用于治疗糖原贮积病的腺相关病毒载体的制作方法

用于治疗糖原贮积病的腺相关病毒载体的制作方法
【专利摘要】本公开内容描述了用于治疗糖原贮积病，特别是Ia型糖原贮积病的基因疗法应用的改进的腺相关病毒(AAV)载体。描述了重组核酸分子、载体和重组AAV，其包含G6PC启动子/增强子、合成内含子、G6PC编码序列(例如野生型或密码子优化的G6PC编码序列)，以及位于G6PC启动子/增强子和内含子之间以及内含子和G6PC编码序列之间的填充核酸序列。本文公开的重组AAV表现出高效的肝转导并且能够纠正GSD?Ia的动物模型中的代谢异常。
【专利说明】用于治疗糖原胆积病的腺相关病毒载体
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年11月26日提交的美国临时申请No.61/908,861的优先权，其通 过引用的方式全文纳入本文。
技术领域
[0003] 本公开内容设及用于治疗糖原胆积病，特别是Ia型糖原胆积病的基因疗法载体。
【背景技术】
[0004] Ia型糖原胆积病(GSD-Ia或冯吉尔克病(von Gierke disease) ,MIM232200)是由 葡萄糖-6-憐酸酶a(G6化se-a)的缺陷造成的，运是一种主要在肝脏、肾和肠中表达的酶 (化OU et al.,化t Rev Endocrinol 6:676-688,2010)。由G6PC基因编码的G6化se-a是通 过九个跨膜螺旋错定在内质网化R)中的疏水性蛋白质(化OU et al.,化t Rev化docrinol 6:676-688,2010)。运种酶在糖原分解和糖异生的最后步骤中催化葡萄糖-6-憐酸(G6P)水 解成葡萄糖和憐酸。受GSD-Ia影响的患者不能维持葡萄糖稳态，并且具有空腹低血糖、生长 迟缓、肝肿大、肾肥大、高脂血症、高尿酸血症和乳酸血症（lactic academia)(畑OU et al.,Nat Rev Elndocrinol 6:676-688,2010)。
[0005] 当前没有GSD-Ia的治愈法。低血糖症可W使用食疗控制(Greene et al.，N Engl J Med 294:423-425,1976;Chen et al.，N Engl J Med 310:171-175,1984)，其能够使患 者获得接近正常的生成和青春期发育。但是，较长期的临床并发症及其背后的病理过程依 然未被纠正。一种最显著的慢性风险是肝细胞腺癌化CA),其在70-80%的超过25岁的GSD-I 患者中出现（化OU et al.,Nat Rev Elndocrinol 6:676-688,2010;Lab;rune et al.,J Pediatr Gastroenterol Nutr 24:276-279,1997；Rake et al.,Eur J Pediatr 161 (5啡911):520-534,2002)。650-1曰患者中的肥4是小的多发性并且无包膜的，并发症包括局 部受压（local compression)和瘤内出血。在10%的GSD-Ia患者中，肥A经历恶性转化成肝 细胞癌化CC)(Qiou et al.,化t Rev Endoc;rinol6:676-688,2010;Rake et al.,Eu;r J Pediatr 161(增刊I) :S20-S：M，2002;Franco et al.，J Inherit Metab Dis 28:153-162， 2005)O
[0006] 已经在GSD-Ia的动物模型中进行了使用携带G6化se-a的重组腺相关病毒(AAV)的 基因疗法研究;运些研究已表现出了效力，并且没毒性(化OU and Mansfield,Exped Opin Bi OI Ther 11:1011 -1024，2011中的综述）。之前使用GSD-Ia的小鼠模型的研究已经表明， 在G6PC 5'侧翼区的核巧酸-298至+128的CBA启动子/CMV增强子(Ghosh et al. ,Gene Ther 13:321-329,2006)、犬G6PC启动子化oeberl et al. ,Gene Ilier 13:1281-1289,2006)或人 G6PC启动子的指导下表达G6化se-a的重组AAV将G6化se-a转基因递送到肝脏并且实现了对 运种疾病的长期纠正。但是，尽管运些研究很有希望，但是均没有能够完全纠正肝G6化se-a 缺陷的。

【发明内容】

[0007]本文提供了可在用于治疗糖原胆积病，尤其是GSD-Ia的基因疗法应用中使用的重 组核酸分子、腺相关病毒(AAV)载体和重组AAV。
[000引在一些实施方案中，重组核酸分子包含G6PC启动子/增强子、合成内含子和G6PC编 码区，后者任选地被密码子优化用于在人细胞中表达。重组核酸分子还包含位于G6PC启动 子/增强子和内含子之间，W及内含子和G6PC编码序列之间的填充核酸序列。在一些特定的 非限制性实例中，重组核酸分子包含SEQ ID NO: 1的核巧酸182-4441或SEQ ID N0:3的核巧 酸182-4441。
[0009] 在一些实施方案中，重组核酸分子还包含5^和y反向末端重复(ITR)序列。在一些 实例中，重组妈蚁核酸分子包含SEQ ID NO: 1的核巧酸17-4819或SEQ ID N0:3的核巧酸17- 4819。在其他实施方案中，重组核酸分子包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3的完整载体核酸 序列。
[0010] 本文还提供了包含本文公开的重组核酸分子的载体。在一些实施方案中，载体是 AAV载体，例如AAV8载体。本文还提供了包含本文公开的重组核酸分子或载体的分离的宿主 细胞。例如，分离的宿主细胞可W是适合于AAV增殖的细胞。
[0011] 本文还提供了包含本文公开的重组核酸分子的重组AAV(rAAV)。本公开内容还提 供了包含rAAV的组合物。
[0012] 本文还提供了治疗被诊断为患有糖原胆积病的受试者的方法，包括选择患有Ia型 糖原胆积病(GSD-Ia)的受试者并且给予所述受试者治疗有效量的本文公开的rAAV或者包 含rAAV的组合物。
[0013] 通过参考附图进行的W下发明详述，本发明上述的和其他的目的、特征和优点将 变得更明显。
【附图说明】
[0014] 图1A-1B是示出了 AAV-G阳输注的G6pc-/-小鼠的表型分析结果的图表。（图1A)示出 了用1.2 X IQiiyg/小鼠的AAV-G阳输注的雌性G6pc-/-小鼠及其雌性G化C+/VG6PC+/-同窝出生 仔（Iittermate)的体重。在图上方示出了输注时的年龄（2天、2周或4周）。（O)，G6pc+/+/ G6pc+/-小鼠；（参），AAV-GPE输注的G6pc-/-小鼠。（图IB)示出了输注AAV-G阳的小鼠的血糖、 胆固醇、甘油S醋、尿酸和乳酸水平。由于每组中各自代谢物的相似性，示出的数据为6-24 周龄的合并数据。在2天龄(n = 36)、2周龄(n = 24)或4周龄(n = 9)时向（+/+&+/-)、G6pc+/7 G6pc+/-，（ -/-)、G化C-/-，或（-/-G阳）、G6pc-/-小鼠输注AAV-G阳。数据表示为平均值± SEM。*p 〈0.05，**p<0.005d
[001引图2A-2B是示出了在24小时禁食后野生型和AAV-GPE处理的G6pc-/-小鼠中肝 G6化se-a活性和mRNA表达的图表。向7只2周、11只4周、1只15周（*)和1只30周（**)龄的 G6pc-/-小鼠输注不同剂量的AAV-GPE;当小鼠为70-90周龄时评估G6化se-a活性和mRNA表 达。（图2A)示出了所指出周龄(W)时的肝G6化se-a活性。基于与野生型活性相比的小鼠 G6化se-a活性，将小鼠分组为低(AAV-L)、中（AAV-M)和高（AAV-H)。（图2BMAV-GPE处理的 G6pc-/-小鼠中肝G6化se-amRNA表达及其与G6化se-a活性的关系。数据表示为平均值±SEM。 在图2B中，卸<0.05，**p<0.005。
[0016] 图3A-3C是示出了 70至90周龄时的经AAV-GPE处理的G6p(T/-小鼠的表型分析结果 的图表。（图3A)血糖、胆固醇、甘油S醋、尿酸和乳酸水平。（图3B)体重、体长和BMIJ，雌性； M，雄性。（图3C)肝重量。处理指示为：（+/+)，野生型小鼠；（-/-AAV)，用不同剂量AAV-GPE输 注的G6pc-/-小鼠。AAV-L(n = 6)、AAV-M(n = 9)和AAV-H(n = 5)分别是表达3-9% (低，L)、22- 63%(中，1)和81-128%(高记）的正常肝66化36-日活性的44￥-6阳处理的66口(：-/-小鼠。数据 表示为平均值± SEM。卸<0.05，**p<0.005。
[0017] 图4A-4C是示出了空腹血糖和葡糖耐量谱的图表。（图4A)70至90周龄时的野生型 和经AAV-G阳处理的G6pc-/-小鼠的空腹血糖谱。（图4B)6-8周龄时的未经处理的G6pc-/-小鼠 的空腹血糖谱。（图4C)70至90周龄时的野生型和经AAV-GPE处理的G6pc^^h鼠的葡糖耐量 谱。将野生型或AAV-GPE输注的G6P C鼠禁食6小时，腹膜内注射2mg/g右旋糖 (dextrose),然后每30分钟通过尾静脉采集血样。数据表示为平均值±SEMe(+/+)，野生型 小鼠；（-/-)，未处理的G6pc-/-小鼠。AAV-L(n = 6)、AAV-M(n = 9)和AAV-H(n = 5)分别是表达 3-9%、22-63%和81-129%的正常肝G6I^se-a活性的AAV-G阳处理的G6pc-/-小鼠。
[001引图5A-5C是示出了禁食24小时后70至90周龄的野生型和经AAV-GPE处理的G6pc-/- 小鼠的血膜岛素 W及SREBP-Ic和葡萄糖激酶的肝脏mRNA水平的图表。（图5A)空腹血膜岛素 水平及其与动物体重的关系。（图5B)通过实时RT-PCR的SREBP-Ic mRNA的定量。（图5C)葡萄 糖激酶mRNA的定量W及空腹血膜岛素与肝葡萄糖激酶mRNA水平的关系。（+/+，0)，野生型 小鼠 （n = 20) ; (-/-AAV，参）AAV-GPE处理的G6pc-/-小鼠 （n = 20)。数据表示为平均值± SEM。*冲<0.005。
[0019] 图6A-6D是示出了 12周龄的野生型、rAAV-GPE处理的和rAAV-miGPE处理的G6pc-/- 小鼠中的生化分析结果的图表。rAAV-GPE和rAAV-miGPE分别是在2864bp的人G6PC启动子/ 增强子(G阳)和382bp的最小人G6PC启动子/增强子(miGPE)的指导下表达人G6化Se的rAAV 载体。（图6A)肝微粒体G6化se-a活性及其与载体基因组拷贝数的关系。（图6B)生长曲线。 (图6C)BMI值。（图6D)血糖水平。GPE-高，高剂量rAAV-GPE处理的（O) ;miGPE-高，高剂量 rAAV-miGPE处理的（参）；GPE-低，低剂量rAAV-GPE处理的（□) ;miGPE-低，低剂量rAAV- miGPE处理的（ )G帥C-/-小鼠；（+/+)，野生型（▼)小鼠。数据表示为平均值± SEMd^< 0.05〇
[0020] 图7A-7C是示出了 12周龄野生型、rAAV-G阳处理的和rAAV-miGPE处理的G6pc-/-小 鼠中的表型分析结果的图表。（图7A)肝重量。（图7B)肝糖原含量。（图7C)肝甘油S醋含量。 GPE-高（n = 6)，高剂量rAAV-G阳处理的；miG阳-高（n = 6)，高剂量rAAV-miGPE处理的；GW- 低（n = 6 )，低剂量rAAV-GPE处理的；miG阳-低（n = 6 )，低剂量rAAV-miGPE处理的G6pc-/-小 鼠；（+/+)，野生型小鼠。数据表示为平均值±SEM。冲<0.05。
