一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法
【专利摘要】一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法，是以茶树咖啡因合成酶基因为基础设计两条靶序列T1和T2；再分别构建靶序列T1和和T2的sgRNA表达盒；再将双元表达载体pYLCRISPR/Cas9P35S?H与上述T1sgRNA表达盒及T2sgRNA表达盒进行酶切?连接反应，使T1sgRNA表达盒与T2sgRNA表达盒连接后插入该双元表达载体中，从而获得CRISPR/Cas9基因组编辑载体。本发明以茶树咖啡因合成酶为例，联合采用常规PCR、Overlapping PCR和Golden Gate Cloning技术，构建了包含茶树咖啡因合成酶双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体，为CRISPR/Cas9基因编辑技术在茶树中的应用奠定了坚实基础，同时对其它植物CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建提供了技术支撑。
【专利说明】
一种茶树咖啡因合成酶CRI SPR/Cas9基因组编辑载体的构建 方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组 编辑载体的构建方法。
【背景技术】
[0002] 茶树是我国重要的木本经济作物，在我国国民经济中占有重要地位。我国不仅是 世界上茶叶资源最丰富的国家，也是世界上茶叶资源最大的生产国、消费国和贸易国。然 而，我国具有多抗及高品质的优良茶树品种不多。虽然我国一直非常重视茶树的品种改良 工作，但由于茶树具有生长周期长、自交不亲和的特性，使得采用常规育种技术难以实现茶 树育种工作取得突破性的进展。近年来分子育种及基因工程等现代分子生物学技术在水 稻、西红柿、马铃薯等农作物品种改良中发挥了重要作用，也为茶树育种提供了新的途径。 所以，茶树分子生物学研究成为了茶叶科学中最活跃和进展最快的一个领域。近年来，茶树 转录组测序工作取得了重要进展，目前Genbank已收录了约35万条茶树mRNA序列，几乎涵盖 了茶树中所有功能基因编码序列。此外，我国茶树的全基因组测序工作也于几年前在数家 单位开始启动，并已相继完成，茶树全基因组序列将会在短期内释放。然而，像其它植物一 样，面对大量的基因序列，我们对其功能了解却是非常缺少，从而制约了基因资源的利用。 因此，确定茶树新基因的功能并高效利用新基因是未来茶树分子生物学研究中一个非常重 要的主题，也就是说茶树后基因组时代即将降临。随着现代分子生物技术的突飞猛进，新型 基因组编辑技术CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9)将会在茶树功能基因研究中发挥重要作用，预计 将成为茶树后基因组时代不可或缺的研究工具。
[0003] 基因组定点编辑技术是分子育种、基因的功能研究和遗传改造等重要工具，是通 过某种途径对基因组DNA特定位点进行改造的一种手段。迄今为止，应用时间比较长的基因 组编辑技术有锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸 (Transcription activator-likeeffector nucleases，TALEN)技术。但由于这两项技术 DNA结合结构域的改造较为复杂，对每一个基因位点的编辑都需要重新设计、合成和组装2 个核酸酶，载体构建困难，成为限制其发展的瓶颈。科学家一直在寻找精确而简单的基因组 编辑方法，直到2013年发现了〇?13?1?/^ &89技术。〇?13?1?/^&89技术是通过一段1?熟来识别靶 位点，因而在设计和构建上更加简单，只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性编辑。 CRISPR/Cas9技术的出现，立即在整个生命科学领域掀起了席卷世界的一股"风暴"，短短几 年内该技术迅速应用于世界各地的实验室，并成为基因组定点编辑的首选技术。
[0004] CRISPR/Cas广泛存在于古生菌和细菌的基因组中，属自身免疫系统，可降解入侵 的病毒或质粒DNA。在该免疫系统中，Cas蛋白（CRISP-associated protein)含有两个核酸 酶结构域，可以分别切割两条DNA链，切割后DNA双链断裂从而使入侵的外源DNA降解。 CRISPR/Cas系统的组成结构比较固定，由CRISPR序列与Cas基因家族组成，其中CRISPR由一 系列高度保守的重复序列(Repeat)与间隔序列（Spacer)相间排列组成，间隔序列可特异识 别外源DNA。在CRISPR序列附近存在高度保守的CRISPR相关基因，这些基因编码的蛋白具有 核酸酶功能，可以对DNA序列进行特异性切割。
