一种优化的β-防御素AvBD2基因及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种优化的AvBD2基因及其应用，所述AvBD2基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述AvBD2基因可转化至遗传工程菌种并进行蛋白表达，获得的重组表达蛋白与干酪乳杆菌混合，制成一种新型复合微生态制剂。该复合微生态制剂对畜禽的生产性能、免疫性能、肠道pH、肠道微生物等方面都有改善，有利于促进畜禽的生长，提高免疫力，增加饲料的消化率；在体外抑菌试验中，该复合微生态制剂对肠道致病菌具有较好的抑菌活性；动物实验中，在不添加任何抗生素药物的情况下，显著提高了畜禽的平均日增重和免疫性能，改善了畜禽肠道的菌群环境，促进畜禽的生长。
【专利说明】
一种优化的β-防御素 AvBD2基因及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及的是基因工程技术领域，尤其涉及的是一种优化的β-防御素 AvBD2基 因及其应用。
【背景技术】
[0002] 自20世纪50年代起，抗生素的亚治疗剂量就被添加到饲料中来促进动物的生长。 大量抗生素在养殖业中的滥用，已经导致耐药性细菌不断出现，一些感染性病原体甚至严 重威胁到人类健康和畜牧业的发展。随着人们关注度的不断提高和抗药性病原的传播，欧 洲已经开始禁止在动物饲料中使用抗生素来促进动物生长。因此，寻找一种天然的无污染 的能够替代抗生素的新型饲料添加剂迫在眉睫，它既拥有抗菌功能，又能促进动物生长，以 降低饲养成本。
[0003] 防御素属于抗菌肽家族的一个亚族，是广泛分布于动植物界的一类富含半胱氨酸 的阳离子小肽。防御素具有广谱抗微生物活性，对细菌、真菌、螺旋体、病毒等均有抗性，且 病源微生物不易产生耐药性，是宿主抵抗外来致病性微生物侵袭的重要防线，同时由于其 在动物体的多种不同组织器官中持续性表达，也被认为是动物先天性免疫系统的一部分， 具有重要的生理学功能。其主要特征是6个半胱氨酸残基形成的3对二硫键，成熟肽大约有 38-42个氨基酸，分子质量约为3_4kDa。根据空间结构的不同，防御素可以分为3大类:α-防 御素、防御素和Θ-防御素。禽防御素属于β-防御素类，3对二硫键分别为Cys-1~Cys-5、 〇78-2~〇78-4和〇78-3~〇78-6配对连接形成，富含精氨酸，具有亲水性和亲脂性、特征性0_ 片层结构。迄今为止，已在禽体内发现了 14种β-防御素，这些禽防御素基因被分别命名为 AvBD 1~14。其中禽β-防御素2 (AvBD2)广泛分布于禽的各类器官组织中，尤其在粘液囊、食 道、嗉囊、肝脏和胃等消化系统各器官组织中表达量较高。消化道为动物机体与食源性病原 接触部位，也是其侵入部位。AvBD2具有良好的生物安全性，且具有较强的抗菌活性，能够抑 制或者杀死病原菌，这对禽消化道健康，尤其对防止上消化道感染等机体局部防御和炎症 中起着重要作用。在畜禽生产中可用于防治疾病，促进动物健康养殖，具有潜在的应用和开 发价值，而分子重组技术是蛋白类或肽类产品开发应用的有效途径。
[0004] 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统既具有原核表达系统的表达量高、 可大规模培养的优点，又具有真核表达系统的蛋白翻译后修饰、加工及折叠的优势，且外源 基因的遗传稳定性较好，是目前广泛应用的真核表达系统之一。毕赤酵母表达系统具有很 高的生物安全性，获得包括美国Π )Α在内的广泛认可。毕赤酵母自身分泌很少量的蛋白，易 于异源蛋白的分离纯化，且其分泌的蛋白存在翻译后加工修饰，使之更接近于天然蛋白的 构象和活性，因此更适合真核生物基因的表达。又因其表达水平稳定、发酵工艺成熟等优 点，而成为目前最受欢迎的异源蛋白基因表达系统之一。醇氧化酶A0X1启动子(pAOXl)是 P.pastoris表达中应用较多的启动子，其甲醇诱导性很强。但发酵过程中需要用有毒挥发 性的甲醇作为诱导剂，需要碳源的转换，因而操作不方便，且外源蛋白的生产周期较长。甘 油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(pGAP)是P.pastoris的组成型强启动子，已用来表达许多异源 蛋白，并获得了与pAOXl相似的产量。此外，GAP启动子有许多优势:重组菌发酵过程简单，安 全性高且不需要大量甲醇的储存与运输，更适合大规模发酵生产，具有连续培养的潜能，且 降低了目的蛋白的生产成本。
