自然对流型pcr-电泳集成芯片及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种自然对流型PCR-电泳集成芯片，尤其是一种适用于DNA聚合酶链式反应与凝胶电泳检测联用，以实现临床医学疾病的诊断和生物分子的检测分析。
【背景技术】
[0002]聚合酶链式反应技术，又称无细胞克隆技术，是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的生物技术。该技术目前已广泛应用于生物学、生物化学、医学、环境与食品等领域。其主要原理是利用DNA在95° C高温时变性会形成单链;低温约60° C时退火引物与单链按键基互补配对的原则结合;再升温至72°C DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5’-3’)的方向合成互补链。目前核酸扩增主要在PCR热循环仪内完成，其核心部件是通过对放有DNA的样品槽(铝质或银质)反复变温实现。然而当前的PCR仪主要存在(I)升降温变化速率慢;(2)反应溶液温度不均匀；(3)较大的反应体积增加了生物试剂的消耗量，提高了实验成本等不足，导致PCR反应时间长，样品耗量大，提高了实验成本。而常规自然对流型PCR装置反应腔较少，不能实现样品的批量反应，而且对于扩增后的PCR产物需要离线的平板凝胶电泳或毛细管电泳等方式检测完成，这对实验室的硬件条件和实验人员的操作水平都提出了比较高的要求。为此，如何实现快速PCR以及简化PCR产物检测流程，是当前研究的一个方向。
【发明内容】
[0003]本发明基于上述现状，提出一种简单结构的、成本较低的、可实现DNAPCR及PCR产物检测一体化的自然对流型PCR-电泳集成芯片及检测方法。
[0004]本发明所采用的技术解决方案是:一种自然对流型PCR-电泳集成芯片，包括PCR-电泳芯片、自然对流PCR反应腔、平板凝胶电泳电极槽、平板凝胶电泳电泳槽、第一、二电极，自然对流PCR反应腔由圆柱形腔组成，自然对流PCR反应腔高与底面直径比值为10;所述的PCR-电泳芯片两端设有两个平板凝胶电泳电极槽，平板凝胶电泳电极槽内放入第一、二电极，所述的PCR-电泳芯片上面设有平板凝胶电泳电泳槽，所述平板凝胶电泳电泳槽由截面积为矩形或圆形的阵列通道构成。
[0005]—种应用自然对流型PCR-电泳集成芯片的检测方法，其步骤为:首先将高与底面直径比值为1的圆柱腔体阵列化排列，再将目标DNA样品与PCR试液放入所述圆柱腔体，并对所述圆柱腔体的上下表面分别施加55°C和97°C高温供腔体内液体形成自然对流循环从而实现目标样品的PCR，待目标样品PCR完成后，采用多通道移液器将PCR产物移入平板凝胶电泳电泳槽，并在平板凝胶电泳电泳槽两端第一、二电极施加电加后实施电泳，最终实现目标DNA的自然对流PCR以及PCR产物的在线检测。
[0006]本发明的有益效果在于:本发明自然对流PCR-电泳集成芯片，结构比较简单，制作工艺也较为简单，不涉及超精密机械加工设备，并且可以实现DNA批量PCR反应及PCR产物在线检测，避免了生物样品的交叉污染。与传统PCR仪以及常规自然对流装置相比，本发明实现了小型化、反应及检测一体化，减少了设备的数量，降低了硬件购置成本，简化了人工操作，提高了效率。
【附图说明】
[0007]图1是本发明的自然对流型PCR-电泳集成芯片的结构图；
图2是本发明的自然对流型PCR-电泳集成芯片的主视图；
图3是本发明的自然对流型PCR-电泳集成芯片的俯视图；
图4是本发明的自然对流型PCR-电泳集成芯片的侧视图；
图5是PCR腔体内液体自然对流状态；
图6是自然对流PCR-电泳芯片内牙周病原菌体PCR产物电泳结果:1.T.f, 2.T.d,3.P.g， 4.100 bp DNA ladder.0
【具体实施方式】
[0008]下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
[0009]如图1至图4所示，一种自然对流型PCR-电泳集成芯片，包括PCR-电泳芯片、自然对流PCR反应腔1、平板凝胶电泳电极槽2、平板凝胶电泳电泳槽3、第一、二电极4，5。
[0010]自然对流PCR反应腔I由圆柱形腔组成，自然对流PCR反应腔I高与底面直径比值为10;所述的PCR-电泳芯片两端设有两个平板凝胶电泳电极槽2，平板凝胶电泳电极槽2内放入第一、二电极4，5，所述的PCR-电泳芯片上面设有平板凝胶电泳电泳槽3，所述平板凝胶电泳电泳槽3由截面积为矩形或圆形的阵列通道构成。