[0005] CRISPR系统分为3种类型，现在常用的CRISPR/Cas系统由类型n系统改造而来。类 型II系统的特征性蛋白为Cas9蛋白，具有加工产生CRISPR RNA(crRNA)和切割双链DNA功 能。crRNA(CRI SPR-derived RNA)通过喊基配对与tracrRNA( trans-activat ing RNA)结合 形成tracrRNA/crRNA复合体，此复合体一旦形成就能引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对 的序列靶位点剪切双链DNA。而tracrRNA/crRNA复合体可通过人工设计，融合crRNA与 tracrRNA形成sgRNA(single-guided RNA)，sgRNA足以引导Cas9对DNA的定点切割。sgRNA可 以通过载体表达或者化学合成后与Cas9蛋白共同进入细胞，对特异DNA序列剪切，从而促使 DNA发生NHEJ(nonhomologous end-joining)导致的基因缺失或同源重组，实现基因敲除， 结合参见图1<XRISPR-Cas9体系的RNA-DNA识别机制为选择性基因组编辑提供了一个简便 而强大的工具。来自Streptococcus pyogenes的Cas9由于识别序列仅为2个碱基(GG)，几乎 可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。Cas9蛋白在目前测试过的几乎 所有生物和细胞中均有活性，包括细菌、酵母、植物、鱼、以及哺乳动物细胞。该体系其中一 个最重要的优势是Cas9蛋白可在多个不同的sgRNA的引导下同时修饰多个基因组靶点。
[0006] 目前植物CRISPR/Cas9系统已日趋完善，已在十多种植物中成功实现了定点基因 组编辑，除了在本氏烟草拟南芥等模式植物上获得了成功，很快在小麦、玉米、水稻、高粱、 西红柿以及甜橙等作物上也成功实现了 CRISPR/Cas9的应用。最近，先后利用CRISPR/Cas9 技术实现了木本植物杨树和观赏植物牵牛花基因组的定点编辑，将CRISPR/Cas9系统在植 物中应用推上了新的领域。
[0007] 然而，到目前为止尚未见有关CRISPR/Cas9技术在茶树上的应用报道，其中一个重 要的原因是针对茶树的CRI SPR/Cas9基因编辑载体构建技术尚不完善。本发明以茶树中咖 啡因合成酶基因为例，建立了茶树CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法，为CRISPR/Cas9 基因编辑技术在茶树中的应用奠定了坚实基础。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是:针对上述现有技术的不足，提供一种茶树咖啡因 合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法，为CRISPR/Cas9基因编辑技术在茶树中的 应用奠定了坚实基础。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种茶树咖啡因合成酶 CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法，该方法步骤如下：
[0010] 1)以茶树咖啡因合成酶基因为基础设计两条靶序列，其中：
[0011] 靶序列T1 为：5'-CTCACAAGCAGAGAAGGCT-3'（SEQ ID No. 1)，靶序列T2为5'_ ATATCACTGCTGTGGCAGC-3'（SEQ ID No.2);
[0012] 2)构建靶序列T1和和T2的sgRNA表达盒：
[0013]以PYLgRNA-AtU3d-LacZ质粒为模板进行第一轮PCR反应，获得sgRNA表达的启动子 片段和连接T1靶序列的gRNA片段，再通过重叠PCR(0verlapping PCR)反应将该启动子片段 与gRNA片段连接，以组装成TlsgRNA表达盒；
[0014] 以pYLgRNA-AtU3b质粒为模板进行第一轮PCR反应，获得sgRNA表达的启动子片段 和连接T2靶序列的gRNA片段，再通过重叠PCR反应将该启动子片段与gRNA片段连接，以组装 成T2sgRNA表达盒；
[0015] 3)利用限制性内切酶Bsal-HF和连接酶T4DNA ligase，将双元表达载体 pYLCRISPR/Cas9P35S-H与上述TlsgRNA表达盒及T2sgRNA表达盒进行酶切-连接反应，使 TlsgRNA表达盒与T2sgRNA表达盒连接后插入该双元表达载体中，从而获得CRISPR/Cas9基 因组编辑载体。