[0005] 酵母单细胞蛋白作为饲料具有明显的优势，如酵母干物质中蛋白质含量约50%-60% ;酵母菌中含有丰富的酶类，含有β-葡聚糖（57.0%)、甘露聚糖（6.6%)、糖蛋白 (22.0%)和几丁质等活性成分;蛋白质中含有动物机体所必须的各种氨基酸，特别是植物 饲料中缺乏的赖氨酸、蛋氨酸和色氨酸含量较多，生物学价值大大优于植物蛋白质，单细胞 蛋白的消化率高达85%~90%;既对动物具有促生长作用，又可提高机体免疫，对动物而 言，酵母饲料是一种理想的生物活性蛋白质饲料。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种优化的β-防御素 AvBD2基因 及其应用，以提供一种优化的AvBD2基因序列，用于代替抗生素制备新型无污染的禽用生物 饲料添加剂。
[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0008] 本发明提供了一种优化的β-防御素 AvBD2基因，所述AvBD2基因具有如SEQ ID N0: 1所示的核苷酸序列。
[0009] 本发明还提供了一种上述AvBD2基因在作为畜禽生物饲料添加剂中的应用。
[0010]本发明还提供了 一种含有上述AvBD2基因的重组表达载体。
[0011]优选地，所述重组表达载体为整合有AvBD2基因序列的且不含氨苄Amp抗性的pGHK α表达载体。
[0012] 本发明还提供了一种含有上述AvBD2基因的遗传工程菌，所述遗传工程菌含有上 述重组表达载体，或者，所述遗传工程菌的基因组中整合有外源的上述AvBD2基因序列。
[0013] 优选地，所述遗传工程菌为含有上述AvBD2基因的毕赤酵母GS115菌株。
[0014] 本发明还提供了一种利用上述遗传工程菌制备获得的重组表达蛋白，其特征在 于，所述重组表达蛋白的制备方法为：
[0015] (1)将所述遗传工程菌进行发酵，获得发酵液；
[0016] (2)取发酵液的上清，浓缩，获得所述重组表达蛋白。
[0017] 本发明还提供了一种含有上述重组表达蛋白的微生态制剂，所述微生态制剂为由 干酪乳杆菌与所述重组表达蛋白按照体积比1:10混合，其中，所述干酪乳杆菌的浓度为6 X 109CFU/mL，所述重组表达蛋白的浓度为2.6mg/mL_ 5.2mg/mL。
[0018] 本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种优化的β-防御素 AvBD2基 因及其应用，利用该优化的β-防御素 AvBD2基因可用于代替抗生素制备新型无污染的禽用 生物饲料添加剂，即复合微生态制剂。该复合微生态制剂可直接饲喂畜禽，对畜禽的生产性 能、免疫性能、肠道PH、肠道微生物等方面都有改善，有利于促进畜禽的生长，提高免疫力， 增加饲料的消化率。另外，利用AvBD2基因制备的复合微生态制剂在体外抑菌试验中，对肠 道致病菌具有较好的抑菌活性，在体内的动物饲喂实验中，在不添加任何抗生素药物的情 况下，显著提高了畜禽的平均日增重和免疫性能，改善了畜禽肠道的菌群环境，促进畜禽的 生长。
【附图说明】
[0019] 图1为干酪乳杆菌的的生长曲线；
[0020] 图2为重组菌株AvBD2体外抑菌检测；
[0021]图3为不同日龄肉鸡盲肠内容物ERIC-PCR检测结果；
[0022]图4为不同日龄肉鸡回肠内容物ERIC-PCR检测结果。
【具体实施方式】
[0023]下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。
