一种检测3′非翻译区对mRNA翻译效率的作用的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种在细胞中研究3'UTR对mRNA翻译效率的作用的方法。
【背景技术】
[0002] 可选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation，APA)在基因表达调控中 起着重要的作用。位于终止密码子下游的APA可以产生具有不同长度3'UTR的mRNA异构体， 而不同长度的3'UTR可以导致顺式调控元件的包含或缺失，这些顺式调控元件包括RNA结合 蛋白（RNA binding protein,RBP)的结合位点和miRNA结合位点等，从而对mRNA的转运、稳 定性、翻译效率等产生影响，进而对表型造成影响。近年来的研究发现，在不同的生理和细 胞状态中存在全基因组3 ' UTR转换现象，包括肿瘤发生和转移、动物发育、免疫应答等。因 此，研究APA对基因表达调控的影响，对于揭示与APA相关疾病的致病机理、信号调控网路等 具有重要的意义。
[0003] 目前研究3'UTR长度与翻译效率关系的方法主要有以下两种：（1)运用荧光素酶报 告基因载体，将不同长度的3'UTR连接到荧光素酶报告基因载体上，通过检测荧光素酶与底 物反应产生的荧光强度来间接反映基因的表达量，从而判断3 ' UTR长度对翻译效率的影响； (2)多聚核糖体密度梯度离心(polysome profi 1 ing)结合APA位点高通量测序的方法，通过 polysome profiling分离翻译效率不同的mRNA转录本，逆转录构建测序文库进行APA位点 高通量测序，分析测序数据来研究3'UTR长度与翻译效率的关系。上述的方法都有其局限， 均不能同时对mRNA转录本和蛋白产量进行动态定量分析，而基因的表达调控是一个动态的 过程，涉及DNA的转录和mRNA的翻译，仅通过最终蛋白的产量或者mRNA上核糖体结合数量不 能很好的反映3'UTR长度改变对翻译效率影响的动态过程。近年来发展的RNA体内荧光标记 技术，有望为动态研究3 ' UTR长度与翻译效率关系提供更为直观的新方法。
[0004] RNA体内荧光标记技术是对传统生物荧光标记技术的发展，传统的生物荧光标记， 如绿色荧光蛋白（GFP)，可作为标准化的基因元件应用于对目标蛋白进行荧光标记，可检测 基因的表达、目标蛋白的细胞定位等。2011年，来自美国康奈尔大学的研究人员在Science 上报道了一种名为Spinach的RNA荧光标记基因，其可在细胞中模仿GFP，将目的基因与 Spinach连接，转录出含有Spinach结构的融合RNA在荧光染料DFHBI下发出绿色荧光，从而 实现在细胞中对目的基因 mRNA转录本进行荧光标记。随着不断改进优化，目前已开发出稳 定性更高的RNA荧光标记基因 Spinach2和荧光染料DFHBI-1T。将荧光蛋白基因与RNA荧光标 记基因联用构建双荧光报告基因载体，连接上不同长度的3'UTR基因片段，可通过荧光同时 对mRNA转录本和蛋白产量进行动态测量，为研究3'UTR长度与翻译效率关系带来了新的思 路和策略。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有研究3'UTR与翻译效率关系方法的局限，提供一种通 过双荧光报告基因载体动态研究3'UTR对翻译效率的作用的方法，同时本发明还提供了采 用所述方法研究3 ' UTR长度与翻译效率的实例。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案分为以下两个内容：
[0007] (1)根据需要选择合适的荧光蛋白载体，对载体进行适当的改造，如在荧光蛋白基 因末端插入终止密码子;合成RNA荧光标记基因 tRNA-Spinach2或其他编码可发荧光RNA分 子的DNA，并将其插入到上述改造的载体中，获得双荧光报告基因载体；
[0008] (2)将不同长度的3'UTR插入到双荧光报告基因载体中，瞬时转染细胞，在成像培 养基下进行荧光观测，其中绿色荧光的强度代表转录本的量，红色荧光强度代表荧光蛋白 的产量，在转录本量相同的情况下，蛋白产量越多，则表明翻译效率越高，以此对荧光强度 数据进行标准化处理来判断3 ' UTR长度与翻译效率的关系。
[0009] 其中，所述步骤（1)的荧光蛋白载体可选用除绿色荧光蛋白以外的荧光蛋白载体， 因为Spinach2/DFHBI-1T复合物激发的是绿色荧光。
