一种快速诊断结核病潜伏感染的引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及采用分子生物学快速检测的技术领域，尤其设及一种qRT-PCR技术快 速诊断结核病潜伏感染的引物及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 近年来结核病疫情呈加重蔓延之势，其发病和死亡人数均居甲、乙两类传染病之 首，给个人、家庭、社会造成了沉重的经济负担和精神压力。世界上约1/^3的人感染了结核分 枝杆菌，其中约90%的人呈结核潜伏感染状态（latent TB infection，LTBI)。大多数活动 性结核都是因为潜伏感染者体内结核分枝杆菌重新激活所致，所W及早诊断、早治疗潜伏 感染者是降低结核病发病率，控制结核分枝杆菌传播的重要途径之一。
[0003] 结核潜伏感染者因其没有临床症状和体征，诊断比较困难。目前用于诊断结核潜 伏感染的方法，是干扰素丫释放实验（interferon gamma release assays,IGRAs)，但 IGRAs无法区分活动性结核患者和结核潜伏感染者。结核潜伏感染者常被看成一种感染但 是并未发病的人群，但不同的结核潜伏感染者对结核分歧杆菌感染的免疫应答能力并不完 全相同，活动性结核患者也有类似的特征。为了能够快速、准确筛查结核潜伏感染者，本发 明采用qRT-PCR技术设计独特的、对结核分歧杆菌具有良好敏感性、特异性的引物和试剂 盒，对实现微量外周血快速诊断结核潜伏感染提供有效的辅助作用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种用于结核病潜伏感染检测的引物及试剂盒。
[0005] 本发明的技术方案，qRT-PCR技术快速诊断结核病潜伏感染的引物，包括如下引物 中的至少一组引物：
[0006] 第一组：<210〉1，<210〉2。
[0007] 第二组：<210〉3，<210〉4。
[000引 第Ξ组：<210〉5，<210〉6。
[0009] qRT-PCR技术快速诊断结核病潜伏感染的试剂盒，其组成成分包括:SYBR酶、cDNA 和下列引物引物中的至少一组：
[0010] 第一组：<210〉1，<210〉2。
[0011] 第二组：<210〉3，<210〉4。
[0012] 第Ξ组：<210〉5，<210〉6。
[0013] 结核潜伏感染者的静脉血经结核分枝杆菌特异性抗原刺激后TNF-a、IFN-r、比-2 的 mRNA 表达水平 2.5-4.1、8.1-13.2、184.2-220.6。
[0014] 与现有技术相比，本发明引物和试剂盒根据结核分歧杆菌的特异基因序列而定， 寻找具有易于预测的、检测的、发展价值的TNF-a、IFN-丫、比-2因子，其在结核病患者、结核 潜伏感染者和健康人中的mRNA表达水平，特异性、敏感性高，而且用血量少、用时短等特点， 利用巧光定量PCR方法、使用本发明引物和试剂盒进行检测时，只需40化1外周静脉血，有利 于用于筛查老年人及儿童结核分枝杆菌潜伏感染，整个过程耗时小于8小时。本发明对于结 核病潜伏感染检测及临床用药都有较高的参考价值，可W广泛推广，为结核病防控工作提 供技术支持。
【具体实施方式】
[0015] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对 本发明作进一步的详细说明。
[0016] W下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能W此来限制本发明 的保护范围。
[0017]实施例1 [001引检测方法：
[0019] (1)采集受试者(潜伏感染者)外周静脉血:肝素钢抗凝处理，所有血样，一经采集， 立即送检。取40化1分为两份，每份20化1。一份加入合成的特异性抗原化SAT-6、CFP-10、 TB7.7)，使其终浓度均达到20μg/ml，另一份不加任何抗原刺激物作为对照组，是基础分泌 水平值，两份血样幹旋震荡后，放入37 °C溫箱解育4小时。
[0020] (2)血总RNA的提取:血样解育4小时后，用RNeasy Mini Kit(Qiagen)试剂盒按说 明书逐步提取总RNA。为减少RNA降解，离屯、机溫度设定为4°C，所有操作在冰袋上进行，并根 据核酸蛋白检测仪检测D260/280紫外吸收率，确定RNA纯度，琼脂糖凝胶电泳观察其完整 性。
[002。 （ 3)逆转录反应：首先冰上预冷无酶PCR管，吸取RNA 5yg RNA，严格按照试剂盒 (TIANScript RT Kit-TIANScript cDNA第一链合成试剂盒)说明书，逐步逆转录合成cDNA。 逆转录总体系为20μ1，比例为化 1 oligo(dT)15,2yl Super Pure dNTPs，5.5yl 脚ase- 化ee dd 肥0,4μ1 5 XFirst-Strand Buffer，0.扣 1 RNasinayl TIANScript M-MLV。因检 测因子较多，逆转录完成后，将cDNA用无酶水稀释到50μ1，混匀，-20°C保存备用。
