A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种粗多糖纯化工艺，具体涉及的是A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化 工艺。
【背景技术】
[0002] 流行性脑脊髓膜炎（简称流脑，下同）是一种由奈瑟氏脑膜炎球菌 (Neisseriameningitidis)引起的急性呼吸道传染病。一百多年来，一直在世界各地流行或 散在发生，感染病原菌后可引起败血症、脑膜炎。易感人群主要为儿童，以暴发型病死率最 高，可达40%~60%。当今世界各大洲发病率在1/10万~10/10万，总病死率在5%~15%， 高达20%的脑膜炎患者会有神经系统后遗症，包括智力受损和耳聋等。根据荚膜多糖型别 进行血清学分类可分13个血清型，其中A群、B群、C群约占流行菌群的90%。A群脑膜炎球 菌是较大流行的主要致病血清群，特别是在所谓的非洲"流脑流行带"，每隔7-14年就会出 现一次较大流行。
[0003] 我国于1938年、1949年、1959年、1967年和1977年曾发生过5次全国性流脑流 行；其中以1967年春季流行最为严重，发病率高达403/10万，病死率为5. 49%。我国过去 90%以上的病例是A群病菌致病，现在B群或C群病菌有时亦引起流脑暴发。2003年开始， C群流脑的发病率明显上升。目前A群和C群共占所有血清群的50%以上，且C群仍有进一 步增高的趋势。因此，目前我国预防流脑工作的重点是以预防A群和C群为主。
[0004] 目前预防流行性脑脊髓膜炎最有效的方法是接种疫苗。研究表明，A群C群脑膜 炎球菌的荚膜多糖具有良好的免疫原性，提取荚膜多糖可直接制备成疫苗，经注射免疫后 的人群可以获得免疫保护。我国从2007年起已将流脑疫苗纳入国家免疫规划，在全国范围 对适龄儿童普及接种。目前纳入国家免疫计划的流脑多糖疫苗包括A群脑膜炎球菌多糖疫 苗，A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗。
[0005] 目前，A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗的生产工艺均是从脑膜炎球菌荚膜中提取出 粗多糖，粗多糖经过纯化后获得精糖，精糖经过活化和衍生制成多糖-ADH衍生物，进而有 效制成A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗。
[0006] 在粗多糖经过纯化后获得精糖的生产过程中，由于粗多糖中含有多种杂质，如：苯 酚、核酸及蛋白质等物质，导致现有技术中粗多糖的纯化的效率不高，精糖的获取率较低。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于解决现有技术中粗多糖的纯化的效率不高，精糖的获取率较低 的问题，提供一种解决上述问题的A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺。
[0008] 为解决上述缺点，本发明的技术方案如下： A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺，包括以下步骤： (1)将粗制多糖溶解于8%~12%饱和中性醋酸钠溶液中，然后按体积比为1:0. 8~1. 2 的比例加入冷酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，并抽提1~3次使上清液澄清； (2) 收集上清液，用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸； (3) 在超滤后的多糖溶液中加入NaCl溶液，直至NaCl终浓度为0. 2~0. 4mol/L，然后 加入乙醇至乙醇体积终浓度为70~78%，充分混匀后2~8°C静置过夜； (4) 离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次，干燥后即为精糖。
[0009] 进一步，所述步骤（1)中饱和中性醋酸钠溶液的浓度为10% ;冷酚与多糖和饱和中 性醋酸钠溶液的混合液比例为1: 1。
[0010] 优选地，所述步骤（2)中超滤膜包过滤时所用超滤液由浓度为0. 05mol/L的氯化 钠溶液组成。
[0011] 作为最优地设置方式，所述步骤（3)中NaCl终浓度为0. 3mol/L，乙醇体积终浓度 为 75%。
[0012] 更进一步地，所述步骤（3)中NaCl溶液加入多糖溶液时的浓度为4mol/L，所述乙 醇加入使的浓度为95%。
[0013] 为了使提取出的精糖达到更好地质量，所述步骤（4)中的干燥采用冷冻干燥方法。
[0014] 本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果： 本发明的方法优化了各化学物质加入反应时的比例和浓度，有效提高了精糖的纯度和 回收率，本发明使精糖的纯度达到95%以上。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
[0016] 实施例1 A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺，包括以下步骤： (1) 将粗制多糖溶解于10%饱和中性醋酸钠溶液中，然后按体积比为1:1的比例加入冷 酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，并抽提1~3次使上清液澄清； (2) 收集上清液，用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸；本步骤中超滤膜包过滤时所 用超滤液由浓度为〇. 〇5mol/L的氯化钠溶液组成； (3) 在超滤后的多糖溶液中加入4mol/L的NaCl溶液，直至NaCl终浓度为0. 3mol/L， 然后加入95%乙醇至乙醇体积终浓度为75%，充分混匀后2~8°C静置过夜，沉淀； (4) 离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次，干燥后即为精糖。