[0016] 上述步骤2)中构建TlsgRNA表达盒的第一轮PCR反应包括二个PCR反应，第一个PCR 反应使用的引物序列如SEQ ID No. 3和SEQ ID No.6所示，第二个PCR反应使用的引物序列 如5￡0 10如.5和5￡0 10如.4所示；重叠？〇?反应使用的引物序列如5￡0 10如.9和5￡0 10 No.10；
[0017] 构建T2sgRNA表达盒的第一轮PCR反应包括二个PCR反应，第一个PCR反应使用的引 物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.8所示，第二个PCR反应使用的引物序列如SEQ ID No.7 和SEQ ID No.4所示；重叠PCR反应使用的引物序列如SEQ ID No. 11和SEQ ID No. 12所示。 [0018] 所述步骤2)中构建TlsgRNA和T2sgRNA表达盒的第一轮PCR反应时的反应体系为： H20 13 ? 65yL、10 X Buffer2yL、2mM的dNTP 1 ? 5yL、25mM的MgS〇4〇 ? 6yL、5mM的正向引物0 ? 6yL、 5mM的反向引物0.6yL、模板0.75yL、lU/yL的KOD-Plus酶0.3yL，总体积20yL;反应程序：94°C 预变性 3min，30 个循环，94°C 20s，58 °C 20s，68 °C 25s。
[0019] 所述步骤2)中构建TlsgRNA和T2sgRNA表达盒的重叠PCR反应时的反应体系： H2019 ? 4此、10 X Buffer 3此、2mM的dNTP3yL、25mM的MgSCkl ? 2此、10mM的正向引物0 ? 9yL、 10mM的反向引物0.9yL、稀释10倍的第一轮PCR产物lyL、lU/yL的KOD-Plus酶0.6yL，总体积 30yL;反应程序：94°C 预变性 5min，22 个循环，94°C 25s，58 °C 25s，68 °C 30s。
[0020] 本发明首次建立了茶树CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法，为CRISPR/Cas9基 因编辑技术在茶树中的应用奠定了坚实基础。
【附图说明】
[0021] 图1是CRISPR/Cas9工作原理图。
[0022] 图2是sgRNA设计；"一"连接处含有内含子序列，GG表示PAM识别位点，下划线标记 的序列为候选靶序列。
[0023] 图 3是.pYLgRNA-AtU3d-LacZ，pYLgRNA-AtU3b 和 pYLCRI SPR/Cas9P35S-H 质粒电泳 图。
[0024] 其中：a表不.pYLgRNA-AtU3d_LacZ质粒；b表不pYLgRNA_AtU3b质粒；c表不 pYLCRISPR/Cas9P35S-H 质粒。
[0025]图4是sgRNA表达盒的构建流程图。
[0026]图5是第一、二轮PCR反应产物电泳图。
[0027] 其中:M为marker，Tl为针对靶序列T1的PCR，T2为针对靶序列T2的PCR，T1P和T2P表 示第一轮PCR产物混合后进行了纯化。
[0028] 图6是Golden gate cloning组装茶树CRISPR/Cas9基因组编辑载体。
[0029] 图7是连接产物及质粒酶切电泳图。
[0030] 其中：L为连接产物，TCA为TCA基因编辑载体，C表示pYLCRI SPR/Cas9P35S-H空载 体，M为marker。
[0031]图8是TCA基因编辑载体部分测序图。
[0032]图9是TCA基因编辑载体测序结果。
[0033] 其中：深灰色背景为AtU3d启动子序列，浅灰色背景为AtU3b启动子序列，前后加黑 斜体序列分别为靶序列T1和靶序列T2,下划线标记的序列为sgRNA的3'区域保守结构序列。
【具体实施方式】 [0034] 1.材料与方法
[0035] 双元表达载体pYLCRISPR/Cas9P35S-H，GeneBank登录号为AY310901，是在双元载 体质粒pCAMBIA1300(ACCESSI0N:AF234296)的基础上进行改造而来的，由花椰菜花叶病毒 (CaMV)35S启动子驱动Cas9p序列的表达。该质粒在E.coli T0P10F'（Laclq)菌株繁殖，该菌 株Laclq基因型产生的阻碍蛋白可抑制ccdB大肠杆菌致死基因的表达。植物CRISPR/sgRNA 载体pYLgRNA-AtU3d-LacZ(KR029100 ? 1)和pYLgRNA-AtU3b(KR029097 ? 1)，为植物CRISPR/ Cas9基因编辑载体的中间载体，分别提供small nuclear(sn)RNA U3d和U3b启动子序列，驱 动sgRNA的表达并保证转录出的sgRNA停留在细胞核中与Cas9结合，且二者均提供长度为 57nt的sgRNA3'区域保守结构序列，可与靶基因的20nt靶序列组装成sgRNA。此外，pYLgRNA-AtU3d_LacZ还提供了LacZ标记基因（198bp)的表达元件，可在含有X-gal的培养基产生蓝色 菌斑筛选阳性克隆。
