一种富集和定量水体中gii型诺如病毒的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种富集和定量水体中GII型诺如病毒的方法，属于环境监测技术领 域。
【背景技术】
[0002] 诺如病毒是一类无包膜的单链RNA病毒，属于杯状病毒家族，其具有基因多样性 的特点。诺如病毒可分为5个基因型，每个基因型可进一步分为若干基因亚型。I型及II 型诺如病毒主要感染人类，是引起食源性急性胃肠炎的主要原因，在美国，诺如病毒引起的 流行性胃肠炎占到食源性传染病的近一半。自1995年W来，诺如病毒引起爆发性腹泻疫情 在我国时有报道，如2010年广州，2009年长沙，据统计，诺如病毒感染性腹泻占到非细菌性 腹泻的Ξ分之二。人类诺如病毒是全世界范围内非细菌性急性胃肠炎的主要病因。其中 GII型诺如病毒感染又占到将近90%。大量的诺如病毒可W通过病毒感染者的粪便排出，运 样W病毒污染的食物或水为中介的粪-口传播构成了诺如病毒传播的主要途径。W前的很 多研究已经证明了诺如病毒在环境水体中的普遍存在，比如未处理污水，自来水，河水，海 水等等。因为诺如病毒不能在体外培养，其检测只能依靠巧光RT-PCR的方法。诺如病毒在 水中或食物中的载量通常都很低，但已足W引起疾病(大约10~100个病毒颗粒即可致病)。 如此低的病毒含量很难直接用常规的巧光RT-PCR方法检测到，所W从大量水体中富集浓 缩病毒就显得尤为重要。W前有很多水体病毒(包括很多冠状病毒)研究中都应用了阳离子 或者阴离子过滤器来浓缩水体，来提高病毒浓度W便PCR检测，但是对于水中诺如病毒却 缺少一种高效可靠稳定的富集方法。
[0003]VIRADEIL法（virusadso巧tionandelution,病毒吸附洗脱法）是多年来最常用 到的水体中浓缩富集诺如病毒的方法。它包括二个步骤，首先是含有病毒的水体通过吸附 性滤器，病毒被吸附在多孔滤膜上，接着使用缓冲液从滤膜上洗脱病毒。大多数肠道病毒能 够在Mg2+或其他多价阳离子存在时，或者酸性条件下吸附到阴离子滤膜上，相反，在多价阳 离子存在条件下，肠道病毒较难吸附于阳离子滤膜上，运也解释了为何阴离子滤膜对海水 中（盐浓度高）肠道病毒的富集效率要高于阳离子滤膜。而盐度低的水体（自来水、纯净水 等）更适用于使用阳离子过滤膜进行富集，阴离子膜适合处理小体积的盐度低的水体（因为 需要调节水体阳离子浓度及pH值)，而不适合现场大量常规水体(河水，湖水）的浓缩处理。 阳离子1MDS过滤器是最常被使用进行病毒浓缩的过滤器，但其缺点在于价格太贵。阳离子 Nanoceram过滤器相比较为便宜，它的滤忍由纳米氧化侣纤维(直径2纳米，长度250纳米） 覆盖的超细玻璃纤维(长度0. 6微米）组成。Nanoceram滤忍有着广泛的表面积（500m7g)， 由于其纳米氧化侣材质的特性，其孔径大约为2微米，足W截留绝大多数病毒，其巨大的表 面积化及相对较高的等电点（8~9)赋予了Nanoceram滤忍较强的正电荷，因病毒蛋白多带 负电荷，所WNanoceram滤忍可对病毒形成较强的吸附作用，Karim等报道用Nanoceram滤 器对脊髓灰质炎病毒的回收率可媳美1MDS阳离子滤忍，对自来水中诺如病毒的回收率大 约为4%，对河水中诺如病毒的回收率最高可达30%，运一结果显著高于1MDS阳离子滤忍(分 别为 2. 6% 及 2. 2%)。