[0021] 图8A-8C是示出了 12周龄的野生型、rAAV-G阳处理的和rAAV-miG阳处理的G6pc-/- 小鼠的空腹血糖和葡糖耐量谱的图表。（图8A)空腹血糖谱。（图8B)24禁食小时之后的血糖 水平。（图8C)葡糖耐量谱。G阳-高(n = 6)，高剂量rAAV-G阳处理的（O); miGPE-高(n = 6)，高 剂量rAAV-miGPE处理的（参）；GPE-低（n = 6)，低剂量rAAV-GTO处理的（□ );miGPE-低（n = 6)，低剂量rAAV-miGPE处理的（^)669(3-/-小鼠；（+/+)，野生型（▼)小鼠。数据表示为平均 值 ± SEM。冲 <0.05，*冲 <0.005。
[0022] 图9是犬(569 10^:10)和人(569 10^:4)66口曰36蛋白序列的比对。
[0023] 图10是示出了人、小鼠、大鼠和犬G6化Se-的氨基酸序列差异的表。
[0024] 图11是示出了用rAAV转导的GSD-Ia小鼠中的肝G6化Se活性的图表。用rAAV8载体 (IQi3VgAg)转导GSD-Ia小鼠，所述载体在GPE启动子/增强子的指导下表达天然或密码子优 化レodon-optimized，co)的人G6F^ase。12周龄小鼠中的肝G6F^ase活性为165.4±18.2nmol/ min/m邑。
[00巧]图12是示出了 12周龄野生型(+/+)和rAAV处理的GSD-Ia小鼠中的肝重量的图表。 [00%] 图13A和13B分别是示出了野生型（O)和rAAV8-G阳-CO-GSPase处理的GSD-Ia(参） 小鼠中的葡糖耐量和空腹血糖谱的图表。
[0027] 序列表
[00%]使用37C.F.R. 1.822中定义的核巧酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的=字母代码 示出了所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列。仅示出了每个核酸序列的一条链，但是应 理解通过参考示出的链而包含了互补链。序列表W2014年11月112日创建的39.6邸的ASCII 文本文件提交，其通过引用的方式纳入本文。在所附序列表中：
[00巧]SEQ ID NO: 1是UFlI-G阳-G6PC质粒的核巧酸序列，所述质粒包含W下特征：
[0030] 口 R-核巧酸 17-163
[0031] G6PC启动子/增强子-核巧酸182-3045
[0032] 填充序列-核巧酸3051-3184
[0033] 内含子-核巧酸3185-3321
[0034] 填充序列-核巧酸3322-3367
[0035] G6PC编码序列-核巧酸3368-4441
[0036] 口 R-核巧酸4674-4819
[0037] SEQ ID ^:2是册11-1(29-66?(：质粒的核巧酸序列，所述质粒包含^下特征：
[003引 口 R-核巧酸 17-163
[0039] 6PC启动子/增强子-核巧酸182-3045
[0040] 内含子-核巧酸3052-3188
[0041 ] G6PC编码序列-核巧酸3202-4275
[0042] 口 R-核巧酸4508-4653
[0043] SEQ ID NO:3是UFlI-G阳-CO-G6PC质粒的核巧酸序列，所述质粒包含W下特征：
[0044] 口 R-核巧酸 17-163
[0045] 6PC启动子/增强子-核巧酸182-3045
[0046] 填充序列-核巧酸3051-3184
[0047] 内含子-核巧酸3185-3321
[004引填充序列-核巧酸3322-3367 [0049] G6PC编码序列-核巧酸3368-4441 [0化0] 口 R-核巧酸4674-4819
[0化1]沈Q ID NO:4是人G6PC蛋白的氨基酸序列。
[0化2] SEQ ID NO:5-8是引物序列。
[0化3] SEQ ID NO:9是犬G6PC的核巧酸序列。
[0054] SEQ ID NO :10是犬G6PC的氨基酸序列。
【具体实施方式】 [005引 I.缩写 [0056] AAV 腺相关病毒 [0057] BMI 体重指数 [005引 CBA 鸡0-激动蛋白
[0059] CMV 巨细胞病毒
[0060] ELISA酶联免疫吸附测定 [0061 ] G6P 葡萄糖-6-憐酸
[0062] G6PC 葡萄糖-6-憐酸酶，催化亚基
[0063] G6PT 葡萄糖-6-憐酸转运蛋白
[0064] G阳 G6PC启动子/增强子
[0(?日]GSD 糖原胆积病
[0066] H&E 苏木精和曙红
[0067] HCA 肝细胞腺瘤
[006引肥C 肝细胞癌
[0069] ITR 反向末端重复
[0070] ORF 开放阅读框
[0071] rAAV 重组 AAV
[0072] Vg 病毒基因组
[0073] VP 病毒颗粒
[0074] II.术语和方法
[0075] 除非另有说明，否则技术术语是根据常规用法使用。分子生物学中常见术语的定 义可W在W下中找到：Benjamin Lewin,Genes V,Oxford University Press出版，1994 (ISBN 0-19-854287-9) ;Kendrew et al.(编辑），1^6 Encyclopedia of Molecular Bio logy ,Blackwel I Science Ltd.出版，1994( ISBNO-632-02182-9) ; W及 Robert A.Meyers(编车茸），Molecular Biology and Biotechnology : a Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。
[0076] 为了便于理解本公开内容的各个实施方案，提供了特定术语的W下解释：
[0077] 腺相关病毒(AAV):感染人和其他一些灵长类物种的小的复制缺陷性无包膜病毒。 已知AAV不造成疾病并且引起非常轻微的免疫应答。使用AAV的基因疗法载体可W感染分裂 细胞和静止期细胞，并且可W保持染色体外状态而不整合到宿主细胞的基因组中。运些特 征使得AAV成为用于基因疗法的有吸引力的病毒载体。目前有11种确认的AAV血清型(AAV1- 11)。
[0078] 给药/给予：通过有效的途径向受试者提供或给予药剂，例如治疗剂（例如，重组 AAV)。示例性给药途径包括但不限于注射(例如，皮下、肌内、真皮内、腹膜内和静脉内）、口 月良、导管内、舌下、直肠、经皮、鼻内、阴道和吸入途径。
[0079] 密码子优化的："密码子优化的"核酸是指已经被改变W使得密码子最适于特定系 统(例如，特定物种或物种的组）中的表达的核酸序列。例如，核酸序列可W优化用于在哺乳 动物细胞或特定哺乳动物物种(例如人细胞）中表达。密码子优化不改变所编码蛋白质的氨 基酸序列。
[0080]增强子:通过提高启动子的活性来提高转录速率的核酸序列。
[0081 ] G6PC:位于人染色体17q21中的编码葡萄糖-6-憐酸酶a(G6Pase-a)的基因。 G6化se-a是357个氨基酸的疏水蛋白质，具有将其错定在内质网中的9个螺旋（Chou et al.，化t Rev化docrinol 6:676-688,2010)。66化36-日蛋白质在糖异生和糖原分解的最终 步骤催化葡萄糖-6-憐酸水解成葡萄糖和憐酸，是葡萄糖稳态中的重要酶。G6PC基因中的突 变造成Ia型糖原胆积病(GSD-Ia),运是一种与肝脏和肾中的糖原和脂肪积累相关的W严重 空腹低血糖为特征的代谢障碍。
[0082] 糖原胆积病(GSD):肌肉、肝脏W及其他组织中糖原合成或分解过程中的缺陷造成 的一类疾病。GSD可W是遗传性的或获得性的。遗传性GSD是由参与运些过程的新陈代谢的 任何先天缺陷造成。目前有11种确认的糖原胆积病(GSD I、II、III、IV、V、VI、VII、IX、XI、 XH和XIII型KGSD-I由两种常染色体隐形疾病GSD-Ia和GSD-Ib组成（畑OU et al. ,Nat Rev Endocrinol 6:676-688,2010) sGSD-Ia由葡萄糖-6-憐酸酶a的缺陷造成。葡萄糖-6-憐 酸转运蛋白（G6PT)的缺陷是GSD-Ib的原因。
[0083] Ia型糖原胆积病(GSD-Ia):也称为冯吉尔克病，GSD-Ia是最常见的糖原胆积病，活 产儿中发病率为约l/l〇〇,〇〇〇DGSD-Ia是由酶葡萄糖-6-憐酸酶a(G6化se-a)的缺陷造成的 遗传病。G6Pase-a的缺陷损害肝脏由糖原和由糖异生产生游离葡萄糖的能力。患有GSD-Ia 的患者不能维持葡萄糖稳态并且具有空腹低血糖、生长迟缓、肝肿大、肾肥大、高脂血症、高 尿酸血症和乳酸血症（Chou et al.，化t Rev化docrinol 6:676-688,2010)。目前没有用 于GSD-Ia的治愈方法。
[0084] 内含子:基因中不包含蛋白质的编码信息的一段DNA。内含子在信使RNA翻译之前 被移除。
[0085] 反向末端重复（ITR):有效复制所需的腺相关病毒基因组中的对称核酸序列。ITR 序列位于AAV DNA基因组的每一端。ITR充当病毒DNA合成的复制起点，并且是产生AAV整合 型载体的必要的顺式元件。
[0086] 分离的："分离的"生物组分(例如，核酸分子、蛋白质、病毒或细胞）已经被从其中 所述组分天然存在的生物体的细胞或组织中或者生物体本身中的其他生物组分(例如其他 染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞）中基本上分离或纯化。已经"分离"的核酸分子 和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的那些。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制 备的核酸分子和蛋白质，W及化学合成的核酸分子和蛋白质。
[0087] 可操作地连接：当第一核酸序列与第二核酸序列被放置为具有功能关系时，第一 核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，贝U 启动子与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且当有必要 连接两个蛋白质编码区时，其在相同阅读框中。
[0088] 可药用载体：本公开内容中可W使用的可药用载体（溶剂（vehicle))是常规的。 Remington's Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton, PA，15th Edition(1975)描述了适合一种或更多种治疗性化合物、分子或试剂的药物递送 的组合物和制剂。
[0089] 通常，载体的性质取决于所使用的特定给药方式。例如，胃肠外制剂通常包含可注 射流体，其包括药学和生理学上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、水性右旋 糖、甘油等作为溶剂。对于固体组合物(例如，粉末剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式），可W包含 常规无毒固体载体，例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸儀。除了生物学中性载体外，待 给予的药物组合物还可W包含少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲 剂等，例如醋酸钢或脱水山梨糖醇单月桂酸醋.