[0024] 实施例1
[0025] 1、材料
[0026] 1.UYH)培养基:包括10g/L的酵母粉，20g/L的蛋白胨B和20g/L的D~无水葡萄糖， 115°C下灭菌15分钟。
[0027] 1.2、MRS培养基：包括10 . Og/L的蛋白胨，8 . Og/L的牛肉粉，4 . Og/L的酵母粉， 20.0 g/L的葡萄糖，2. Og/L的磷酸氢二钾，2. Og/L的柠檬酸氢二胺，5. Og/L的乙酸钠，0.2g/L 的硫酸镁，〇. 〇4g/L的硫酸锰和1.0g/L的吐温~80，25 °C下调节pH值至5.7±0.2，118°(：下灭 菌15分钟。
[0028] 1.3、LB培养基:包括10.0g/L的胰蛋白胨，5.0g/L的酵母浸粉和10.0g/L氯化钠，25 °C下调节pH值至7.0 ±0.1，121 °C下灭菌15分钟。
[0029] 1.4、MD培养基：量取双蒸水800mL，121°C高压灭菌20min，冷却至50~60°C，加入 100mL 10XD、100mL 10XYNB、2mL 500XB。固体培养基加入15g琼脂，制备好的平板置于4 °C保存备用。
[0030] 以上培养基中加入2g/L的琼脂，配制成固体培养基。
[0031] 2、步骤
[0032] 2.1、干酪乳杆菌的培养
[0033]无菌条件下，取干酪乳杆菌冻干菌种，在MRS固体培养基上涂布，37 °C下静置厌氧 培养20h，挑取单菌落，在MRS固体培养基上进一步划线纯化，37°C培养20h后，挑取单菌落， 接种到1 〇〇mL的MRS液体培养基中，37 °C下厌氧静置培养，分别于Oh、2h、4h、6h、8h、10h、12h、 14h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h、38h、40h 取培养菌液，在吸光度 600nm下测定0D值，得到干酪乳杆菌的的生长曲线，所述生长曲线如图1所示，从图1中可以 看出，干酪乳杆菌在24~48h时处于指数生长后期至稳定期后期，取指数生长后期至稳定期 后期的干酪乳杆菌菌液，接种到MRS培养基中，37 °C厌氧静置培养15-24h，获得干酪乳杆菌 培养液，菌液浓度是6 X 108-8 X 108CFU/mL。
[0034] 2.2、GS115/AvBD2的制备
[0035] A、人工合成如SEQ ID N0:1所示的核酸序列，获得优化后的AvBD2基因片段，所述 优化后的AvBD2基因的5'端含有EcoRI酶切位点，在EcoRI酶切位点后面含有6个编码组氨酸 的密码子，在优化后的AvBD2基因的3'端含有Notl酶切位点，基因全长为143bp。
[0036] B、将上述优化后的AvBD2基因插入组成型表达载体pGHKa的EcoRI和Notl位点之 间，获得pGHKa-AvBD2重组质粒，将pGHKa-AvBD2重组质粒用SacI和Bgl Π 双酶切线性化，去 除Amp抗性基因，并且经过CIAP去除磷酸化后，电转化至高效毕赤酵母GS115感受态细胞中。 [0037] C、利用MD平板初筛和菌落PCR鉴定筛选出阳性重组菌株GS115/AvBD2,并经G418抗 性筛选高拷贝重组菌株。通过定点测定菌株浓度确定重组菌株的最佳培养时间。如图2所 示，为重组菌株GS115/AvBD2菌株克隆形态图。
[0038] 2.3、重组表达蛋白的制备
[0039]在相同条件下，对不同拷贝数的上述阳性重组菌株GS115/AvBD2分别进行培养表 达外源蛋白具体为：挑取pGHKa-AvBD2鉴定正确的阳性转化子，分别接种到5mLYPD培养液 中，于28°C200r/min过夜振荡培养。将过夜培养物以10%的比列接种到50mL发酵培养基瓶 中，于28°C 200r/min培养48h。并4°C、12000g离心10min，收集上清液，即获得了重组ΑνΚ)2表 达蛋白。测定培养液中蛋白质浓度，选择出高表达菌株，再利用高表达菌株进行发酵培养， 获得发酵液，此时蛋白表达产物直接分泌到胞外，将发酵液离心，取上清，即为所述重组表 达蛋白。