[0036] 本文所需引物序列如表1所示，引物合成与序列测序均由上海生工生物工程技术 服务公司完成，测序引物使用TCA-SP-L2和TCA-SP-R-C。
[0037]表1所需引物序列
[0039] 2 .sgRNA序列设计及分析
[0040]为提高打靶效率针对TCS基因设计2个靶点，设计靶点遵循如下原则：目的基因的 正链和负链靶点的打靶效率大致相同，都可以设计靶点；靶点的GC%尽量不要低于40%，靶 点序列6(：%偏高(50-70%)有较高的打靶效率;靶点内（按5-吧0如6-3方向）不要有连续4个 以上的T，以防RNA Pol III将其作为转录终止信号；虽然非特异打靶(脱靶)对植物基因打 靶不是很重要的问题，但应进行靶点特异性分析，用靶点+NGG(前后各加几十碱基)与茶树 转录组做blast分析，避免使用与同源序列差异少于5个碱基的靶点(在切点附近和PAM可有 2个碱基差异就具有特异性）。把靶点序列连接到s g R N A序列的5 '端（靶序列+ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT TTTTTT)，做二级结构分析。
[0041 ] 3 ?采用常规PCR和Overlapping PCR构建sgRNA表达盒
[0042] 3.1Target lsgRNA(TlsgRNA)构建
[0043] 3.1.1第一轮 PCR
[0044] 以2-5ng PYLgRNA-AtU3d-LacZ质粒为模板分别进行两个PCR反应，在第一个PCR反 应中使用引物TCA-U-F(上游引物）和TCAU3dT 1 (下游引物），第二个PCR反应使用引物 TCAgRT 1 (上游引物)和TCA-gR-R(下游引物）。第一个PCR和第二个PCR反应分别在两个PCR管 中进行，采用相同的PCR反应体系和相同的PCR反应程序。将第一个和第二个PCR反应的产物 混合后，取3yL PCR产物，电泳检查产物长度是否符合预期。
[0045] 上述PCR反应体系，总体积20yL:H20 13.65yL、10XBuffer 2yL、2mM的dNTP1.5yL、 25mM的 MgS040.6yL、5mM的正向引物0.6yL、5mM的反向引物0.6yL、模板0.75yL、lU/yL 的 K0D-Plus酶0.3yL〇
[0046] 上述 PCR 反应程序：94°C 预变性 3min，30 个循环，94°C 20s，58 °C 20s，68 °C 25s。
[0047] 3.1.2第二轮 PCR
[0048] 取第一轮PCR中的二次PCR反应产物混合后所得的第一轮PCR产物U3dTl-gRNAlyL， 用H20稀释10倍;再取lyL稀释的第一轮PCR产物U3dTl-gRNA作为模板，以TCA-Pps-R-C和 TCA-Pgs-GG2分别作为上、下游引物，PCR扩增U3dTl-gRNA。取3yL PCR产物，电泳检查产物长 度是否符合预期，并估计样品的大致浓度。
[0049]采用的PCR反应体系，总体积30yL:H20 19.4yL、10XBuffer 3yL、2mM的dNTP3yL、 25mM的MgSCk 1.2yL、10mM的正向引物0.9yL、10mM的反向引物0.9yL、稀释10倍的第一轮PCR 产物 lyL、lU/yL 的KOD-Plus 酶0 ? 6yL。
[0050]采用的 PCR 反应程序：94°C 预变性 5min，22 个循环，94°C 25s，58 °C 25s，68 °C 30s。
[0051 ] 3.2Target 2sgRNA(T2sgRNA)构建 [0052] 3.2.1第一轮 PCR
[0053] 分别取2-5ng pYLgRNA-AtU3b质粒作为模板进行二个PCR反应，在第一个PCR反应 中使用引物TCA-U-F (上游引物)和TCAU3bT2 (下游引物），第二个PCR反应使用引物TCAgRT2 (上游引物)和TCA-gR-R(下游引物）。TCA-U-F/TCAU3bT2扩出U3bT2序列，TCAgRT2/TCA-gR-R 扩出T2sgRNA序列。反应完毕，将两个反应的产物混合，取3yLPCR产物，电泳检查产物长度是 否符合预期。
[0054] 采用的 PCR 反应体系，总体积 20yL:H2013.65yL、10XBuffer2yL、2m]\^dNTP1.5yL、 25mM的MgSCkO. 6yL、5mM的正向引物0.6yL、5mM的反向引物0.6yL、模板0.7 5yL、1U/yL的K0D-Plus酶0.3yL〇
[0055] 采用的 PCR 反应程序：94°C 预变性 3min，30 个循环，94°C 20s，58 °C 20s，68 °C 25s。
[0056] 3.2.2第二轮卩0?