[0090] 预防、治疗或改善疾病："预防"疾病（例如GSD-Ia)是指抑制疾病的全面发生。"治 疗"是指在疾病开始发生后改善疾病或病理病症的体征或症状的治疗性介入。"改善"是指 降低疾病的体征或症状的数目或严重性。
[0091] 启动子:指导/引起核酸(例如，基因）的转录的DNA区域。启动子包括转录起始位点 附近的必要核酸序列。通常，启动子位于其转录的基因附近。启动子还任选地包括远端增强 子或阻遏物元件，其可W位于距转录起始位点数千个碱基对远。
[0092] 纯化的：术语"纯化的"并不需要绝对纯度;相反地，其旨在作为相对术语。因此，例 如，纯化的多肤、蛋白质、病毒或其他活性化合物是全部或部分地从天然相关的蛋白质和其 他污染物中分离得那些。在某些实施方案中，术语"基本上纯化的"是指已从细胞、细胞培养 基或其他粗制品中分离并且经过分级分离W除去初始制品的多种组分(如蛋白质、细胞碎 片W及其他组分)的肤、蛋白质、病毒或其他活性化合物。
[0093] 重组:重组核酸分子是指运样的核酸分子，其具有非天然存在的序列，或者具有通 过两个序列片段的人为组合(否则地话，其将是分开的）制备的序列。运种人为组合可W通 过化学合成或者通过分离的核酸分子片段的人为操作(如通过基因工程技术)实现。
[0094] 同样地，重组病毒是包含非天然存在的序列或通过至少两个不同来源的序列的人 为组合制备的序列的病毒。术语"重组"还包括仅通过天然核酸分子、蛋白质或病毒的一部 分的添加、置换或缺失改变的核酸、蛋白质和病毒。本文使用的"重组AAV"是指其中包装有 重组核酸分子(例如，编码G6化se-a的重组核酸分子)的AAV颗粒。
[00M]序列同一性:两个或更多个核酸序列之间或者两个或更多个氨基酸序列之间的同 一性或相似性是根据序列之间的同一性或相似性表示。序列同一性可W根据百分比同一性 巧慢;百分比越高，序列越相同。序列相似性可W根据百分比相似性测量(考虑保守性氨基 酸置换）；百分比越高，序列越相似。当使用标准方法比对时，核酸或氨基酸序列的同源物或 直系同源物具有相对高的序列同一性/相似性程度。与来自相关性更远的物种(例如，人和 线虫(C.elegans)序列）相比，当直系同源蛋白质或cDNA来自更紧密相关的物种(例如，人和 小鼠序列）时，运种同源性更显著。
[0096]用于比较的序列比对方法是本领域中公知的。W下描述了多种程序和比对算法： Smith&Waterman，Adv.Appl.Ma化.2:482,1981;Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48:443， 1970；Pearson&Lipman,Proc.Natl. Acad.Sci.USA 85:2444，1988;Higgins&Sharp,Gene， 73:237-44，1988;化容容;[113&511过巧，〔六8108 5:151-3，1989;Corpet et al.，Nuc.Acids 民es.16:10881-90，1988;Huang et al.Computer Appls. in the Biosciences 8,155-65， 1992;?及Pearson et al.，Meth.Mol.Bio.24:307-31，1994.Altschul et al.， J.Mol.Biol. 215:403-10,1990给出了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。
[0097] NCBI 基本局部比对检索工具（BLAST)(Altschuletal.，J.Mol.Biol.215:403- 10，1990)可W从多个来源获得，包括国家生物信息中屯、(NCBI)和网上，其用于结合序列分 析程序blas1:p、blastn、blastx、tblastn和tblastx使用。额外的信息可W在NCBI网址上找 到。
[0098] 血清型:通过抗原的特征组区分的一类密切相关的微生物(例如，病毒）。
[0099] 填充序列:较大核酸分子(例如，载体）中包含的核巧酸序列，其通常用于在两个核 酸特征之间（例如启动子和编码序列之间）产生所需的间隔，或者延长核酸分子W使其具有 所需长度。填充序列不包含蛋白质编码信息，可W是未知的/合成来源并且/或者与较大核 酸分子内的其他核酸序列不相关。
[0100] 受试者:活的多细胞脊椎动物生物体，包括人和非人哺乳动物的类别。
[0101 ]合成:通过人工手段在实验室产生，例如合成核酸可W在实验室化学合成。
[0102] 治疗有效量:足W在用试剂治疗的受试者或者细胞中取得所需效果的特定药物或 治疗试剂(例如重组AAV)的量。试剂的有效量取决于多种因素，包括但不限于被治疗的受试 者或细胞，W及治疗性组合物的给药方式。
[0103] 载体:载体是允许插入外源核酸而不破坏载体在宿主细胞中复制和/或整合的能 力的核酸分子。载体可W包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还 可W包含一种或更多种选择性标记基因和其他遗传元件。表达载体是包含必要的调控序列 W允许插入的基因转录和翻译的载体。在本文的一些实施方案中，载体是AAV载体。
[0104] 除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有本公开内容所属领域 的普通技术人员所通常理解的含义相同的含义。除非上下文另外明确说明，单数术语"一"、 "一个"和"所述"包括复数指示物。"包含A或护意指包含A、或者B，或者A和B。还应理解的是， 对于核酸或多肤给出的所有碱基大小或氨基酸大小，W及所有分子重量或分子质量值是近 似的，并且被提供用于描述。尽管在本公开内容的实践或测试中可W使用与本文所述的那 些方法和材料相似或相同的方法和材料，但是W下描述了合适的方法和材料。本文提到的 所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用的方式全文纳入本文。在矛盾的情 况下，W本说明书(包括术语的解释)为准。此外，材料、方法和实例仅为示例性的，而不是旨 在限制。
[0105] III.多个实施方案的概述
[0106] 本文提供了可在用于治疗糖原胆积病(尤其是GSD-Ia)的基因疗法应用中使用的 重组核酸分子、AAV载体和重组AAV。
[0107] 所述重组核酸分子包含G6PC启动子/增强子(GPE)、合成内含子和G6PC编码区。所 述G6PC编码区任选地被密码子优化用于在人细胞中表达。所述重组核酸分子还包含位于 G6PC启动子/增强子和内含子之间，W及内含子和G6PC编码序列之间的填充核酸序列。当被 包含在AAV载体中时，所述重组核酸分子还可W包含5/和y反向末端重复(ITR)序列。
[010引本文公开了，具有G6PC启动子/增强子的表达G6化se-a的重组AAVUAV-G阳）在指 导体内肝转基因的表达方面比具有替代启动子/增强子（即，鸡的敦动蛋白启动子/CMV增强 子)的另外的表达G6化se-a的重组AAV显著更有效。经过24小时的研究期，用AAV-G阳处理的 G6PC缺陷小鼠（GSD-Ia的模型）表现出肝G6PC缺陷的完全正常化，如通过正常的血糖、血代 谢物、肝糖原和肝脂肪水平证明的（参见实施例1和Yiu et al. ,Mol Ther 18:1076-1084， 2010)。另外，对AAV-G阳处理的G6pc-/-小鼠的长期研究表明，AAV-G阳介导的基因疗法在小 鼠中有效至少70-90周，表达了大于3%的肝G6化se-a。特别地，AAV-GTO处理的小鼠表现出 正常的肝脂肪胆积、正常的血代谢物和葡糖耐量谱，降低的空腹血膜岛素水平，并且没有肝 异常（如肝细胞腺瘤）的迹象（参见实施例2和Lee et al.，Hepatology56:1719-1729， 2012)。
[0109] 本公开内容还发现，G6PC启动子的上游增强子元件对于GSD-Ia动物模型中的最佳 G6PC表达是关键的。特别地，证明与仅包含383bp的最小G6PC启动子/增强子的表达G6化se- a的重组AAV相比，利用在核巧酸-2684至-U相对于G6PC起始位点）包含G6PC启动子/增强子 的AAV-G阳的治疗在GSD-Ia小鼠模型中产生了显著更高的肝G6化se-a表达水平，实现了更 大的肝糖原积累的降低，并且导致了更好的空腹耐量（参见实施例3和Lee et al. ,Mol Genet Me 1:ab. 110(3): 275-280,2013)。
[0110] 本公开内容还发现，存在于G6PC启动子/增强子和内含子之间W及内含子和G6PC 编码序列之间的填充核巧酸序列对于G6化se-a的肝转导和表达很重要。特别地，由缺少填 充序列的质粒UF11-K29-G6PC(SEQ ID腸：2)产生的重组44￥表现出7.：3加 1〇1/111111/111邑的 G6化Se活性。相比之下，由质粒UF11-GPE-G6PC(SEQ ID N0:1)产生的重组AAV表现出 33.0nmol/min/mg的G6化Se活性(参见实施例4)。本公开内容提供了存在于本文中由SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:3给出的AAV载体中的填充序列的第一次描述。
[0111] 另外，本文公开的数据证明，G6PC编码序列的密码子优化使翻译效率提高约1.5至 2.5倍，导致与编码野生型G6PC的AAV-G阳的给药相比，在AAV-CO-GPE(包含密码子优化的 G6PC核酸序列）给药后肝脏中显著更高的G6化se-a表达(参见实施例5)。