[0004] 最常用于从滤膜上洗脱病毒的缓冲液是抑9~9. 5的牛肉浸膏，经常使用的浓度 是1. 59?Κ3%，并且常和一种二性氨基酸-甘氨酸一起组成洗脱缓冲液。牛肉浸膏缓冲液能 够从带负电和带正电的滤膜上洗脱病毒，多聚憐酸钢（NaPP)是一种无机阴离子盐，因其带 有大量憐酸基团，所W带强负电荷，暴露于多聚憐酸钢溶液中的滤膜，其表面的净负电荷会 增加，前已述及病毒通常也带负电荷，由此滤膜和病毒间的静电排斥力就会增加，使得病毒 更容易被洗脱。多聚憐酸钢结构上通常是由2~17个单位组成的多聚合物链。加入吐溫80 的NaPP被用于从中空纤维超滤器中洗脱病毒，细菌等。另外NaPP也可加入牛肉浸膏中提 高病毒的洗脱率。
[0005] 根据滤忍的不同，病毒洗出液的体积从420血（nanoceram滤忍巧Ij1. 6L(1MDS滤 忍）不等，所W在进行分子实验前，次级浓缩也是很必要的。采用有机絮凝沉淀能够将牛肉 浸膏洗出液浓缩至15~40血，而采用超滤管能够将70血MS2隧菌体洗出液最小浓缩至350 μLPEG沉淀法也是浓缩病毒的一种常用方法，病毒回收率稍逊于超滤管法。娃藻±吸附 法也是常用方法之一，回收率和PEG沉淀法类似。
[0006] 使用巧光定量PCR对浓缩液中的病毒进行定量是评估浓缩效果的必不可少的一 环，最精确的方法是用巧光PCR进行绝对定量，而要进行绝对定量必须要进行标准曲线的 绘制，构建稳定的标准质粒是绘制好的标准曲线的前提。
[0007] 综上所述，建立一种对环境水体中诺如病毒具有较高回收率的富集及定量检测方 法，将为水源性诺如病毒胃肠炎的溯源提供可靠的实验室检测手段，而且对于其他水传播 病毒例如肠道病毒的富集和监测工作也有极大的借鉴意义。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是建立一种对环境水体中诺如病毒具有较高回收率的富集及定量 检测方法，为水源性诺如病毒胃肠炎的溯源提供可靠的实验室检测手段。
[0009] 本发明的技术方案：一种富集和定量水体中GII型诺如病毒的方法，具体步骤为： (1)前处理：采集水样，并对水样进行前处理，消除水样中残余的消毒剂； 采集水样，水样量：原水为50~100以滤后水或水厂出水为250~500L;对采来的水 样进行前处理，即加入硫代硫酸钢去除氯等消毒剂15min，W去除消毒剂对病毒的影响，所 投的硫代硫酸钢根据水的重量或体积确定，每1化水加Ig硫代硫酸钢。
[0010] (2)过滤：利用过滤系统W负压抽滤，通过蠕动累W3~5L/min的速度抽取经步骤 (1)处理的实际水样，将水样中的GII型诺如病毒富集于过滤系统的滤忍上，其中滤忍为带 阳电荷的Nanoceram膜； (3) 洗脱病毒：用500mL抑为9. 5的牛肉浸膏洗脱液，洗脱液中牛肉浸膏的浓度为3% (g/mL)，多聚憐酸钢0. 1% (g/mL)，甘氨酸浓度为0. 1M;将此洗脱液W300血/min的流速 通过富集了GII型诺如病毒的Nanoceram滤忍，而后用所用的洗脱液W同样速度进行反向 洗脱，之后将滤忍浸泡在该份所用的500mL洗脱液中，浸泡滤忍15~20min,之后倾倒出所 有洗脱液； (4) 洗脱液超滤管浓缩：将步骤（3)获得的洗脱液用肥1将抑值调至7. 6,将洗脱液置 于CentriconPlus70 (Millipore)超滤管中（截留分子量30kD)，置于低溫冷冻离屯、机中， 在4°C、3500g/min离屯、30min,收集浓缩液，约2血； (5) GII型诺如病毒绝对定量曲线的制作： a、 构建阳性标准质粒：用化曲化reViralRNAkit试剂盒提取GH型诺如病毒阳性样 本中的核酸，用化kara公司的Primer-ScriptRT-PCRkit进行逆转录反应，使用随机六聚 体引物，W上反应的具体步骤均按照试剂盒说明书；使用设计引物GII-R(反向）和GII-F1 (正向）进行第一步半巢氏PCR反应，反应条件如下：cDNA模板2 10Xbuffer2 dNTPmixUire(2.5mMeach)1.6yL，MgCl2 (25mM)1.4yL，上下游引物（ΙΟμΜ)各 0.5μΙ(终浓度都为0. 