[0057] 取第一轮PCR中的二次PCR反应产物混合后所得的第一轮PCR产物U3bT2-gRNAlyL， 用H20稀释10倍;再取1此稀释的第一轮PCR产物U3bT2-gRNA作为模板，以TCA-Pps-GG2和 TCA-Pgs-L-C为引物，PCR扩增U3bT2-gRNA。取3yL电泳检查产物长度是否符合预期。
[0058] 采用的？^?反应体系，总体积30此:112〇19.4此、10\8吐€613此、2111]\1的(1阶？3此、 25mM的MgSOU . 2yL、10mM的正向引物0.9yL、10mM的反向引物0.9此、稀释10倍的第一轮PCR 产物 lyL、lU/yL 的KOD-Plus 酶0 ? 6yL。
[0059] 采用的 PCR 反应程序：94°C 预变性 5min，22 个循环，94°C 25s，58 °C 25s，68 °C 30s。
[0060] 4 ?组装 sgRNA 表达盒到 pYLCRISPR/Cas9 载体
[0061 ] 4.1双元表达载体pYLCRISPR/Cas9P35S-H与sgRNA表达盒的酶切-连接反应
[0062] 于上述通过常规PCR和Overlapping PCR构建好的TlsgRNA和T2sgRNA表达盒中分 别加入9倍体积的无水乙醇混勾，室温下12000rpm/min离心10min，去上清，加入lmL70%质 量浓度的乙醇洗沉淀1次，室温下12000rpm/min离心3min，去上清，37°C干燥30min，各加入 30此无菌水。使用双元表达载体与sgRNA表达盒的酶切-连接反应体系进行酶切、连接。反应 程序:37°C孵育lmin，16°C孵育lmin，30个循环，最后75°C灭活内切酶5min。酶切-连接产物 加入9倍体积的无水乙醇混勾，室温下12000rpm/min离心10min，去上清，加入lmL70%质量 浓度的乙醇洗沉淀1次，室温下12000rpm/min离心3min，去上清，37°C干燥30min，各加入lOy L无菌水。
[0063] 上述提及的双元表达载体与sgRNA表达盒的酶切-连接反应体系：10 X CutSmart Buffer 3yL、10mM ATP 3yL、pYLCRISPR/Cas9质粒 160ng、TlsgRNA表达盒30ng、T2sgRNA表达 盒30ng、BsaI_HF lyL、T4DNA ligase 0.2iiL、H2〇加至30此〇 [0064] 4.2酶切-连接产物的转化与质粒提取
[0065] 从-80°C冰箱中取出50yL DH 5a感受态细胞，放置在冰上直至融化，取8yL连接产 物加入DH 5a感受态细胞离心管，轻轻小弹离心管使之混匀，冰浴20min，于42°C水浴中热击 90s后，迅速将管子移到冰中放置2min，加入平衡至室温的750yLLB培养基，37°C振荡培养 45min，取 100yL菌液涂到含50yg/mLKan、0.5mM IPTG和40yg/mL X-gal的LB平板，将平板于 37 °C倒置过夜培养，挑取蓝斑菌落，于3mL含50yg/mLKan的LB液体培养基中震荡培养过夜， 使用质粒提取试剂盒提取质粒，使用Mlu頂每切验证，挑取正确质粒进行测序验证。
[0066] 5 ?结果与分析
[0067] 5.1sgRNA 设计
[0068] sgRNA序列全长97nt，分为两部分，5'决定靶序列的20nt种子序列（seed sequence)和3'区域为保守的结构序列。因此构建针对特定革EU立点的sgRNA，只需要克隆决 定革G序列的5 '端20nt。从genbank中下载茶树TCA基因组序列和cDNA序列，分析其内含子所 在区域。结果表明（如图2所示），TCS1基因含3个内含子。在此基础上搜寻TCA的CRISPR/Cas9 靶序列，结果共搜寻到18个不含内含子的候选靶序列。对18个候选靶序列进行结构分析，靶 序列与sgRNA序列产生连续配对7bp以上会抑制其与染色体DNA靶序列结合靶点，因此要避 免使用连续配对7bp以上的靶序列。分析结果表明，在TCA1基因0RF内的靶序列 "CTCACAAGCAGAGAAGGCT"（设为靶序列T1，如SEQ ID No. 1所示）和非编码区内靶序列 "八丁厶1^^〇'6(^6了660460；'（设为靶序列了2，如3￡0 10如.2所示)较为理想，能作为881?祖序列 的seed sequence〇