[0112] 总之，运些结果表明，包含位于核巧酸-2684至-1的G6PC启动子/增强子、合成内含 子、内含子侧翼的填充序列和G6PC编码区（野生型或密码子优化）的重组AAV是有效的肝转 基因表达和体内GSD-Ia治疗的关键特征。
[0113] 本文提供了重组核酸分子，其包含与SEQ ID NO: 1的核巧酸182-4441核巧酸或SEQ ID NO:3的核巧酸182-4441具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%或至少99%同一性的核巧酸序列。例如，核酸分子可W在G6PC编码区中包含 核巧酸置换，例如用于密码子优化。又例如，G6PC编码区可W是来自不同物种的G6PC，例如 犬G6PC或犬G6PC的密码子优化(用于在人中表达)形式。在一些实例中，由SEQ ID NO: 1的核 巧酸182-3045或者SEQ ID NO:3的核巧酸182-3045给出的G6PC编码区被置换成犬G6PC编码 序列（SEQ ID N0:9)。或者，SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:3的人G6PC编码区可W包含核巧酸置 换，所述核巧酸置换导致在犬和人G6PC蛋白序列之间不同的残基处的编码变化。例如，可W 引入核巧酸置换，导致人G6PC蛋白（SEQ ID N0:4)的残基3、54、139、196、199、242、247、292、 298、301、318、324、332、347、349、350和/或353处的编码变化。图9示出了人和犬66化36-口蛋 白序列的比对，图10提供了示出人、小鼠、大鼠和犬G6化se-a之间的氨基酸差异的表。本公 开内容考虑了在图10中所列的任何残基处改变氨基酸序列的核巧酸置换。
[0114] 在其他情况下，核巧酸置换可W存在于填充序列或者合成内含子序列中。核巧酸 置换还可能会被包含在载体序列中，例如3/ ITR下游（即3/ )，或者5/ ITR和GTO之间，或者 G6PC编码区和^ITR之间的载体序列。在一些实施方案中，重组核酸分子包含SEQ ID NO: 1 的核巧酸182-4441或沈Q ID NO:3的核巧酸182-4441。运些重组核酸分子包含核巧酸-2684 至-I处的G6PC启动子/增强子序列、合成内含子、内含子侧翼的填充序列和G6PC编码序列。 SEQ ID NO: 1包含野生型G6PC编码区，而SEQ ID NO: 3包含密码子优化的G6PC编码序列。
[0115] 在一些实施方案中，重组核酸分子还包含y和5/ITR序列。因此，本文提供了重组 核酸分子，其包含与SEQ ID NO: 1的核巧酸17-4819或者SEQ ID NO:3的核巧酸17-4819具有 至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一 性的核巧酸序列。在一些实施方案中，重组核酸分子包含SEQ ID NO: 1的核巧酸17-4819或 者SEQ ID NO: 3的核巧酸17-4819。在一些特定的非限制性实例中，重组核酸分子包含SEQ ID NO: 1的完整序列（用于产生AAV-GPE的UFll-G阳-G6PC质粒)或者沈Q ID N0:3的完整序 列（用于产生密码子优化的AAV-CO-GPE的UFl I-G阳-CO-G6PC质粒）。在其他实例中，重组核 酸分子包含与沈Q ID NO: 1或SEQ ID N0:3具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、 至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的核巧酸序列。
[0116] 在其他实施方案中，本文提供了重组核酸分子，其包含与SEQ ID N0:2的核巧酸 182-4275具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或 至少99%同一性的核巧酸序列。在一些实例中，重组核酸分子包含SEQ ID NO: 2的核巧酸 182-4275。在一些实例中，重组核酸分子包含与SEQ ID NO: 2的核巧酸17-4653具有至少 80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %同一性的 核巧酸序列。在一些实例中，重组核酸分子包含SEQ ID N0:2的核巧酸17-4653。在一些特定 的非限制性实例中，重组核酸分子包含SEQ ID N0:2的完整序列（缺少填充序列的UFll- K29-G6PC质粒）。在其他实例中，重组核酸分子包含与SEQ ID NO: 2具有至少80%、至少 85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98%或至少99%同一性的核巧酸序 列。
[0117] 本文还提供了包含本文公开的重组核酸分子的载体。在一些实施方案中，载体是 AAV载体。AAV血清型可W是任何适合于向受试者递送转基因的血清型。在一些实例中，AAV 载体是血清型SAAV(AAVS)。在其他实例中，AAV载体是血清型1、2、3、4、5、6、7、9、10、11或12 载体（即，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9、AAV10、AAV11 或AAV12)。也在其他 实例中，AAV载体是两种或更多种AAV血清型的杂种(例如，但不限于AAV2/l、AAV2/7、AAV2/8 或AAV2/9)"AAV血清型的选择部分取决于基因疗法所祀向的细胞类型。对于GSD-Ia的治疗， 肝和肾是相关的祀器官。
[0118] 本文还提供了包含本文公开的重组核酸分子或载体的分离的宿主细胞。例如，分 离的宿主细胞可W是适合于产生重组AAV(rAAV)的细胞(或细胞系）。在一些实例中，宿主细 胞是哺乳动物细胞，例如皿1(-293、8服、￥6'〇、畑、肌-1080、4549、(：〇3-7、41?阳-19或1亂-5细 胞。
[0119] 本文还提供了包含本文公开的重组核酸分子的rAAV。在一些实施方案中，rAAV是 rAAV8和/或rAAV2。但是，AAV血清型可W是任何其他合适的AAV血清型，例如AAV1、AAV2、 AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9、AAV10、AAV11 或AAV12,或者两种或更多种AAV 血清型的 杂种（例如，但不限于44￥2/1、44￥2/7、44￥2/8或44￥2/9)。本公开内容还提供了包含本文公 开的rAAV和可药用载体的组合物。在一些实施方案中，组合物被配制为用于静脉内或肌给 药。用于rAAV给药的合适的药物制剂可W在例如美国专利申请No. 2012/0219528中找到。
[0120] 本文还提供了治疗被诊断为患有糖原胆积病的受试者的方法，包括选择患有GSD- Ia的受试者，W及给予所述受试者治疗有效量的本文公开的rAAV(或者包含rAAV的组合 物）。在一些实施方案中，rAAV通过静脉内给予。
[0121 ] 在一些实施方案中，W约1 X 1〇11至约1 X 1〇14病毒颗粒(VP)Ag的剂量给予rAAV。 在一些实例中，W约1 X 1〇12至约8 X l〇i3vp/kg的剂量给予rAAV。在其他实例中，W约1 X l〇u 至约6X l〇i3vp/kg的剂量给予rAAV。在一些特定的非限制性实例中，W至少约1 X 1〇11、至少 约5 X 1〇11、至少约1 X 1〇12、至少约5 X 1〇12、至少约1 X 1〇13、至少约5 X 1〇13或至少约1 X l〇i4vp/kg的剂量给予rAAV。在其他非限制性实例中，W不大于约5 X 1〇11、不大于约1 X 1〇12、 不大于约5 X 1〇12、不大于约1 X l〇u、不大于约5 X l〇u或不大于约1 X l〇i4vp/kg的剂量给予 rAAV。在一个非限制性实例中，W约1 X l〇i2vp/kg的剂量给予rAAV。根据所需治疗结果的需 要，可WW单剂量或多剂量(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个剂量)给予rAAV。
[0122] IV.用于基因疗法应用的重组AAV
[0123] AAV属于细小病毒(Parvoviridae)科和依赖病毒(Dependovirus)属。AAV是小的无 包膜病毒，其包装有线性单链DNA基因 。AAV DNA的正义链和反义链W相等的频率被包装在 AAV衣壳中。
[0124] AAV基因组W两个开放阅读框(ORF)侧翼的两个反向末端重复（ITR)为特征。在 AAV2基因中，例如，ITR的前125个核巧酸是回文结构，其自折叠 W使碱基配对最大化并且形 成T型发夹结构。ITR的另外20个碱基(称为D序列)保持未配对。ITR是对于AAV DNA复制很重 要的顺式作用序列；ITR是复制起点并且充当了通过DNA聚合酶的第二链合成的引物。该合 成过程中形成的双链DNA(也成为复制形成单体)被用于第二轮的自引物复制并且形成复制 形成二聚体。通过链置换机制加工运些双链中间产物，得到用于包装的单链DNA和用于转录 的双链DNA。位于ITR内的是Rep结合元件和末端解离位点（terminal resolution site， TRS)。运些特征在AAV复制期间被病毒复制调节蛋白R邱利用来加工双链中间产物。除了其 在AAV复制中的作用外，ITR还是AAV基因组包装、转录、非许可条件下的负调控和位点特异 性整合所必需的（Daya and Berns，Clin Microbiol Rev21(4) :583-593,2008)。
