莲中芋花叶病毒rt-pcr快速分子检测方法
【专利说明】
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于植物检疫领域，设及莲中芋花叶病毒的检测，具体设及一种莲中芋花 叶病毒RT-PCR快速分子检测方法。
【背景技术】
[0003] 莲（NelumbonuciferaGaedn.)是一种多年生水生植物，主要生长在湖泊、高沼 地、池塘。在中国，莲因其可食用的地下茎和种子而作为一种重要的经济作物栽培已有2000 多年，有很好的经济价值与效益。莲的叶子、胚芽和花作为草本药物，含有很强的抗炎成分， 如生物碱、黄酬类、抗氧化剂等，因此具有极大的药用价值。除了食用价值和药用价值，莲花 还具有很高的观赏价值。莲花的颜色有深红、粉红、白和淡紫色或间色、W及黄色等，盛开时 吸引大量游客参观。在泰国，莲花还象征着一种佛教精神。莲因常年用地下块茎无性繁殖， 导致病毒大量积累，造成其种性退化，产量和品质下降。
[0004] 芋花叶病毒（Dasheenmosaicvirus,化MV)属于马铃馨Y病毒属，在天南星科植 物上是发生最普遍和危害最严重的病毒病原。Zettler( 1970)首次从芋头中发现了芋花叶 病毒（DsMV)。该病毒是一种通过晒虫介导的传播病毒。很多种类的晒虫都可W介导运种病 毒的传播。Pernezny(1993)报道芋花叶病毒在田间传播非常快。该病毒在种植植物间进 行传播，导致了产量的大大降低。
【发明内容】
阳0化]本发明目的在于提供一种莲中芋花叶病毒RT-PCR快速分子检测方法。该方法经 济简便，快速灵敏，可W100%检测莲中是否带化MV，从而为莲中化MV的防治、脱毒苗的检测 提供了有效手段。
[0006] 为达到上述目的，本发明采用W下技术措施： 根据已报道的化MV-对特异性外壳蛋白（CP)基因序列，首先合成一对扩增化MV的CP基因中间部分核屯、序列的寡核巧酸引物，然后将提取的莲叶片的总RNA反转成complement DM(cDNA)，再WcDNA为模板进行PCR扩增，若扩增得到与预期的片段，则表明所检测样品 感染芋花叶病毒，反之则未感染芋花叶病毒。
[0007] 一种莲中芋花叶病毒RT-PCR快速分子检测方法，所用引物为DF: 5,一邑邑邑ctt邑邑邑t邑at邑at邑邑a-3，，DR:5,一邑cctttca邑t邑ttctc邑ctt邑一3，。
[0008] 优选的，所述的莲中芋花叶病毒RT-PCR快速分子检测方法，包括如下步骤： (1)根据化MV特异性衣壳蛋白（CP)基因中间部分核屯、序列，合成特异性引物DF: 5, -gggcttgggtgatgatgga-3，，DR:5, -gcctttcagtgttctcgcttg-3，，目的片段长度为 35化P。
[0009] (2)取待检莲叶化提取其总RNA。
[0010] (3)取 200μΙPCR管，加入提取的RNA8yL，0.5yg/yL的oligo-d灯)152yL， 72°C下变性5min，取出置于冰上放置5min，再依次加入化ase-Freed地2〇 8μ^5Χ反转 录酶缓冲液5μL，lOmM的dNTPs1μL，200U/μL的反转录酶1μL，总体积为25μL;将反应 混合物于PCR仪中42°C延伸1. 5h，70°C再变性lOmin得到cDNA，-20°C保存备用。 W11] (4)配制25μΙPCR反应体系，取上述反转录产物cDNA1yL，加无菌水16yL， 10XDNA聚合酶缓冲液2.5μL，25mM的MgCl2 2μL，10mM的dNTPs0.5μL，10μM的引物DF和DR各1μL2U/μL的DM聚合酶1μL。在PCR仪上扩增，反应条件是：94°C预变性5min; 94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸Imin，36个循环；最后在72°C延伸lOmin。
[001引（5)取扩增产物4μL进行1%琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统进行检测，若扩 增得到357bp长度条带，则表明所检测样品感染芋花叶病毒，反之则未感染芋花叶病毒。
[0013] 所述的检测方法还包括将扩增得到的片段进行测序的步骤，测序结果与SEQID NO. 1所示序列一样则所检测样品感染芋花叶病毒。
[0014] 本发明利用反转录聚合酶链反应（RT-PCR)技术，通过设计并合成一对扩增化MV 的CP基因中间部分核屯、序列的寡核巧酸引物，建立了一种能快速、准确、灵敏地对莲中 化MV进行检测的方法。与现有技术相比，本发明具有W下优点和效果：在提取植物总RNA同 时也获得了芋花叶病毒RNA，从而避免了分离病毒的繁琐过程，操作方便，快速灵敏。克服 了ELISA法需制备抗血清的限制且灵敏度不高，费用高，易出现假阳性的缺点。本方法通过 BLAST比对分析，能100%判断莲是否带有芋花叶病毒。本方法在分子水平上为莲中化MV的 检测提供了一种快速灵敏，经济简便的新方法，为莲中DsMV的防治、脱毒苗的检测提供了 有效手段。
【附图说明】
[0015] 图1是莲中芋花叶病毒RT-PCR检测结果示意图；图中，Μ为化2000Marker，！和2 为溫室中接种后感染芋花叶病毒的莲；3和6为田间自然条件下感染芋花叶病毒的莲；4和 5为健康莲。
【具体实施方式】
[0016] W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均在常 规生化试剂商店购买。
[0017] 实施例1 W溫室中接种后感染芋花叶病毒的莲、田间自然条件下感染芋花叶病毒的莲、健康莲 为待检样品。
[0018] (1)根据化MV特异性衣壳蛋白（CP)基因中间部分核屯、序列，合成特异性引物DF: 5, -gggcttgggtgatgatgga-3,，DR:5, -gcctttcagtgttctcgcttg-3,，目的片段长度为 35化P (GenbankAccessionnumber:ΚΡ692755)。
[0019] (2)取各待检莲叶片，用RNApreppure植物总RNA提取试剂盒提取总RNA。