[0022] (4)巧光定量PCR检测:选用ABI公司的SYBR酶，反应体系为SOiiUSYBR 10化，肥0 6 化，上游引物化L，下游引物化L，cDNA化L，用β-actin做内参。使用ABI公司的750(Fast巧光 定量检测仪，40个循环，参数如下：50 °C lmin20s; 95 °C lOmin; 95 °C 15s; 60 °C Imin，溶解曲线 参数:95°C15s;60°Clmin 95°C30s;60°C15s。检测细胞因子的量= 2-Δ Act(A ACt=ACt 蛋白刺激组-A Ct空白对照组）。
[0023] 实施例2
[0024] 检测方法：
[0025] (1)采集受试者(健康者)外周静脉血:肝素钢抗凝处理，所有血样，一经采集，立即 送检。取40化1分为两份，每份20化1。一份加入合成的特异性抗原巧SAT-6、CFP-10、TB7.7)， 使其终浓度均达到20μg/ml，另一份不加任何抗原刺激物作为对照组，是基础分泌水平值， 两份血样幹旋震荡后，放入37°C溫箱解育4小时。
[0026] (2)血总RNA的提取:血样解育4小时后，用RNeasy Mini Kit(Qiagen)试剂盒按说 明书逐步提取总RNA。为减少RNA降解，离屯、机溫度设定为4°C，所有操作在冰袋上进行，并根 据核酸蛋白检测仪检测D260/280紫外吸收率，确定RNA纯度，琼脂糖凝胶电泳观察其完整 性。
[0027] (3)逆转录反应：首先冰上预冷无酶PCR管，吸取RNA扣g RNA，严格按照试剂盒 (TIANScript RT Kit-TIANScript cDNA第一链合成试剂盒)说明书，逐步逆转录合成cDNA。 逆转录总体系为20μ1，比例为化 1 oligo(dT)15,2yl Super Pure dNTPs，5.5yl 脚ase- 化ee dd 肥0,4μ1 5 XFirst-Strand Buffer，0.扣 1 RNasinayl TIANScript M-MLV。因检 测因子较多，逆转录完成后，将cDNA用无酶水稀释到50μ1，混匀，-20°C保存备用。
[002引 （4)巧光定量PCR检测:选用ABI公司的SYBR酶，反应体系为20化，SYBR 10化，肥0 6 化，上游引物化L，下游引物化L，cDNA化L，用β-actin做内参。使用ABI公司的750(Fast巧光 定量检测仪，40个循环，参数如下：50 °C lmin20s; 95 °C lOmin; 95 °C 15s; 60 °C Imin，溶解曲线 参数:95°C15s;60°Clmin 95°C30s;60°C15s。检测细胞因子的量= 2-Δ Act(A ACt=ACt 蛋白刺激组-A Ct空白对照组）。
[0029] 实施例3
[0030] 检测方法：
[0031] (1)采集受试者(活动性肺结核患者)外周静脉血:肝素钢抗凝处理，所有血样，一 经采集，立即送检。取40化1分为两份，每份200μ1。一份加入合成的特异性抗原化SAT-6、 CFP-10、ΤΒ7.7)，使其终浓度均达到20μg/ml，另一份不加任何抗原刺激物作为对照组，是基 础分泌水平值，两份血样幹旋震荡后，放入37°C溫箱解育4小时。
[0032] (2)血总RNA的提取:血样解育4小时后，用RNeasy Mini Kit(Qiagen)试剂盒按说 明书逐步提取总RNA。为减少RNA降解，离屯、机溫度设定为4°C，所有操作在冰袋上进行，并根 据核酸蛋白检测仪检测D260/280紫外吸收率，确定RNA纯度，琼脂糖凝胶电泳观察其完整 性。
[0033] (3)逆转录反应：首先冰上预冷无酶PCR管，吸取RNA扣g RNA，严格按照试剂盒 (TIANScript RT Kit-TIANScript cDNA第一链合成试剂盒)说明书，逐步逆转录合成cDNA。 逆转录总体系为20μ1，比例为化 1 oligo(dT)15,2yl Super Pure dNTPs，5.5yl 脚ase- 化ee dd 肥Ο，4μ1 5 XFirst-Strand Buffer，0.扣 1 RNasinayl TIANScript M-MLV。因检 测因子较多，逆转录完成后，将cDNA用无酶水稀释到50μ1，混匀，-20°C保存备用。
[0034] (4)巧光定量PCR检测:选用ABI公司的SYBR酶，反应体系为SOiiUSYBR 10化，肥0 6 化，上游引物化L，下游引物化L，cDNA化L，用β-actin做内参。使用ABI公司的750(Fast巧光 定量检测仪，40个循环，参数如下：50 °C lmin20s; 95 °C lOmin; 95 °C 15s; 60 °C Imin，溶解曲线 参数:95°C15s;60°Clmin 95°C30s;60°C15s。检测细胞因子的量= 2-Δ Act(A ACt=ACt 蛋白刺激组-A Ct空白对照组）。
[0035] 实施例一至实施例Ξ的实验结果对比如下：
[0036] 用SPSS20.0做单因素方差分析显示，Ξ个人群中运3个细胞因子mRNA表达水平，方 差齐性，整体比较