[01巧]AAV左侧的ORF包含R邱基因，其编码四种蛋白质：Rep78、Rep 68、Rep52和R邱40。右 侦化勺ORF包含Cap基因，其产生；种病毒衣壳蛋白（VPl、VP2和VP3) dAAV衣壳蛋白包含排列成 二十面体对称的60个病毒衣壳蛋白。VPUVP2和VP3Wl:l:10摩尔比存在(Daya and Berns, Clin Microbiol Rev 21(4):583-593,2008)〇
[0126] AAV是目前基因疗法中最常用的病毒之一。尽管AAV感染人和一些其他灵长类物 种，已知其不导致疾病并引起非常轻微的免疫应答。利用AAV的基因疗法载体可W感染分裂 细胞和静止期细胞二者，并且保持为染色体外状态而不整合到宿主细胞的基因组中。由于 AAV的有利特征，本公开内容考虑了将AAV用于本文公开的重组核酸分子和方法。
[0127] AAV具有用于基因疗法载体的多种所需特征，包括结合并且进入祀细胞、进入细胞 核的能力、在细胞核中表达较长时间的能力W及低毒性。但是AAV基因组的小尺寸限制了可 W整合的异源DNA的大小。为了使运个问题尽可能小，已经构建了不编码Rep和整合效率元 件（I邸）的AAV载体。保留了 ITR，因为它们是包装所需的顺式信号（Daya and Berns ,Clin Microbiol Rev 21(4):583-593,2008)〇
[0128] 产生适合于基因疗法的rAAV的方法是本领域中已知的（参见，例如美国专利申请 No.2012/0100606;2012/0135515;2011/0229971;和2013/0072548;W及(ihosh et al.， Gene Ther 13(4) :321-329,2006),并且可W与本文公开的重组核酸分子和方法一起使用。
[0129] 本文提供了 W下实施例W说明某些特征和/或实施方案。运些实施例不应解释为 将本公开内容限制于所述的特定特征或实施方案。
[0130] 实施例
[0131] 实施例1:使用基因疗法使Ia型糖原胆积病的肝G6PC缺陷完全正常化
[0132] 本实施例描述了由两种不同启动子驱动的两种表达G6化se-a的AAV载体在G6PC缺 陷小鼠中的肝基因递送效率和G6化se-a表达的比较。结果证明，具有G6PC启动子/增强子的 AAV载体(AAV-GPE)在指导持久的体内肝转基因表达方面比具有鸡0-激动蛋白启动子/CMV 增强子的AAV载体(AAV-CBA)更有效。另外，用AA V-G阳处理的G6PC缺陷小鼠表现出正常的血 糖、血代谢物、肝糖原和肝脂肪水平。
[0133] 材料和方法
[0134] pUFl I-G阳-G6PC的构建和AAV载体的制备
[0135] 通过如下方式对pUFll-mG6化se-a-CBA(Ghosh et al. ,Gene Therl3:321-329, 2006)(其中，小鼠 G6化se-a是由CBA启动子/CMV增强子驱动（Xu et al.，Hum Gene Ther 12:563-573，2001))进行改变来构建包含处于人G6PC启动子/增强子控制之下的人G6 ^se- 曰的UFl I-G阳-G6PC质粒：通过)(hoI/S地I消化切割来自pUFl l-mG6化se-a-CBA的Hp-neo片 段，然后将剩余载体进行凝胶纯化，用T4DNA聚合酶补平，然后自连接W产生pUFll- mG6 化36-日-〔84-[化9-1160]-/-。然后在5'-SbfI和3'-NotI位点将pUFll-mG6Pase-a-CBA- [l'kp-neo]-/-中的mG6Pase-a和CBA启动子/CMV增强子替换成人G6化se-acDNA，产生pUFll- G6PC。然后用PCR克隆包含人G6PC启动子/增强子的G6PC 5'侧翼区的核巧酸-2864至-1 dPCR 模板是包含人G6PC基因的细菌人工染色体（Invitrogen Life Technologies ,Carlsbad, 〔八），引物对是15(5'-(：(：1'門646441'(^4〔66161'-3'；56〇10加：5)和245(5'- 〇：1'〔41'刊〇：刊66〔4〇：1'(：-3'；569 10^:6)，其分别在5'和3'端包含额外的牡11巧盼6曰1位 点。然后将包含G6PC启动子/增强子的KpnI-XbaI片段连接到KpnI-XbaI线性化的pUFll- G6PC中，产生PUF11-G6PC-GPE-1。接下来，使用分别在5/和3/端包含额外的SpeI和SbfI位点 的弓 I 物对 3S(5'-AGGTAAGTATCAAGGTTACA-3' ；SEQ ID NO : 7 )和 4 A S ( 5 '- ACCTGTGGAGAGAAAGGCAA-3';沈Q ID N0:8)来用PCR克隆来自pCI载体的（Promega，Madison, WI)的嵌合内含子。然后将运种嵌合内含子作为SpeI-Sbf I片段连接到SpeI-Sbf I线性化的 大PUF11-G6PC-GPE-I片段中，产生pUFll-G阳-G6PC(沈Q ID N0:1)。通过DNA测序确认所有 构建体。
[0136] 分别使用pUF 11-G 阳-G6PC 和 pUF 11 -mG6I^s e-a -CBA 产生AAV-G 阳和AAV-CBA，并且 如之前所述产生、纯化和滴定(Ghosh et al.，Gene Therl3:321-329,2006)。使用实时PCR 利用针对G6PC或CBA启动子的引物和探针进行载体基因组定量。
[0137] 向G6pc-/-小鼠输注AAV载体
[0138] 如之前所述对G6pc^^J、鼠给予葡萄糖疗法，其由每12小时腹膜内注射25-lOOiil 15%葡萄糖组成化ei et al. ,Nat Genet 13:203-209,1996)。使断奶存活的小鼠不受限地 食用小鼠饲料(Zeigler &ros. ,Inc. ,Gardners,PA)。
[0139] 通过颠静脉向2天龄的G6p(T/-小鼠输注，W及通过眶后静脉窦向2或4周龄的 66口。-/-小鼠输注44￥载体。使用年龄匹配的66口(3+/76化(3+/-和4至6周龄的66口(3-/-小鼠作为对 照。对于病毒输注的小鼠，在输注后立即停止葡萄糖疗法。
[0140] 12或14周龄的AAV-GPE输注的G6pc-/-小鼠的葡糖耐量测试由采血前禁食6小时，然 后皮下注射0.25ml 10%右旋糖，并且每30分钟通过尾静脉重复采血(持续额外2小时）组 成。
[0141] 憐酸水解酶测定
[0142] 基本上如之前的描述进行微粒体分离和憐酸水解酶测定化ei et al化t Genet 13:203-209,1996)。将包含50mM pH 6.5的二甲神酸盐缓冲液、IOmM G6P和适量的微粒体制 品的反应混合物（IOOiU)在37°C下解育10分钟。通过将完整膜在0.2%脱氧胆酸盐中于(TC 下解育20分钟来制备破坏的微粒体膜。通过将抑5的破坏的微粒体制品在37°C下预解育10 分钟使酸性不稳定的G6化se-a失活来评估非特异性憐酸酶活性。
[0143] 通过将10皿厚的肝脏组织切片于室溫下在包含40mM pH 6.5的Tris-马来酸盐、 IOmM G6P、300mM薦糖和3.6mM硝酸铅的溶液中解育10分钟来进行G6化se-a的酶组织化学分 析（TeutschJrog Histochem切tocheml4:1-92,1981)。捕获的憐酸铅在转化成褐色硫化 铅后可视化（Teutsch,Prog Histochem Cytochem 14:1-92,1981)。
[0144] 表型分析
[0145] 从尾静脉采集血样。使用获自化ermo Electron!；LouiSVilie,CO)的试剂盒分析血 糖、总胆固醇和尿酸。使用获自Sigma Dia即OStics(St Louis ,MO)的试剂盒测量甘油S醋， 通过来自Trinity BiotecMst. Louis ,MO)的试剂盒测量乳酸。
[0146] 对于苏木精和曙红化&E) W及油红0染色，将肝脏切片保存在10%中性缓冲的福尔 马林中，并且切成4-10微米厚度。使用Axioskop化Ius显微镜和AxioVision 4.5软件(Carl ZeiSS，化ornwood，NY)使染色的切片可视化。对于脂质积累的定量组织学测量，使用Adobe Photoshop CS3(Adobe System Inco;rporated,San Jose,CA)将油红0染色转变成像素密度 单位。
[0147] 为了确定肝糖原含量，用HCl使组织均质化（煮沸10分钟），并且用醋酸钢中和到 4.5的最终抑(Teutsch,Prog Histochem 切tochem 14:1-92,1981)。然后将水解的组织用 淀粉-Q-I，4-a-l ,6-葡萄糖巧酶消化，并且使用获自Sigma Diagnostics的试剂盒测量释放 的葡萄糖。糖原含量报道为nmol糖基单元/mg肝蛋白。
[014引抗体测定
[0149]通过蛋白质印迹分析测定针对人和小鼠 G6化se-a的抗体。通过12%聚丙締酷胺 SDS凝胶的电泳并且将印迹转移到聚偏二氣乙締膜(Millipore，Be壯ord，M)上来解析来自 Ad-human G6F*ase-a或Ad-mouse G6F*ase-a感染的COS-I细胞（Ghosh et al.,J Biol 化em 277 :32837-32842,2002)的微粒体蛋白。将所述膜放在包含多通道的Multi screen Apparatus(Bio-Rad Laboratories,胎rcules ,CA)中。用1: 3000稀释的兔抗人G6F*ase-a血 清Whosh et al. J Biol Chem 277:32837-32842,2002)或者 1:200稀释的来自AAV-G阳输 注的或AAV-CBA输注的动物的血清样品解育每个通道下的膜带(membrane S化ip)。使用来 自未处理的G6pc-/-和G6pc+/7G6pc+/-同窝出生仔的血清样品作为对照。在过夜解育后，然后 用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠 IgG(Kirkega;rrd&Pe;rry Laboratories ,Gaithersburg ,MD)鹏育膜带 D通过使用来自 Pierce (Rockford，IL)的 SuperSignal? West Pico化学发光底物的化学发光系统使免疫复合物可视化。