[0020] (3)取 200μΙPCR管，加入提取的RNA8yL0.5yg/yL的oligo-d灯)152μ^ 72°C下变性5min，取出置于冰上放置5min，再依次加入foiase-Freed地2〇 8yL5XM-MuLX 反转录酶缓冲液5μL，lOmM的dNTPs1μL，200U/μL的M-MuLV反转录酶1μL，总体积为 25μL;将反应混合物于PCR仪中42°C延伸1. 5h，70°C再变性lOmin得到cDNA，-20°C保存 备用。
[0021] (4)配制25μΙPCR反应体系，取上述反转录产物cDNA1μレ加无菌水16μ^ lOXTaqReactionBuffer2. 5yL，25mM的MgC!22yL，10mM的dNTPs0. 5μL，10μM的引 物DF和DR各1μL2U/μL的TaqDMPolymerase1μL。在PCR仪上扩增，反应条件是： 94°C预变性5min;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸Imin，36个循环；最后在72°C延伸 lOmin。
[0022] (5)取扩增产物4μ L加入6XLoadingBuffer进行1%琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶 成像系统进行检测。结果如图1所示，溫室中接种后感染芋花叶病毒和田间自然条件下感 染芋花叶病毒的莲叶片均检测到357bp长度条带，与预想的目的片段大小一致。而对照(健 康莲叶片）未扩增出任何产物。
[0023] (6)对扩增得到的357bp片段进行测序，采用单向测序，测序而结果如SEQIDNO. 1 所示。在NCBI上进行BLAST分析表明，测序结果与GenbankAccessionnumber为KP692755 的序列覆盖率达到100%。说明所扩增得到DM片段确为化MVCP基因片段。
[0024] 上述步骤用到的试剂：RNApreppure植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限 公司），Ξ憐酸碱基脱氧核巧酸（dNTPs)(鼎国生物技术有限公司），5XM-MuLV反转录酶缓 冲溶液(谱洛麦格(北京）生物技术有限公司），M-MuLV反转录酶(谱洛麦格(北京）生物技术 有限公司），oligo-d(T)(谱洛麦格(北京）生物技术有限公司），10XTaqReactionbuffer (鼎国生物技术有限公司），MgClz(鼎国生物技术有限公司），TaqDMPolymerase(鼎国生 物技术有限公司），6XLoadingBuffer(大连宝生物工程有限公司），化2000Marker(鼎国 生物技术有限公司）。
[00巧]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种莲中芋花叶病毒RT-PCR快速分子检测方法，其特征在于：所用引物为DF: 5? -gggcttgggtgatgatgga~3,,DR：5? -gcctttcagtgttctcgcttg-3,〇2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 合成特异性引物DF:5' -gggcttgggtgatgatgga-3'，DR: _gcctttcagtgttctcgcttg_3,; (2) 取待检莲叶片，提取其总RNA; (3) 取 200yLPCR管，加入提取的RNA8yL，0.5yg/yL的oligo_d(T)15 2yL，72°C 下变性5min，取出置于冰上放置5min，再依次加入Rnase-FreeddH20 8yL，5X反转录酶 缓冲液5μL，10mM的dNTPs1μL，200U/μL的反转录酶1μL，总体积为25μL;将反应混合 物于PCR仪中42°C延伸1. 5h，70°C再变性lOmin得到cDNA; (4) 配制25以1^?0?反应体系，取上述反转录产物〇0嫩1以1^，加无菌水16以1^，10\0嫩 聚合酶缓冲液 2. 5 μL，25mM的MgCl2 2 μL，10mM 的dNTPs0. 5 μL，10 μΜ的引物DF和DR各 1 μL，2U/ μL的DNA聚合酶1 μL;在PCR仪上扩增，反应条件是：94°C预变性5min;94°C变 性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，36个循环；最后在72°C延伸lOmin; (5 )取扩增产物4μL进行1%琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统进行检测，若扩增得 到357bp长度条带，则表明所检测样品感染芋花叶病毒，反之则未感染芋花叶病毒。3. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：还包括将扩增得到的片段进行测序 的步骤，若测序结果与SEQIDNO. 1所示序列一样则所检测样品感染芋花叶病毒。
【专利摘要】本发明公开了一种莲中芋花叶病毒RT-PCR快速分子检测方法，属于植物检疫领域。本发明合成一对扩增DsMV的cp基因中间部分核心序列的特异性引物（序列如SEQ？ID？NO.2和3所示），通过提取的莲叶片的总RNA反转成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，根据扩增结果来判定莲中是否感染DsMV。本发明在分子水平上能快速、准确、灵敏地对莲中DsMV进行检测，为莲中DsMV的防治、脱毒苗的检测提供了有效手段。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/70
【公开号】CN105368987
【申请号】CN201510964430
【发明人】胡中立, 喻霞, 郑兴汶, 刁英, 盛佳婧, 郑兴飞, 谢克强, 周明全
【申请人】武汉大学
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月18日