[0040] 2.4、复合微生态制剂的制备
[0041] 取步骤2.1的指数生长后期至稳定期后期的干酪乳杆菌菌液，与步骤2.3的重组表 达蛋白按照体积比的重组AvBD2酵母工程菌按照体积比1:10混合，获得两种菌液的复合微 生态制剂。
[0042] 3、效果鉴定
[0043] 3.1
[0044]重组AvBD2的体外抑菌试验：挑取指示菌单菌落，接种到5mL LB培养液中，37°C振 荡过夜培养，取l〇yL菌液与45°C的LB培养基混匀，铺到平板内，厚度约3mm，在平板上均匀的 打下4个孔。孔内加入50yL待测样品，37°C培养6~12h，观察孔周围抑菌圈情况。以加入30yL 氨节青霉素(Amp，100yg/mL)或者卡那霉素（Kana，50yg/mL)为阳性对照，以同样处理的 GS115/pGHKa的表达上清浓缩液和PBS为阴性对照。结果分析：采用琼脂扩散法检测重组 AvBD2对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、巴氏杆菌、绿脓假单胞菌和产气肠杆菌是否 有抑菌活性，结果如图3所示。样品孔与抗生素对照孔周围均出现抑菌圈，而以同样处理的 GS115/pGHKa的表达上清浓缩液和PBS加样孔周围未出现抑菌圈。
[0045] 3.2菌液的制备与试验动物的分组
[0046] 干酪乳杆菌按2%的接种量接种于MRS液体培养基中，30°C静置培养42h;重组 AvBD2毕赤酵母组按10 %的接种量接种于发酵培养基中，28 °C、200r/min摇床震荡培养48h; 菌体培养结束后，调节菌液浓度至6 X 108CFU/mL。
[0047] 将60只白羽肉鸡随机分为两组，每组30只。分别为C和T组，C组为空白对照组，T组 为比例为1:10的干酪乳杆菌和重组AvBD2毕赤酵母组的复合制剂组，试验周期为42d。
[0048] 3.3对肉鸡平均日增重的影响
[0049]第一周在饮水中按1:20的比例加入6 X108CFU/mL的乳酸菌、毕赤酵母，第二周开 始在饮水中按1:10的比例加入6X 108CFU/mL的乳酸菌、毕赤酵母，自由采食，自由饮水。 [0050]分别于第1、7、14、21和42日龄对鸡进行称重，称重前12h停料、不停水，第二天清晨 8:00进行空腹称重，计算平均日增重。
[0051 ]计算公式：
[0052] 平均日增重ADG(g)=(试验末期平均体重一初期平均体重）+试验天数
[0053] 检测复合微生态制剂对肉鸡的平均日增重的影响，获得如下表1所示的结果：
[0054]表1:复合微生态制剂对肉鸡的平均日增重的影响
[0055]
[0056]注:对于表格的同一列，字母相同表示无显著差异，字母不同表示有显著性差异， 小写字母表示差异显著，大写字母表示差异极显著 [0057] 3.4对肉鸡免疫器官指标的影响
[0058]试验第7(1、21(1、42(1，每组抽取5只鸡称取体重后颈静脉放血屠宰，分别采摘胸腺、 法氏囊和脾脏并称重，计算免疫器官指数。
[0059] 计算公式:免疫器官指数=免疫器官鲜重(g)+宰前活重(kg)
[0060] 检测复合微生态制剂对不同日龄肉鸡免疫器官指数的影响，获得如下表2所示的 结果：
[0061] 表2:复合微生态制剂对不同日龄肉鸡免疫器官指数的影响
[0062]
[0063] 注:C组为空白对照组，T组为实验组。
[0064]由表1可知，7日龄时，T组肉鸡的脾脏指数显著高于C组(P〈0.05); 21日龄和42日龄 时，两组组肉鸡的脾脏指数未表现出差异(P>〇. 05)。T组肉鸡的胸腺指数和法氏囊指数在三 个日龄均高于C组，且胸腺指数在7日龄和42日龄差异极显著(P〈0.01)，而法氏囊指数在21 日龄差异极显著(P〈〇.01)。以上结果说明，复合微生态制剂虽然在提高肉鸡脾脏指数方面 效果不明显，但在提高肉鸡的胸腺和法氏囊指数方面有明显的效果。
[0065] 3.5ERIC-PCR法检测复合制剂对肉鸡盲肠和回肠菌群的影响：
[0066]取肉鸡盲肠内容物和回肠内容物，利用ERIC-PCR检测盲肠内容物和回肠内容物中 细菌基因组重复序列，获得如图3和4的电泳图，具体实验为：
