TCGGAATTACTGGGCGTAAAGCG TGCGCAGGCGGTTTTGTAAGACAGGCGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAATTGCGCTTGTGACTGCAAGGCTAG AGTGCGTCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGG CAGCCCCCTGGGACGTGACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC GCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTTCTCAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGG GGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCG ATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGCCACTAACGAAGCAGAGATGCATTAGGTGCCCGAAAGGGAAA GTGGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCC TTGTCTCTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAA GTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTGCGTACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGG AGCTAATCCCAGAAAACGCATCGTAGTCCGGATCGTAGTCTGCAACTCGACTACGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAAT CGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTG CCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGAGGGCGATACCACACCo
[0027] 将得到的序列与Genebank上的相关16S rRNA序列进行比对。与Genebank公开 的相应菌株序列用Cluster X方法进行比对。基于1000个重复的抽样分析，使用MEGA 5.0 按邻接法构建系统树。构建得到的16S rRNA系统发育树如图2所示。
[0028] 实施例2 :菌株Paddy-2的铁氧化过程。
[0029] 采用的液体培养基配方：每升液体培养基中含20mM PIPES缓冲液、5. 14mM NaCl、 1.03mM KH2P04、2. 03mM MgCl2、0. 68mM CaCl2、5mM CH3C00Na、维生素溶液和微量元素溶液各 10.0 mL (维生素溶液和微量元素溶液成分同实施例1)，溶剂为去离子水。
[0030] 从保存菌株Paddy-2的斜面挑取菌苔接种至液体培养基中，于30°C、180rpm摇床 活化菌体18小时，使细菌数量达到指数生长期。4°C、6000rpm离心10min，去上清液，用20mM PIPES缓冲液重新悬浮，重复上述操作2次，将沉淀的菌悬体浮于液体培养基中，制成菌悬 液。
[0031] 接种细菌悬浮液于液体培养基中，同时设置三个处理，分别为①菌株+亚铁；②菌 株+硝酸盐+亚铁；③硝酸盐+亚铁，其中硝酸盐（NaNO 3)和亚铁（FeCl2 · 4H20)的初始浓 度分别为IOmM和5mM，鼓充高纯混合气体（N2AX) 2= 80/20,体积比）30分钟，鼓气完毕后盖 橡胶盖加铝盖密封，于30°C静置厌氧培养箱中培养。
[0032] 每隔1天取混合均勾的Iml培养液于4ml 0. 5mol L 1HCl溶液中180转/分振荡 1. 5小时，再过滤，采用邻菲罗林法给滤液中的Fe(II)显色，采用紫外分光光度计在510nm 处测定Fe(II)的含量，并以不加菌的培养液为对照，验证菌株的亚铁氧化能力。
[0033] 试验结果如图3所示，结果表明菌株不能直接氧化亚铁，只有在耦合硝酸盐还原 的条件下才能氧化亚铁；不接种菌株的对照体系亚铁含量也没有变化，说明菌株在硝酸盐 环境中对亚铁有较强的氧化能力，亚铁被氧化不是由于自身的化学氧化。
[0034] 实施例3 :菌株Paddy-2对亚铁氧化成矿的作用过程。