[0011 ] 一种应用自然对流型PCR-电泳集成芯片的检测方法，其步骤为:首先将高与底面直径比值为1的圆柱腔体阵列化排列，再将目标DNA样品与PCR试液放入所述圆柱腔体，并对所述圆柱腔体的上下表面分别施加55°C和97°C高温供腔体内液体形成自然对流循环从而实现目标样品的PCR，待目标样品PCR完成后，采用多通道移液器将PCR产物移入平板凝胶电泳电泳槽3，并在平板凝胶电泳电泳槽3两端第一、二电极4，5施加电加后实施电泳，最终实现目标DNA的自然对流PCR以及PCR产物的在线检测。
[0012]实例:运用自然对流型PCR-电泳集成芯片及其相关装置对牙龈卟啉菌(Porphyromonas Gingivalis，Pg)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola，Td)、福赛拟杆菌(Tre-ponema denticola Tf)以及10bp DNA Ladder进行扩增和检测。
[0013](I)使用吸潮纸尖(天津达雅鼎医疗器械有限公司)插入牙周袋约1.0分钟，将吸潮纸尖移至盛有100 yL PBS(美国Sigma-Aldrich公司)的离心管中放置约3分钟，之后将离心管高速(10000 rpm)离心约10分钟，最后取0.7 yL上清液做为牙周菌样品供PCR反应。
[0014](2)配置34.3 yLPCR反应液，其主要成份包括:3.5 μ? 1X Fast Buffer I,2.8 μ? dNTP mixture(2.5 μΜ)， 0.7 μ? primerI (5’-TGTAGATGACTGATGGTGAAAACC-3’)and 0.7 μ? primer 2 (5，- ACGTCATCCCCACCTTCCTC-3’)， 0.175 μ? Speed-STAR HS DNAPolymerase, 0.35 μI PVP (10%),和26.075 μI pure water。
[0015](3)将牙周菌DNA样品与PCR反应液混合均匀后取26.5 μ?放入PCR腔体，并在圆柱腔体顶面贴上PCR膜(Thermo Fisher Scientific, Ref: 120993)密封。
[0016](4)PCR腔体上下表面分别施加55°C和97°C高温以实现腔体内液体的对流循环(图5)0
[0017](5)自然对流PCR反应结束后，将PCR产物以及100 bp DNA ladder注入电泳芯片部分，观测对照PCR产物结果(图6)。
【主权项】
1.一种自然对流型PCR-电泳集成芯片，包括PCR-电泳芯片、自然对流PCR反应腔(I)、平板凝胶电泳电极槽(2)、平板凝胶电泳电泳槽(3)、第一、二电极(4，5)，其特征在于:自然对流PCR反应腔(I)由圆柱形腔组成，自然对流PCR反应腔(I)高与底面直径比值为10;所述的PCR-电泳芯片两端设有两个平板凝胶电泳电极槽(2)，平板凝胶电泳电极槽(2)内放入第一、二电极(4，5)，所述的PCR-电泳芯片上面设有平板凝胶电泳电泳槽(3)，所述平板凝胶电泳电泳槽(3)由截面积为矩形或圆形的阵列通道构成。2.—种应用权利要求1所述的自然对流型PCR-电泳集成芯片的检测方法，其特征在于，其步骤为:首先将高与底面直径比值为10的圆柱腔体阵列化排列，再将目标DNA样品与PCR试液放入所述圆柱腔体，并对所述圆柱腔体的上下表面分别施加55°C和97°C高温供腔体内液体形成自然对流循环从而实现目标样品的PCR，待目标样品PCR完成后，采用多通道移液器将PCR产物移入平板凝胶电泳电泳槽(3)，并在平板凝胶电泳电泳槽(3)两端第一、二电极(4，5)施加电加后实施电泳，最终实现目标DNA的自然对流PCR以及PCR产物的在线检测。
【专利摘要】本发明涉及一种自然对流型PCR-电泳集成芯片及检测方法，自然对流PCR反应腔由圆柱形腔组成，将高与底面直径比值为10的圆柱腔体阵列化排列，再将目标DNA样品与PCR试液放入圆柱腔体，并对圆柱腔体的上下表面分别施加55℃和97℃高温供腔体内液体形成自然对流循环从而实现目标样品的PCR，待目标样品PCR完成后，采用多通道移液器将PCR产物移入平板凝胶电泳电泳槽，并在平板凝胶电泳电泳槽两端电极施加电压后实施电泳，最终实现目标DNA的自然对流PCR以及PCR产物的在线检测。与传统PCR仪以及常规自然对流装置相比，本发明实现了小型化、反应及检测一体化，减少了设备的数量，降低了硬件购置成本，提高了效率。
【IPC分类】C12M1/38, C12M1/34
【公开号】CN105505763
【申请号】CN201610017867
【发明人】李振庆, 杨荣林, 黄嘉欣, 赵阳, 张大伟, 山口佳则
【申请人】上海理工大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月12日