[0069] 5 ? 2pYLgRNA-AtU3d-LacZ、pYLgRNA-AtU3b 和 pYLCRISPR/Cas9P35S-H 质粒提取
[0070] 将分别含有 PYLgRNA-AtU3d-LacZ、pYLgRNA-AtU3b 和 pYLCRISPR/Cas9P35S-H 质粒 的菌划线活化，挑取单菌摇菌，采用质粒提取试剂盒提取质粒。电泳结果表明，提取的质粒 符合下一步实验的要求。
[0071] 5.3sgRNA表达盒的构建
[0072] sgRNA需要在植物细胞内合成从而指导Cas9蛋白编辑革巴基因，而sgRNA的合成是通 过sgRNA表达盒来完成，sgRNA表达盒由启动子序列和gRNA序列组成。pYLgRNA载体 (PYLgRNA-AtU3d-LacZ、pYLgRNA-AtU3b)提供了不同的snRNA启动子可在植物细胞核内转录 gRNA，并使gRNA停留在细胞核内发挥其功能。此外，pYLgRNA载体还提供gRNA中保守序列。因 此，以pYLgRNA质粒为模板，通过常规PCR可以获得snRNA启动子序列和gRNA中保守序列，而 gRNA中5 '段的种子序列在引物合成时导入，联合应用常规PCR和overlapping PCR将启动子 序列和gRNA序列组装在一起（如图4)。如图5所示，针对靶序列T1的第一轮PCR获得了一个 360bp和一个130bp左右的片段，分别为U3d启动子和连接T1靶序列的gRNA;而针对靶序列T2 的第一轮PCR获得了一个380bp和一个130bp左右的片段，分别为U3b启动子和连接T2靶序列 的gRNA;针对靶序列T1的第二轮PCR将U3d启动子片段和gRNA片段2个分离的片段连接在一 起组装成TlsgRNA表达盒;针对靶序列T2的第二轮PCR将U3b启动子片段和gRNA片段2个分离 的片段连接在一起组装成T2sgRNA表达盒。
[0073] 5.4TlsgRNA和T2sgRNA表达盒的拼接及与Cas9双元表达载体的组合
[0074] TlsgRNA和T2sgRNA两个单独的表达盒构建好后，需要将两个表达盒拼接在一起， 并且插入Cas9双元表达载体中，以便通过农杆菌的介导整合到茶树基因组中，从而在茶树 细胞内进彳丁表达，获得Cas9和gRNA，进而对目标基因进彳丁编辑。我们应用Golden gate cl on ing技术，一步完成sgRNA表达盒的拼接及与Cas9双元表达载体的组合，从而获得 CRISPR/Cas编辑载体（图6)。如图7所示，酶切、连接产物可见一条980bp左右的电泳条带，表 明T1 sgRNA和T2sgRNA表达盒连接成功，同时还可见一条MOOObp的电泳条带，说明T1 sgRNA 和T2sgRNA表达盒可能已组装进入pYLCRI SPR/Cas9P35S-H双元表达载体。连接产物转化DH5 a后摇菌提取质粒，以Mlu頂每切，结果如图7所示，可见两条电泳条带，其中一条950bp左右 的条带为TlsgRNA和T2sgRNA连接片段，而pYLCRISPR/Cas9P35S-H双元表达载体未见950bp 左右的电泳条带，说明酶切、连接成功，获得了 TCA CRISPR/Cas9基因编辑载体。
[0075] 5.5测序验证11^0?13?1?/^389基因编辑载体
[0076]为了进一步验证TCA CRISPR/Cas9基因编辑载体是否构建成功，将获得的10个质 粒送上海生物工程技术有限公司测序，测序结果(如图8)表明，TlsgRNA和T2sgRNA表达盒构 建成功，在119bp处检测到Tl，T2靶序列，紧接靶序列后检测到gRNA保守序列的存在，同时在 T1和T2靶序列上游分别检测到U3d和U3b启动子序列，在TlsgRNA表达盒上游T2sgRNA表达盒 下游均检测到了pYLCRISPR/Cas9P35S-H双元表达载体序列，结合参见图9。测序结果表明： TlsgRNA表达盒和T2sgRNA表达盒构建成功，并成功组装入pYLCRISPR/Cas9P35S-H双元表达 载体，证实TCA CRISPR/Cas9基因编辑载体构建成功。