[0010] 本发明的有益效果为:本发明所述的双荧光报告基因研究3'UTR长度与翻译效率 关系的方法可通过测定荧光强度动态地对mRNA转录本和蛋白产量进行定量分析，适用于基 础生物学研究，尤其适用于对3'UTR表达调控元件的研究。采用所述方法可以更为直观地对 APA的功能进行研究，由此方法得到的结果可用于验证polysome profi 1 ing结合APA位点高 通量测序的数据分析结果。
【附图说明】
[0011 ]图1为本发明所述实例中双荧光报告基因载体pmCS2构建流程
[0012]图2为本发明所述实例中双荧光报告基因载体研究3'UTR与翻译效率关系的原理 示意图
[0013] 实施案例：
[0014] 为了更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将以构建PmCS2双荧光 报告载体的构建过程和具体的研究实例，结合附图对本发明作进一步说明。
[0015] -、双荧光报告基因载体pmCS2构建流程
[0016]构建过程中，所有合成引物均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；除了标明 出处的试剂，其余均为国产分析纯试剂。
[0017] T4DNA Ligase，T4PNK，去磷酸化酶，限制性核酸内切酶Bbsl和Bgin是NEB公司的 产品；LA Taq polymerase，限制性核酸内切酶EcoRI和Sail购自Takara公司；焚光染料 DFHBI-Π '购自 Lucerna公司。
[0018] 双荧光报告基因载体pmCS2的构建方法包括以下两个步骤：
[0019] 步骤1.以载体pmCherry-Cl为基础，截取Bbsl和Bgin两个酶切位点的282bp基因 片段，设计PCR引物，在mCherry基因下游引物3 '末端加入终止密码子TAG进行扩增，分别对 pmChrry-Cl和PCR产物用Bbsl和Bgl Π 进行双酶切，将PCR产物连接到载体上，替换原来的 282bp基因片段，获得改造的pmCherry-Cl载体，具体分为以下4步：
[0020] (1)对载体pmCherry-CIBbsI和Bgin酶切位点之间的282bp序列进行扩增，PCR引 物如下所示：
[0021 ] mCherry-Fl:5,-GAAGAAGACCATGGGCTGGGAG-3，
[0022] Bbsl
[0023] mCherry-Rl:5,~GATAGATCTCTACTTGTACAGCTCGTCCATGC~3'
[0024] Bgin terminator
[0025] 配制以下PCR反应体系：
[0026]
[0027] PCR循环的反应条件如下：
[0028]
[0029] 反应结束后，对PCR产物进行胶回收纯化，回收295bp的片段。
[0030] (2)对载体pmCherry-Cl和步骤(1)中的PCR胶回收产物进行双酶切，配制以下酶切 反应体系：
[0031]
[0032]
[0033] 混匀反应液，37°C水浴lh。反应结束后，胶回收纯化双酶切载体。
[0034] PCR产物双酶切体系：
[0035]
[0036] 混匀反应液，37°C水浴20min。反应结束后，用胶回收试剂盒纯化PCR双酶切产物， 接着对纯化产物进行磷酸化处理，配制以下反应体系：
[0037]
[0038] 混匀反应液，反应条件为:37°C30min，65°C20min。
[0039] (3)对步骤(2)的双酶切产物进行连接，在连接反应体系中，载体与连接片段的个 数比例为1:5至1:6之间，配制以下混合反应液：
[0040]
[0041]
[0042]混匀反应液，16°C反应lh。反应结束后，将连接产物转化至感受态DH5a中。
[0043] (4)挑取单菌落送至测序公司测序，测序引物用通用引物CMV-F，检验片段序列是 否插入终止密码子TAG。检验无误后可将经改造的pmCherry-Cl载体转染细胞观察是否正常 表达红色荧光蛋白。
[0044] 步骤2.向经改造的pmCherry-Cl载体酶切位点EcoRI和Sail之间插入RNA荧光标记 基因 tRNA-Sp inach2，获得双荧光报告基因载体pmCS2，具体分为以下4步：
[0045] (1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成tRNA_Spinach2基因片段，在5'端加 入E c 〇 R I酶切位点，在3 '端加入S a 1 I酶切位点，序列如下所示：5 ' -GAATTCGCCCGGATAGCTCAGTCG