[0067]以各组肉鸡粪样作为总DNA模板，进行ERIC-PCR指纹图谱分析肠道菌群结构。参照 ERIC - PCR文献合成引物（上游引物ERIC -1: ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC和下游引物ERIC - 2: AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG)，用于肠道杆菌ERIC序列的PCR扩增。
[0068] 3.5.1样品的采集
[0069] 试验第7(1、21(1、42(1，每组抽取5只鸡，进行颈静脉放血处死，迅速剖腹取盲肠及回 肠中端内容物。
[0070] 3.5.2样品的预处理
[0071]⑴于无菌条件下，将取出的盲肠及回肠内容物分别混匀，各取出约2g粪样，分别加 入10mL灭菌TE缓冲液，漩涡震荡清洗，静置3min。
[0072] ⑵取上清液于干净的10mL离心管中，4°C，400rpm离心10min，取上清。
[0073]⑶将上清转入干净的10mL离心管中，加入适量的TE缓冲液，漩涡震荡3min，充分悬 浮清洗菌体，600rpm离心3min，取上清。
[0074] ⑷将上清8000rpm离心15min，弃上清，加入适量TE缓冲液重悬菌体。
[0075] (5)8000rpm离心15min，弃上清，将沉淀转入灭菌的2mL离心管中。
[0076] (6)加入700yL，-20°C预冷的丙酮，充分漩涡震荡清洗沉淀，8000rpm离心15min，弃 上清取沉淀(此步骤重复两次）。
[0077] (7)重复(6)步骤用纯水清洗沉淀，8000rpm离心15min，弃上清取沉淀。
[0078] 3.5.3细菌总DNA的提取
[0079]用细菌基因组DNA小量试剂盒提取，具体操作按试剂盒说明书进行：
[0080] ⑴取上述预处理后的样品，12000Xg离心30s，弃上清，用150yL已加入RNase A的 Buffer S重悬沉淀。
[0081 ] ⑵加入20yL溶菌酶贮存液，混匀后静置5min。
[0082] ⑶加入30yL 0.25M的EDTA(pH为8.0)，混匀后冰浴5min。
[0083] ⑷加入450yL Buffer G-A，漩涡震荡 15s后65Γ水浴lOmin。
[0084] (5)加入400yL Buffer G-B和950yL Buffer DV(4°C预冷），混匀后 12000 Xg离心 2min〇
[0085] (6)尽可能弃净上相，保留相间沉淀和下相，加入950yL，4°C预冷Buffer DV，混匀后 12000 X g离心 2min。
[0086] ⑵丢弃上相，将下相转移至滤器中，12000 X g离心lmin后弃滤器，加400yL Buffer BV到滤液中，混匀。
[0087] (8)将制备管置于2mL离心管中，将步骤(7)中的混合液移入制备管，12000 Xg离心 lmin〇
[0088] (9)弃滤液，加入500yL Buffer W1，12000Xg离心lmin。
[0089] (10)弃滤液，加入700yL Buffer W2,12000Xg离心lmin。
[0090] (11)重复步骤(10)-次。
[0091] (12)弃滤液，12 OOOXg离心lmin。
[0092] (13)将制备管于另一干净的1.5mL离心管中，加入100yL预热到65°C的Eluent到 silica膜中央，静置lmin后12 000Xg离心lmin洗脱DNA。
[0093] 3.5.4ERIC-PCR 扩增
[0094] 根据本实验室以往的研究经验，拍照，分析不同温度下所得条带数目与亮度，以选 择最佳退火温度。
[0095] 3 · 5 · 5ERIC-PCR 的稳定性检测
[0096]以同一乳酸菌、大肠杆菌的DNA样品为模板，以相同的反应体系，以最适退火温度 下，于不同时间分别进行3次重复试验，PCR产物于2%的琼脂糖凝胶上电泳检测，用以验证 所建立ERIC-PCR反应体系的稳定性。