【主权项】
1. 一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法，其特征在于，该方 法步骤如下： 1 )以茶树咖啡因合成酶基因为基础设计两条靶序列，其中靶序列T1为：5'- 2) 构建靶序列T1和和T2的sgRNA表达盒： 以PYLgRNA-AtU3d-LacZ质粒为模板进行第一轮PCR反应，获得sgRNA表达的启动子片段 和连接T1靶序列的gRNA片段，再通过重叠 PCR反应将该启动子片段与gRNA片段连接，以组装 成T1 SgRNA表达盒； 以pYLgRNA-AtU3b质粒为模板进行第一轮PCR反应，获得sgRNA表达的启动子片段和连 接T2靶序列的gRNA片段，再通过重叠 PCR反应将该启动子片段与gRNA片段连接，以组装成 T2sgRNA表达盒； 3) 利用限制性内切酶Bsal-HF和连接酶T4DNA ligase，将双元表达载体pYLCRISPR/ Cas9P35S-H与上述TlsgRNA表达盒及T2sgRNA表达盒进行酶切-连接反应，使TlsgRNA表达盒 与T2sgRNA表达盒连接后插入该双元表达载体中，从而获得CRISPR/Cas9基因组编辑载体。2. 如权利要求1所述的一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方 法，其特征在于，所述步骤2)中构建T1 sgRNA表达盒的第一轮PCR反应包括二个PCR反应，第 一个PCR反应使用的引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID如.6所示，第二个?0?反应使用的引 物序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.4所示；重叠 PCR反应使用的引物序列如SEQ ID No.9和 SEQ ID No.10； 构建T2sgRNA表达盒的第一轮PCR反应包括二个PCR反应，第一个PCR反应使用的引物序 列如SEQIDNo.3和SEQIDNo.8所示，第二个PCR反应使用的引物序列如SEQIDNo.7和 SEQ ID No.4所示；重叠 PCR反应使用的引物序列如SEQ ID No. 11和SEQ ID No. 12所示。3. 如权利要求2所述的一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方 法，其特征在于，所述步骤2)中构建TlsgRNA和T2sgRNA表达盒的第一轮PCR反应时的反应体 系为：H 20 13 · 65yL、10 X Buffer2yL、2mM的dNTPl · 5yL、25mM的MgS〇4〇 · 6yL、5mM的正向引物 0.6yL、5mM的反向引物0.6yL、模板0.75yL、lU/yL 的KOD-Plus 酶0.3yL，总体积 20yL;反应程 序：94°C 预变性 3min，30 个循环，94°C 20s，58 °C 20s，68 °C 25s。4. 如权利要求2所述的一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方 法，其特征在于，所述步骤2)中构建TlsgRNA和T2sgRNA表达盒的重叠 PCR反应时的反应体 系：H20 19 · 4yL、10 X Buffer 3yL、2mM的dNTP3yL、25mM的MgSOU · 2yL、10mM的正向引物0 · 9μ L、lOmM的反向引物0.9yL、稀释10倍的第一轮PCR产物lyL、lU/yL的KOD-Plus酶0.6yL，总体 积 30yL;反应程序：94°C 预变性 5min，22 个循环，94°C 25s，58 °C 25s，68 °C 30s。
【文档编号】C12N15/66GK105821075SQ201610254568
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】刘硕谦, 唐雨薇, 田娜, 刘丽萍, 王若娴, 梁恒
【申请人】湖南农业大学