[0150] CD8+淋己细胞免疫检测
[0151] 将小鼠肝脏骤冷，包埋在0. C. T.(Sakura Finetek，Terrance，CA)中，并且切成8微 米厚度的切片。将切片在丙酬中于-20°C下固定10分钟，干燥，用PBS洗涂，用含有2%BSA的 PBS封闭30分钟，并且用溶于补充有1%BSA的PBS中的针对CD8的兔多克隆抗体（Abeam Inc.，Cambridge, MA)在4 °C解育过夜。用PBS洗涂后，将切片用与Alexa Fluor愈488 (Invitrogen)染料缀合的山羊抗大鼠 IgG抗体在黑暗中于25 °C下解育1小时。用PBS洗涂后， 用含有DAPI的抗稱色水基封固剂（Vector Laboratories ,Burlingame ,CA)固定标记的细 胞，并且使用Axioskop化Ius巧光显微镜Karl Zeiss,Hiornwood,NY)可视化。对200倍放大 率下的十个随机选择的视野中的CD8+细胞计数，并且报道为平均值。
[0152] 统计学分析
[0153] 使用GraphPadPrism嚴程序版本4(GraphPad Software,San Diego,CA)进行未配 对的t检验。p<0.05时认为值是统计学上显著的。
[0154] 结果
[0155] AAV-G阳输注指导长期肝G6化se-a表达
[0156] 为了检验之前研究的人G6PC启动子元件化oeberl et al. ,Mol化6'16:665-672， 2008)的核巧酸-298上游的序列的体内影响，构建了在人G6PC5'侧翼区的核巧酸-2864至-1 的控制下表达人G6化se-a的AAV8载体AAV-GPE。由于没有在小鼠中开始AAV介导的基因疗法 的标准年龄（Ghosh et al.,Gene Ther 13 :321-329,2006 !Koeberl et al.,Gene Ther 13:1281-1289,2006;Koeberl et al.，Mol Ilier 16:665-672,2008)，并且有证据表明基因 转移的效率和持久性的丧失受与肝脏生长有关的肝细胞增殖速率增加的影响(Cunnin曲am et al.，Mol Ther 16:1081-1088,2008)，在2天龄、2周龄或4周龄的S个不同年龄输注 G6pc-/-小鼠，并且在24周龄时检查肝G6化se-a表达。尽管年龄具有差异，但是每组小鼠用相 同剂量的AAV-GPEU.2Xl〇ii病毒基因组(Vg)/小鼠）输注。在24周研究期间监测输注小鼠的 代谢谱，并且将所有测量值与其G6pc+/7G6pc+/-同窝出生仔和4至6周龄的未处理GSpc-/-小 鼠的结果相比较。GSD-Ia是常染色体隐性疾病，之前的研究表明G6pc+/+和G6pc+/-同窝出生 仔的表型与野生型不能区分化ei et al.，Nat Genetl3:203-209，1996)。
[0157] 无论输注时年龄如何，在24周研究期间中，输注的力物中没有过早死亡。在 2天龄时输注AAV-G阳（1.2 X l〇iiyg/小鼠，相当于6 X l〇i3vg/kg)的G6pc-/-小鼠中，2周龄时 的肝G6化se-a活性为对照活性的77.6%，在4周龄时降低至对照活性的16.2%，在6周龄时 降低至对照活性的6.5 % (表1)。但是，在6周W后，肝G6化se-a活性水平稳定，直至24周（表 1)。因此，在整个24周的研究中，表达降低了 11.9倍，最大降低发生在前6周内。
[015引相比之下，在2周龄时输注AAV-G阳（1.2 Xioiiyg/小鼠，相当于1.5 XlQi3VgAg)的 G化C-/-小鼠中，输注后2周时(4周龄时）的肝G6化se-a活性为其G6pc+/7G6pc+/-同窝出生仔 中的活性的2.4倍(表1)，达到433.4 + 11.1皿ol/mg/min。尽管4至6周龄之间肝G6化se-a活 性随后确实经历2.6倍的降低（174.0 ± 22.4皿ol/mg/min)，但是其获得在24周研究期间从6 周龄开始持续的接近正常的肝G6化se-a活性（174.0 ± 22.4nmol/mg/min)(表1)。同样地，在 4周龄时输注相同剂量（1.2X l0iiyg/小鼠，相当于1 X l0i3vg/kg)的AAV-GTO的G6pc-/-小鼠 中，肝G6I^se-a活性在24周龄时为335.6±40.2nmol/min/mg，是对照同窝出生仔中活性的 1.9倍（表1)。运些发现与之前提出的观点（Cunnin曲am et al. ,Mol Ther 16:1081-1088， 2008)-致:基因转移的效率和持久性的丧失受与肝脏生长有关的肝细胞增殖速率增加的 影响。在肝脏生长速率降低的发育晚期阶段注射导致较少的基因表达丧失。
[0159] 研究了肝脏中G6化se-a转基因表达的分布。如预期的，未处理的G6pc-/-小鼠的肝 脏切片中没有可染色的G6化se-a活性。在G6PC+/7G帥C+/-小鼠中，酶组织学分析表明， G6化se-a分布在整个肝脏中，但是在接近血管的地方具有显著更高的水平。
[0160] 在2天龄时输注AAV-GTO的G6pc-/-小鼠中，在2周龄时肝G6化se-a活性分布在整个 肝脏中。不同于野生型小鼠，表达是不均匀的，具有比对照肝脏中染色更强的焦点（foci)。 染色的G6化se-a活性从2周龄至4周龄显著降低，与憐酸水解酶活性4.8倍的降低一致(表 1)。再一次，染色的G6化Se活性降低并且在6周龄和更大时稳定。
[0161] 在2或4周龄时输注AAV-G阳的G6pc^^J、鼠中，酶组织化学分析再次表明，G6Pase-a 转基因分布在整个肝脏中，具有含显著更高酶活性水平的焦点。再一次，通过组织化学分析 评估的G6化se-a活性与定量憐酸水解酶测定一致(表1)。在2周龄时输注AAV-GPE的G6pc-/- 小鼠中，肝脏中具有比野生型肝脏中的细胞染色更浅的细胞。因此，尽管表现出野生型 G6化se-a活性，但是AAV-G阳输注的小鼠中并没有恢复正常的肝G6化se-a表达模式。
[0162] 表1.输注1.2X IQiiyg/小鼠的AAV-GPE的G6pc-/-小鼠中的肝G6I^se活性 [01A31
[i
[0165] 如材料和方法部分中所述，在2天龄、2周龄或4周龄时向G6pc-/-(-/-)小鼠输注1.2 X IQiiyg/小鼠的AAV-GPE。使用年龄匹配的G6pc+/7G6pc+/^+/+&+/-)小鼠作为阳性对照，使 用4至6周龄的G6pc-/-(-/-)小鼠作为阴性对照。已经通过从各结果中减去未处理的G6pc-/- 小鼠肝微粒体中的G6化se-a活性（1.8 ± 0.2nmo 1/min/mg)对表中的值进行了背景校正。数 据表示为平均值±561。
[0166] AAV-CBA输注指导较低水平的肝G6I^se-a表达
[0167] CBA启动子/CMV增强子已经被广泛用于指导高水平的肝转基因表达(Xu et al.， Hum Gene Ilier 12:563-573,2001)。但是，已知CMV增强子被广泛的CpG和非CpG甲基化沉默 (brooks et al.,J Gene Med 6:395-404,2004;Meh1:a et al.,Gene 428:20-24,2009)。之 前使用在杂种CBA启动子/CMV增强子的控制下表达鼠 G6化se-a的AAV8载体AA V-CBA的体内 实验表现出了差的表达(Ghosh et al. ,Gene Ilier 13:321-329,2006)，运可能与CMV启动 子的甲基化有关。为了比较AAV-CBA和AAV-GPE之间的体内肝脏基因转移效率，W与AAV-GPE 实验中类似的方式向G6pc^^J、鼠输注4.8 X IQiiyg/小鼠的增加剂量的AAV-CBA(在2天龄和2 周龄时），并且追踪至24周龄。
[0168] 对于在2天龄时输注的G6pc-/-小鼠，AAV-CBA输注的小鼠中2周龄时肝G6化se-a活 性为AAV-GPE输注小鼠中的2.8倍(表1和2 )，反映了4倍高的AAV-CBA输注剂量。但是，新生 AAV-CBA输注的动物中的肝G6化se-a活性在4周龄时迅速降低到20.6± 1. Inmol/mg/min(表 2)，2周中降低18.6倍，相比之下AAV-GTO输注的新生G6pc-/-小鼠中降低4.8倍(表1)。由于 CBA和GPE具有相同的载体背景，该发现表明CBA启动子/CMV增强子在指导持续的体内肝转 基因表达方面的效率低于G6PC启动子/增强子。
[0169] 在2周龄时输注4.8X l〇iiyg/小鼠的AAV-CBA的G6pc-/-小鼠中，肝G6I^se-a活性在 4周龄时为236.9 ±64.7(表2)，其比在2周龄时输注1.2 Xioiiyg/小鼠的AAV-GPE的4周龄 G6pc-/-小鼠（表1)低1.83倍。另外，使用CBA载体的肝G6化se-a活性从6周龄时的55.7± 2.7皿ol/mg/min持续降低到24周龄时的38.1±1.7nmol/mg/min(表2)。运与使用G阳载体表 达的水平形成对比，后者在该时期内稳定在接近野生型的水平(表1).