25μΜ)，ΕχTaq酶（5U/yL)0. 15μレ补DEPC水至总体积20yL;循环条件如 下：95°C2min;95°C15s，52°C30s，72°C30S，循环36次；72°C10min，PCR试剂购自 Takara。将第一步半巢氏PCR反应的产物稀释10倍，取2μL作为第二步PCR反应的模板， 反应体系和循环条件如第一步，引物改为GII-R(反向）和GII-F2 (正向）;最后PCR产物由 Axgen公司生产的AxyPrep96PCR清洁试剂盒进行纯化回收，回收步骤可见清洁试剂盒说 明书；PMD18-T连接试剂盒连接PCR回收片段至T载体，连接产物转化大肠杆菌TG1 ;连接 方法按照连接试剂盒说明书，转化使用经典氯化巧转化法(分子克隆第Ξ版）；转化菌经测 序无误，即用UNIQ-200柱式质粒DNA中量抽提试剂盒(上海生工）抽提转化菌中的质粒；抽 提步骤见抽提试剂盒说明书；核酸蛋白测定仪测定质粒浓度，并根据质粒分子量及阿佛伽 德罗常数（Να)换算成拷贝数；计算公式如下A=CXNa/B+14,A为拷贝数（copy/yL)，C为 GII型诺如病毒标准质粒浓度（ng/μL)，B为GII型诺如病毒标准质粒分子量仙）；所得 质粒即为阳性标准质粒； b、 巧光定量PCR进行曲线绘制：将GII型诺如病毒标准质粒首先稀释到10"copy/yL 作为标准曲线的最高浓度，再进行10倍比稀释，直至浓度达到10copy/μL;将每个稀释度 的质粒作为巧光定量PCR的模板，反应体系为：2Χ如antitechprobeRT-PCRMasterMix 12.5μΙ,6ΙΙ-Κθ8?Ρ(10μΜ) 0. 5μL,GII-RealR(10μΜ) 0. 5μL,NoroProbe(10μΜ) 0. 125μL，如antitechRTMix0. 25μL，foiase-free&0 9μL和模板 2μL;反应参数如 下：50°C30min;95°C15min;94°C15s，60°C60s，共 40 个循环，60°C收集巧光信号；实验 重复5次，取巧光扩增曲线CT值平均值和对应模板拷贝数的10底对数绘制标准曲线； (6) 浓缩液绝对定量：对浓缩液中病毒浓度（copy/μL)采用巧光定量PCR的方法进行 绝对定量，核酸提取方法和巧光定量PCR方法参见权利要求1中第5步，最后根据实际抽取 的水样量计算实际水中的病毒浓度（copy/μL)。
[0011] 本发明的有益效果：本发明提供的采样富集水体中病毒的方法，无需对水样进行 调节抑值、预过滤等前处理，只需去除水样中残存的氯等消毒剂，W提高后续检测的准确 性。本发明富集检测水体中诺如病毒的方法简便快速，一般一天之内就可完成，运为及时预 防诺如病毒疫情的扩散和传播提供了宝贵的时间。 阳012] 本发明利用高容量的滤忍对水体中的诺如病毒进行过滤、洗脱、浓缩来实现大水 样量（50~500L)的水体中病毒的富集；本方法不需要对水样进行预处理、不需要调节抑 值，本方法对病毒采集装置进行了UV消毒，提高了后续病毒富集和检测的准确度。本方法 得到的诺如病毒回收率优于已有的方法。众多优点能使后续病毒检测的灵敏度大大提高， 从而实现了对水体中诺如病毒的有效监测。相对于传统的病毒富集方法，该方法操作简单、 步骤简洁、设备要求不高且省时，便于在水厂和水源地等基层推广应用。
【附图说明】
[0013] 图1是本发明实施例1流程不意图。
【具体实施方式】
[0014] 下面通过实施例进一步描述本发明。
[0015] 在采样、富集水体中病毒之前，先对采集装置进行消毒处理，病毒采集装置包括滤 器、取样桶、娃橡胶管、离屯、管等，用UV(紫外线）灭菌24hW上。
[0016] 本发明提供的采样富集