饱和烷基的实例包括，但不限于，乙烯基， 2_丙烯基，丁烯基，2-异戊烯基，2- ( 丁二烯基），2,4-戊二烯