[0035] 液体培养基的配制及菌悬液的制作同实施例2。
[0036] 根据实施例2的结果，只有在硝酸盐存在的条件下，菌株才表现出亚铁氧化的能 力。接种细菌悬浮液于液体培养基中，实验处理为菌株+硝酸盐+亚铁，并以不加菌的培养 液为对照，考察菌株对亚铁氧化成矿的作用。
[0037] 亚铁氧化形成的沉淀物在厌氧条件下用磷酸缓冲液（10mM，pH 7. 0)洗涤两次，冷 冻干燥，测试。利用透射电镜（TEM)观察形成的沉淀物与菌株的依附关系。
[0038] 试验结果如图4所示，结果表明菌株在氧化亚铁的同时，在细胞的表面生成了无 定型铁氧化物。亚铁氧化形成的氧化物沉淀聚集并包裹菌株。
[0039] 实施例4 :菌株Paddy-2的砷还原作用过程。
[0040] 液体培养基的配制及菌悬液的制作同实施例2。
[0041 ] 接种细菌悬浮液于液体培养基中，同时设置四个处理，分别为①菌株+硝酸盐+砷 酸盐+亚铁；②菌株+硝酸盐+砷酸盐；③菌株+砷酸盐；④菌+砷酸盐+亚铁，其中硝酸 盐（NaNO3)、亚铁（FeCl2 ·4Η20)及砷酸盐（砷酸盐为砷酸钠）的初始浓度分别为10mM、5mM、 8-10 μ M，鼓充高纯混合气体（N2/C02 = 80/20,体积比）30分钟，鼓气完毕后盖橡胶盖加铝 盖密封，于30°C静置厌氧培养培养。
[0042] 每隔1天取混合均匀的2ml培养液过滤，注入0. 5ml 5mmol L 1HCl中保存，采用 AFS-2202E原子荧光光度计测定，验证菌株的砷还原能力。
[0043] 不同条件下，菌株对砷的还原作用实验结果如图5所示，菌株对砷具有较强的还 原能力，而在添加硝酸盐的体系中，只有少量的砷被还原，表明硝酸盐和砷在被还原的过程 中存在竞争关系，在相同条件下，硝酸盐首先被菌株还原。在添加亚铁和砷的体系中，检测 到的三价砷含量明显小于被去除的五价砷，说明亚铁对砷还原有一定的抑制作用的同时， 生成的铁氧化物能够将五价砷固定，降低其潜在风险。在不添加亚铁的体系中，反应11天 后，神完全被还原；添加亚铁的体系中，反应11天后最多40%左右的神被还原，表明亚铁对 菌株还原砷具有一定的抑制作用。
[0044] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一株能转化重金属的贪铜菌属菌株，其特征在于：其名称为贪铜杆菌（Cupriavidus metallidurans)Paddy_2,于2015年6月29日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3 号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号 为CGMCCNo. 11028。2. 权利要求1所述的能转化重金属的贪铜菌属菌株的应用，其特征在于：是将其氧化 亚铁和微生物成矿、以及还原砷。3. 根据权利要求2所述的能转化重金属的贪铜菌属菌株的应用，其特征在于：所述的 能转化重金属的贪铜菌属菌株在氧化亚铁和微生物成矿时，需在硝酸盐存在条件下，将所 述的能转化重金属的贪铜菌属菌株作用氧化亚铁。4. 根据权利要求2所述的能转化重金属的贪铜菌属菌株的应用，其特征在于：所述的 能转化重金属的贪铜菌属菌株在还原砷时，为先去除硝酸盐以及亚铁，再将所述的能转化 重金属的贪铜菌属菌株作用砷酸盐。5. 权利要求1所述的能转化重金属的贪铜菌属菌株在改良土壤以及用于修复砷污染 土壤中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一株能转化重金属的贪铜菌属菌株及其应用。该菌株名称为贪铜杆菌(Cupriavidus？metallidurans)Paddy-2，于2015年6月29日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC？No.11028。该菌株在硝酸盐环境中对亚铁有较强的氧化能力并能对亚铁氧化成矿，其可用于土壤的改良；该菌株对砷也具有较强的还原作用，在无硝酸盐和亚铁离子的条件下，其对砷的还原作用更强，可用于修复砷污染土壤。CGMCC No.1102820150629
【IPC分类】C12R1/01, C12N1/20, B09C1/10
【公开号】CN105400719
【申请号】CN201510885689
【发明人】李芳柏, 童辉, 陈鹏程, 刘承帅, 陈曼佳
【申请人】广东省生态环境与土壤研究所
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月3日