[0170] AAV-CBA输注的动物的酶组织化学分析表明活性染色与GPE载体的那些类似，具有 多个比对照肝脏中染色更强的焦点的不均匀分布。但是与定量憐酸水解酶测定(表2)-致， 总染色强度随着输注小鼠年龄的增加显著降低。
[0171] 表2.输注4.8 X IQiiyg/小鼠的AAV-CBA的G6pc-/-小鼠中的肝G6I^se活性
[01791
[0173] 如在材料和方法部分中所述，在2天龄和2周龄时向G6pc^^-/-)小鼠输注4.8 X 1 Qiiyg/小鼠的AAV-CBA。使用年龄匹配的G6pc+/7G6pc+/- (+/+&+/-)小鼠作为阳性对照，使用 4至6周龄的G6pc-/-(-/-)小鼠作为阴性对照。已经通过从各结果中减去未处理的G6pc-/-小 鼠肝微粒体中的G6化se-a活性（1.8±0.2皿ol/min/mg)对表中的值进行了背景校正。数据 表示为平均值±SEM。
[0174] AAV-G阳输注纠正了 GSD-Ia的病理性临床表现
[0175] 接受葡萄糖疗法的G6pc-/-小鼠生长迟缓，并且在2周龄时平均体重为其G6PC+/7 G6pc+/-同窝出生仔的约 60% 化 ei et al.，化 t Genet 13:203-209,1996)。输注 AAV-G 阳的 新生GSpc-/-小鼠具有显著提高的生长速率，并且输注动物的体重与对照小鼠相当（图1)。在 2或4周龄时输注AAV-GPE的G6pc-/-小鼠表现出与其G6pc+/7G6pc+/-同窝出生仔平行但是更 低值的生长曲线，与开始基因疗法之前GSpc-/-小鼠更低的初始体重一致(图1A)。
[0176] 在葡萄糖疗法下，G6pc^^J、鼠持续表现出低血糖、高胆固醇血症、高甘油S脂血 症、高尿酸血症和乳酸血症化ei et al.，Nat Genet 13:203-209，1996;Kim et al.，J 胎patol 48:479-485,2008)。相比之下，AAV-GTO输注的G6pc-/-小鼠具有正常血糖谱（图 1B)，输注的动物中没有出现未处理的G6pc-/-小鼠化ei et al.，化t Genet 13:203-209， 1996)和人GSD-Ia患者(化OU et al. ,Curr Mol Med 2:121-143,2002)中常见的频繁的低 血糖癒痛化ypoglycemic seizure)。新生输注的G6pc-/-小鼠的血糖水平比其对照同窝出生 仔显著更低（图1B)，表明肝G6化se-a活性恢复到对照水平的6.5%不足W维持正常血糖谱。 相比之下，在2或4周龄时输注AAV-GPE的G6pc^^J、鼠中的血糖水平与其对照同窝出生仔中 的血糖水平没有差别（图IB) "AAV-GPE输注还使血清胆固醇、甘油S醋、尿酸和乳酸水平正 常化，但是新生输注的GSpc-/-小鼠具有稍高的血胆固醇和乳酸水平(图1B)。
[0177] 肝肿大是GSD-Ia的另一个临床表现，并且主要由过量的糖原和脂质沉积造成 (Chou et al. ,Curr Mol Med 2:121-143,2002)。在24周龄的未受影响的和AAV-G阳转导的 小鼠的肝脏组织切片中没有观察到组织学异常。24周龄G6pc+/7G6pc+/-小鼠的肝脏中糖原 含量平均为1.89±0.17nmol糖基单元/mg蛋白质。在新生AAV-GPE输注的动物中，24周龄时 的糖原含量显著更高，为4.65 + 0.19nmol糖基单元/mg蛋白质，表明在GSD-Ia小鼠中观察到 了糖原胆积缺陷。相比之下，在2或4周龄接受输注的小鼠在24周龄时表现出野生型的糖原 水平，即分别为1.61 ± 0.39和1.65 ±0.19nmol糖基单元/mg蛋白质，表明在该发育阶段没有 GSD-Ia疾病的典型组织学结构。
[0178] 油红0染色表明，在24周龄时，AAV-G阳输注的动物中的脂质含量与G6pc+/7G6pc+/- 同窝出生仔中的脂质含量类似。对于定量组织化学测量，使用Adobe Photoshop将利用油红 0染色成像的脂质转化成像素密度单位。AAV-GPE处理的G6pc-/-小鼠的肝脏中的密度单位低 于对照小鼠中的那些密度单位(约150像素密度单位/V对比300像素密度单位/V)，但是差 异不是统计学上显著的。总之，运些结果表明，AAV-G阳输注的G6pc-/-小鼠没有表现出组织 学异常并且在肝脏中具有正常糖原和脂肪含量。
[0179] AAV-GPE输注的G6pc-/-小鼠表现出正常空腹葡萄糖和葡糖耐量谱
[0180] 分别检查在2周龄和4周龄时输注AA V-G阳的12和14周龄G6pc-/-小鼠中的空腹葡萄 糖水平。在6小时禁食后，G6pc+/VG6pc+/-小鼠中的血糖水平无变化。重要的是，在2或4周龄 时输注AAV-GPE的G6pc-/-小鼠中的血糖水平在禁食6小时后也没有变化，证明输注的G6pc-/- 小鼠不再患有空腹低血糖，运是GSD-Ia的特征（化OU et al. ,Curr Mol Med 2:121-143， 2002)。使用未处理的GSpc-/-小鼠进行的类似禁食实验获得仅短时间禁食后的迅速低血糖， 然后是低血糖癒痛。
[0181 ] 研究表明，肝G6化se-a的过表达可能诱导糖尿病化iu et al. ,Biochem Bio地ys 民es Commun 205:680-686，1994;Antinozzi et al.,Annu Rev Nutr 19:511-544,1999; Clore et al. ,Diabetes 49:969-974,2000)。由于在4周龄时输注AAV-G阳的24周龄G6pc-/- 小鼠的肝G6化se-a活性为其G6pc+/7G6pc+/-同窝出生仔中活性的近2倍，本发明人在4周龄 时输注AAV-GTO的14周龄G6pc^^J、鼠中进行葡糖耐量测试。作为对照，还在2周龄时输注 AAV-G阳的12周龄G6pc-/-小鼠中进行葡糖耐量测试。运些动物表现出野生型的肝G6化se-a 活性水平。输注的GSpc-/-小鼠中的葡糖耐量谱与对照同窝出生仔无差别。
[0182] 不存在针对人G6化se-a的免疫应答
[0183] 为了确定输注的G6pc-/-小鼠中是否产生针对人G6化se-a的体液应答，使用来自用 AAV-GPE或AAV-CBA输注的小鼠的血清进行蛋白质印迹分析。使用同样识别鼠 G6化se-a的兔 抗人G6化se-a血清作为阳性对照。在任何存活至24周龄的AA V-G阳输注的或AAV-CBA输注的 G6pc-/-小鼠中均没有检出针对G6I^se-a的抗体。此外，在G6pc+/7G6pc+/-同窝出生仔或未处 理的G6pc-/-小鼠的血清中不存在针对G6化se-a的内源抗体。
[0184] AAV-CBA输注引起增加的肝CD8+淋己细胞浸润
[0185] AA V-CBA输注的G6pc-/-小鼠的肝脏中没有可检测的针对G6化se-a的抗体，表明细 胞介导的对于G6化se-a转基因的免疫应答不是运种载体指导的转基因表达迅速降低的原 因。另一种可能性是AAV-CBA载体引起的炎性免疫应答。因此，在向G6pc^^J、鼠输注AAV-CBA 或AAV-GPE后2周检查肝CD8+淋己细胞浸润。在2或4周龄的野生型或G6pc-/-小鼠中，肝CD8+ 淋己细胞计数很低。在2天龄时输注AAV-CBA或AAV-GPE的G6pc-/-小鼠中，每种载体类型的2 周龄时的肝CD8+淋己细胞计数类似，并且与未处理的2周龄野生型或G6pc-/-动物中的计数 相当。在2周龄时输注AAV-GPE的G6pc-/-小鼠中，肝CD8+淋己细胞计数在4周龄时依然很低。 相比之下，在2周龄时输注AAV-CBA的G6pc-/-小鼠中，肝CD8+淋己细胞计数在4周龄时显著增 加。结果表明，AAV-CBA引起的炎性应答可W至少部分地解释了 CBA启动子/CMV增强子指导 的肝G6化se-a表达的迅速降低和低效率。
[0186] 实施例2:使用基因疗法预防肝细胞腺瘤W及纠正IA型糖原胆积病中的代谢异常
[0187] 本实施例描述了在长期研究中评估AAV-GPE载体的效力的研究。G6pc^^J、鼠中 AAV-G阳载体介导的基因疗法在小鼠中有效至少70-90周，表达大于3%的野生型肝G6化se? ct 。结果证明 AAV-GPE 处理的小鼠表现出正常的肝脂肪胆积，正常血代谢物和葡糖耐量谱，降 低的空腹血膜岛素水平，并且没有肝异常的迹象。
[0188] 材料和方法
[0189] 向G6pc-/-小鼠输注AAV-G阳
[0190] 通过眶后静脉窦将AAV-GTO载体（如实施例1中所述，Yiu et al. ,Mol Ther 18: 1076-1084,2010)输注到G6pc-/-小鼠中化ei et al.，化t Genet 13:203-209,1996)。使用 年龄匹配的G6pc+/VG6pc+/-和6至10周龄的G6pc-/-小鼠作为对照。对于病毒输注的小鼠，在 输注后立即停止葡萄糖治疗化ei et al. ,Nat Genet 13:203-209,1996)。
[0191] 小鼠的葡糖耐量测试由采血前禁食6小时，然后腹膜内注射2mg/g体重的葡萄糖溶 液，并且重复通过尾静脉采血2小时组成。
[0192] 憐酸水解酶和微粒体G6P摄取测定
[0193] 如之前的描述进行微粒体分离、憐酸水解酶测定、G6Pase-a的酶组织化学测定和 微粒体G6P摄取测定（Yiu et al.，Mol Ilier 18:1076-1084,2010;Lei et al.，化t Genet 13:203-209,1996)O
[0194] 表型分析
[01巧]首先通过使用Vevo 2100系统（ViSiialSoniCS ,Ontario ,Canada)的超声波检查小 鼠的肝结节化epatic nodule)并且从尾静脉采集血样。使用获自化日；?。Electron 化ouisvilie ,CO)的试剂盒分析血糖、总胆固醇和尿酸；通过来自Sigma Dia即OStics(St Louis ,MO)的试剂盒分析甘油S醋；通过来自Trinity BiotecKst丄ouis,MO)的试剂盒分 析乳酸；W及通过来自化ystal化em(Downers Grove, IL)的超灵敏小鼠膜岛素化ISA试剂 盒分析膜岛素。如之前所述测量肝糖原含量(Yiu et al. ,Mol Ther 18:1076-1084,2010)。 为了确定肝甘油S醋、葡萄糖和G6P含量，将肝脏组织在RIPA缓冲液（50mM pH 8.0的化is 肥l、150mM 化Cl、l%lYiton X-100、0.5%脱氧胆酸钢和0.1%SDS)(Thermo Scientific, Rockford, IL)中均质化，并且使用来自Sigma Diagnostics的试剂盒测量甘油S醋，通过来 自11161'1]1〇616(3化〇]1的试剂盒测量葡萄糖，^及通过来自8；[0￥13；[0]1(1〇11]11日；[]1￥16*,〔4)的 试剂盒测量G6P。
[0196]对于苏木精和曙红（H&E) W 及油红 0染色（Yiu et al. ,Mol TherlS :1076-1084, 2010)，将肝脏切片保存在10%中性缓冲的福尔马林中并且切成4-10微米厚度。使用 Axioskop2plus显微镜W及AxioVision4.5软件（Ca;rlZeiss,l'ho;rnwood,NY)使染色切片 可视化。