[0097] 3.5.6盲肠和回肠肠道菌群总DNA的ERIC-PCR指纹图谱分析
[0098]分别以已经提好的盲肠和回肠的肠道菌总DNA为模板，设置ERIC-PCR反应体系如 下：
[nnool
[0100] PCR反应程序如下：
[0101]
[0102] 扩增产物于2.0%琼脂糖凝胶上电泳检测并用凝胶成像系统进行拍照。使用分析 软件NTSYS2.1对各试验组在不同日龄时的盲肠和回肠两个肠段的ERIC-PCR指纹图谱进行 条带计数，用Dice方法计算相似性指数Cs，用UPGMA(unweighted pair group mean average)对肠道菌群的多样性进行聚类分析。Dice方法所得相关系数因不受ERIC-PCR指纹 图谱中条带强弱的影响，是一种相对客观的评价。
[0103] 由图3可知，各组肉鸡盲肠样品的条带多集中于100bp-1000bp之间。肉鸡在7日龄 时就有较为丰富的条带，表明此时已有菌株在盲肠内定植。T组肉鸡肠道的条带数显著高于 C组，说明这T组肠道菌群的多样性丰富且种群密度较高。7、14、21日龄时，同一组不同日龄 间的图谱主带位置及特征性条带数量均变化不一，显示了肉鸡肠道优势菌群的不稳定性， 但条带的数量呈上升趋势，表明微生物群落的多样性在逐渐提高。28日龄后，各实验组图谱 的主带变化不明显，说明微生物群落中优势菌群相对稳定。
[0104] 由图4可知，各组肉鸡回肠样品的条带多集中于250bp-2000bp之间。肉鸡在各日龄 段，T组肉鸡肠道就有较为丰富的条带数显著高于C组，表明此时已有菌株定植，T组肠道菌 群的多样性丰富且种群密度较高。随着日龄增加，同一组不同日龄间的图谱特征性条带的 数量及亮度呈上升趋势，表明微生物群落的多样性和种群密度在逐渐提高。28日龄后，各组 肠道菌群组成相似性很高，说明该时间段肉鸡肠道微生物群落中的优势菌群已相对稳定。
[0105] 由图3和4可知，在整个试验周期内，各组肉鸡回肠图谱的条带数量、亮度以及主条 带的位置、特征性条带数量和位置等均与盲肠存在明显差异，条带数量明显较盲肠少，说 明肉鸡的盲肠和回肠中的菌群的种类和优势菌群不同，且回肠中的微生物群落丰度和种群 密度较盲肠低。AvBD2重组酵母对改善肠道环境，提高肠道菌群丰富度有明显的作用。
【主权项】
1. 一种优化的β-防御素 AVBD2基因，其特征在于，所述AVBD2基因具有如SEQIDN0:l所 示的核苷酸序列。2. -种如权利要求1所述的AvK)2基因在作为畜禽生物饲料添加剂中的应用。3. -种含有如权利要求1所述的ΑνΚ)2基因的重组表达载体。4. 根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为整合有 AvBD2基因序列的且不含氨苄Amp抗性的pGHKa表达载体。5. -种遗传工程菌，其特征在于，所述遗传工程菌含有如权利要求4所述的重组表达载 体，或者，所述遗传工程菌的基因组中整合有外源的如权利要求1所述的AvBD2基因序列。6. 根据权利要求5所述的一种遗传工程菌，其特征在于，所述遗传工程菌为含有所述 AvBD2基因的毕赤酵母GSl 15菌株。7. -种利用如权利要求6所述的遗传工程菌制备获得的重组表达蛋白，其特征在于，所 述重组表达蛋白的制备方法为： (1)将所述遗传工程菌进行发酵，获得发酵液； (2 )取发酵液的上清，浓缩，获得所述重组表达蛋白。8. -种含有如权利要求7所述的重组表达蛋白的微生态制剂，所述微生态制剂为由干 酪乳杆菌与所述重组表达蛋白按照体积比1:10混合，其中，所述干酪乳杆菌的浓度为6 X I O9CFlVmL，所述重组表达蛋白的浓度为2.6mg/mL_5.2 mg/mL。
【文档编号】C12N15/12GK105907765SQ201610349166
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】祁克宗, 涂健, 魏海婷, 石水琴, 张明, 吕小龙, 汪雪雁, 薛秀恒, 蒋雯, 袁林
【申请人】安徽农业大学