[0017] 实施例2 本实施例与实施例1的区别仅仅在于，本实施例中各化学物质加入反应时的比例和浓 度不同，具体设置如下： 步骤（1)中将粗制多糖溶解于8%饱和中性醋酸钠溶液中，然后按体积比为1:1. 2的比 例加入冷酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，并抽提1~3次使上清液澄清； 步骤（3)中NaCl溶液浓度为2mol/L的，直至NaCl终浓度为0. 4mol/L，然后加入95% 乙醇至乙醇体积终浓度为70%，充分混匀后2~8°C静置过夜。
[0018] 实施例3 本实施例与实施例1的区别仅仅在于，本实施例中各化学物质加入反应时的比例和浓 度不同，具体设置如下： 步骤（1)中将粗制多糖溶解于15%饱和中性醋酸钠溶液中，然后按体积比为1:2的比 例加入冷酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，并抽提1~3次使上清液澄清； 步骤（3)中NaCl溶液浓度为3mol/L的，直至NaCl终浓度为0· 5mol/L，然后加入95% 乙醇至乙醇体积终浓度为60%，充分混匀后2~8°C静置过夜。
[0019] 对实施例1~3取样，检测精糖的纯度和回收率，检测结果如表1所示。
[0020] 表 1
通过上表可以看出，采用本发明浓度的各试剂进行提纯后，该提纯的精糖的纯度可达 95%以上，且回收率也更高。
[0021] 上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明保护范围的限制，但凡采用 本发明的设计原理，以及在此基础上进行非创造性劳动而作出的变化，均应属于本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将粗制多糖溶解于8%~12%饱和中性醋酸钠溶液中，然后按体积比为1:0. 8~1. 2 的比例加入冷酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，并抽提1~3次使上清液澄清； (2) 收集上清液，用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸； (3) 在超滤后的多糖溶液中加入NaCl溶液，直至NaCl终浓度为0. 2~0. 4mol/L，然后 加入乙醇至乙醇体积终浓度为70~78%，充分混匀后2~8°C静置过夜； (4) 离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次，干燥后即为精糖。2. 根据权利要求1所述的A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺，其特征在于，所述步 骤（1)中饱和中性醋酸钠溶液的浓度为10% ;冷酚与多糖和饱和中性醋酸钠溶液的混合液 比例为1:1。3. 根据权利要求1所述的A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺，其特征在于，所述步骤 (2) 中超滤膜包过滤时所用超滤液由浓度为0. 05mol/L的氯化钠溶液组成。4. 根据权利要求1所述的A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺，其特征在于，所述步骤 (3) 中NaCl终浓度为0. 3mol/L，乙醇体积终浓度为75%。5. 根据权利要求4所述的A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺，其特征在于，所述步骤 (3)中NaCl溶液加入多糖溶液时的浓度为4mol/L，所述乙醇加入使的浓度为95%。6. 根据权利要求1所述的A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺，其特征在于，所述步骤 (4 )中的干燥采用冷冻干燥方法。
【专利摘要】本发明公开的是A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺，解决了现有技术中粗多糖的纯化效率不高、精糖的获取率较低的问题。本发明包括以下步骤：（1）将粗多糖溶解于8%～12%饱和中性醋酸钠溶液中，然后按体积比为1:0.8～1.2的比例加入冷酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，并抽提1～3次使上清液澄清；（2）收集上清液，用超滤膜包进行超滤；（3）在超滤后的多糖溶液中加入NaCl溶液，直至NaCl终浓度为0.2～0.4mol/L，再加入乙醇至乙醇体积终浓度为70～78%，充分混匀后2～8℃静置过夜；（4）离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次，干燥后即为精糖。本发明具有回收率高、纯度高等优点。
【IPC分类】A61P37/04, C08B37/00
【公开号】CN105061629
【申请号】CN201510543237
【发明人】朱冲, 米强, 陈道远
【申请人】成都欧林生物科技股份有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月31日