[0197]定量实时RT-PCR和抗体分析
[019引使用TRIzol?试剂（Invitrogen ,Carlsbad ,CA)从肝脏组织中分离总RNA。在使用 Applied Biosystems TaqMan探针的Applied Biosystems 7300实时PCR系统（Foster City,CA)中通过实时RT-PCR对mRNA表达进行定量。使用Applied Biosystems SDS vl.3软 件分析数据并且归一化到的敦动蛋白RNA。如之前所述通过蛋白质印迹分析检测针对人 G6I^se-a的抗体（Yiu et al. ,Mol Ilier 18:1076-1084,2010)
[0199] 统计学分析
[0200] 使用GraphPad PHsm驳程序版本4(San Diego,CA)进行未配对t检验。P<0.05时认 为值是统计学显著的。
[0201 ]结果
[0202] AAV-G阳输注指导长期肝G6化se-a表达
[0203] 向2或4周龄的G6pc-/-小鼠（n= 18)输注不同剂量的AAV-G阳（5 X 10"至3 X 10"病 毒颗粒(vpVkg)，所述剂量预期恢复并且维持3%至100%的野生型肝G6化se-a活性。还输 注了一只15周龄(5Xl〇i2vp/kg)和一只30周龄（lXl〇i3vp/kg)G6pc^^J、鼠。接受葡萄糖疗 法的GSD-Ia小鼠的低存活率严重限制了可用于研究的成年小鼠的数目化ei et al. ,Nat Genet 13:203-209，1996)。监测20只输注动物的代谢和组织学谱70至90周，并且将所有测 量结果与其G6pc+/+和G6pc+/-同窝出生仔相比较。G化C+/+和G6pc+/-小鼠的表型与野生型无差 别(Xei et al.,Nat Genet 13:203-209,1996)。
[0204] 没有过早死亡的AAV-GTO处理的G6pc-/-小鼠。在24小时禁食后处死的小鼠中评估 肝G6化se-a活性和糖原含量。70至90周龄的野生型小鼠（n = 20)的平均空腹肝G6化se-a活 性为185.8+ 12.7nmol/mg/min(图2A)。如计划的，经处理的小鼠中恢复了一定范围的肝 G6化se-a活性。在20只AA V-G阳处理的在70至90周龄处死的G6pc-/-小鼠中，6只小鼠具有低 水平（野生型活性的3%至9%)的肝G6化se-a活性并且称为AAV-L，9只小鼠具有中等水平 (野生型活性的22%至63%)的肝G6化se-a活性并且称为AAV-M，5只小鼠具有高水平(野生 型活性的81 %至128%)的肝G6化se-a活性并且称为AAV-H(图2A)。实时RT-PCR分析表示出 了肝G6化se-amRNA表达和G6化se-a活性之间的线性关系（图2B)。
[0205] 酶组织化学分析表明，野生型小鼠中的G6化se-a分布在整个肝脏中，在接近血管 的地方具有显著更高的水平。在未处理的小鼠G6pc-/-的肝脏切片中，没有可染色的G6化se- a活性。在AAV-G阳处理的G6pc^^J、鼠中，G6Pase-a也分布在整个肝脏中，但是具有含显著更 高水平酶活性的焦点，并且与血管无关。AAV-GPE处理的G6pc-/-小鼠中肝G6化se-a的不均匀 分布表明相当大比例的肝细胞具有低的或者几乎没有G6化se-a，包括表达野生型G6化se-a 活性的81-128%的AAV-H肝脏。不均匀的肝G6化se-a表达不是GSD-Ia表型营救所需的。
[0206] AAV-G阳输注纠正GSD-Ia中的代谢异常
[0207] GSD-Ia W低血糖、高胆固醇血症、高甘油S脂血症、高尿酸血症和乳酸血症为特征 (Xei et al.,Nat Genet 13:203-209,1996;Kim et al.,J Hepatol 48:479-485,2008)。 表达野生型肝G6化se-a活性的AAV-H小鼠中的血糖水平与对照同窝出生仔中的那些血糖水 平无差别（图3A)。分别表达22-63 %和3-9 %的正常肝G6I^se-a活性的AAV-M和AAV-L的也保 持了血糖正常（~lOOmg/dl)状态（Yoshizawa et al.，J Clin Invest 119:2807-2817， 2009)，但是其血糖水平始终低于对照同窝出生仔（图3A)。所有AAV-GPE处理的G6p(T/-小鼠 表现出正常的胆固醇和甘油S醋的血清谱，而经处理的GSpc-/-小鼠中的尿酸和乳酸血清水 平低于对照同窝出生仔中的那些尿酸和乳酸血清水平（图3A)。
[020引 70至90周龄的雌性和雄性AAV-G阳处理小鼠的平均体重分别为其年龄和性别匹配 的对照小鼠中的70%和62% (图3B)。但是经处理的G6pc-/-小鼠的平均体长为对照的90% (图3B)。因此，AAV-GPE处理的G6pc-/-小鼠的体重指数(BMI)值（B址ary et al.，Proc化tl Acad Sci USA87:8642-8646，1990)显著低于对照同窝出生仔中的那些BMI值（图3B)。尽管 两组小鼠的BMI值表明为正常生长（Bahary et al. ,Proc r^tlAcadSciUSA 87:8642- 8646,1990)，但是AAV-GPE处理的G6pc-/-小鼠相当瘦。野生型小鼠的肝重量相对恒定（图 3C)。在AAV-G阳输注的小鼠中，肝重量与恢复的肝G6化se-a活性逆相关（图3C)。当肝重量表 示为体重的百分比时，AAV-GPE处理的GSpc-/-小鼠具有显著更高的值，因为其体重较低。但 是，当直接比较绝对肝重量时，AAV-M、AAV-H和对照同窝出生仔之间没有显著差异（图3C)。 但是，AAV-L小鼠持续表现出肝肿大。AAV-G阳向肾递送很少或不递送转基因（Yiu et al.， Mol Ther 18:1076-1084，2010)。但是，表达更高G6化se-a活性的输注小鼠具有更低肾重 量，表明好的肝代谢控制使肾肥大正常化。
[0209] AAV-G阳输注的G6pc-/-的肝脏中不存在组织异常、脂肪变性或HCA
[0210] 为了确定AAV-GPE处理的G6pc^^h鼠中HCA结节的存在，每个肝脏使用5个或更多 个独立切片进行超声分析，然后进行广泛的肝脏检查和肝活检样品的组织学分析。在存活 至70-90周龄的野生型(n = 20)和44￥-6阳转导的66口。-/-(11 = 20)小鼠中超声和形态学分析 没有检出肝结节。在2或4周龄输注的AAV-GPE处理的G6pc^^h鼠（n=18)除了增加的糖原胆 积外没有表现出组织学异常。在15周龄输注的84周龄小鼠（表达正常肝G6化se-a活性的 6%)表现出提高的糖原胆积并且在一个肝脏切片中具有一些坏死性病灶(foci)。尽管大部 分在30周龄输注的90周龄小鼠的肝脏组织切片（表达正常肝G6化se-a活性的38%)其未表 现出组织学异常，但是一个肝脏切片确实具有许多坏死性病灶。因为坏死性病灶是6周龄或 更大的未处理的GSD-Ia小鼠中见到的典型肝病状化im et al. J胎patol 48:479-485， 2008)，非常可能的是在15或30周龄的基因疗法开始之前坏死性病灶已经形成。
[02川已经报道了肝特异性G6pc无效(null)小鼠的肝脏形成了具有显著脂肪变性的肥A (Mutel et al. J Hepatol 54:529-537,2011)。尽管一些野生型小鼠具有提高的肝脂肪胆 积，但是在AAV-G阳处理的G6pc-/-小鼠的肝脏中几乎没有或没有脂肪胆积。此外，AAV-GPE处 理的G6p(TM、鼠（n = 20)中的肝甘油S醋含量与野生型小鼠中的肝甘油S醋含量没有统计 学差异。油红0染色确认了 AAV-GPE处理动物(n = 20)中脂质含量与对照动物中的脂质含量 类似。
[0212] 已经充分确认，环氧合酶-2(C0X-2)是在许多恶变前和恶性癌症中（包括肥C)中过 表达的标志物(Wu,Cancer Treat Rev 32: 28-44,2006)。定量RT-PCR分析表明，AAV-GPE处 理的G6pc^^日对照同窝出生仔中表达类似的肝C0X-2信使水平。
[0213] AAV-GPE处理的G6pc-/-小鼠表现正常空腹葡萄糖和葡糖耐量谱
[0214] 开始禁食前野生型小鼠（n = 20)的平均血糖水平为165.0±3.0mg/dl(零时间），其 在禁食24小时后降低到113.3±6.5111旨/(11(图44)。44￥-1和44￥-1小鼠的空腹血糖谱与对照 小鼠的空腹血糖谱平行，但是血糖水平始终较低（图4A)，而AAV-H小鼠的空腹葡萄糖谱与对 照小鼠的空腹葡萄糖谱无区别。鲜明对比的是，未处理的GSpc-/-小鼠在禁食60至75分钟内 表现出显著的低血糖（图4B)，运是GSD-Ia的标志（化OU et al.,化t Rev Endocrinol 6: 676-688,2010)。总之，AAV-G阳处理的G6pc-/-小鼠不再患有GSD-Ia的空腹低血糖特征(Chou et al.,Nat Rev Elndocrinol 6:676-688,2010)。
[0215] AAV-M和AAV-H小鼠中的血糖耐量谱与野生型同窝出生仔的那些血糖耐量谱无区 另Ij(图4C)。在AAV-L小鼠中，腹膜内葡萄糖注射后，血糖水平W比野生型对照更快的速率降 低。
[0216] AAV-GPE处理的G6pc-/-小鼠中降低的空腹血膜岛素水平
[0217] 膜岛素信号转导调节肝葡萄糖和脂质代谢化eavens and Birnbaum,Crit Rev Biochem Mol Biol 46:200-215,2011)。禁食24小时后，70-90周龄的野生型(n = 20)和AAV- GPE处理的G6pc-/-小鼠（n = 20)中的血膜岛素水平分别为1.84±0.29和0.56 ±0.09ng/ml (图 5A)。二者均在正常范围内（de Luca et al. J Clin Invest 115::3484-3493,2005)，但 是AA V-G阳处理的G6pc-/-小鼠中的空腹血膜岛素水平更接近正常平均值(de Luca et al.， J Clin Investl 15:3484-3493,2005)。尽管AAV-GPE处理的G6pc-/-小鼠中的空腹血膜岛素 水平与恢复的肝G6化se-a不相关，但是野生型和经处理的G6pc-/-小鼠中的膜岛素水平与其 体重表现出线性关系（图5A)。
[0218] 膜岛素的转录效果是由固醇调节元件结合蛋白Ic(SREBP-Ic)介导化eavens and Birnbaum,Crit Rev Biochem Mol Biol 46:200-215,2011)。定量RT-PCR分析表明，禁食24 小时的AAV-GTO处理的G6pc-/-小鼠和对照小鼠表达了类似水平的肝SREBP-IC转录物（图 5B)。葡萄糖激酶是葡萄糖感受器(Massa et al. ,IUBMB Life 63:1-6,2011)。当血膜岛素 水平低时，如在禁食时，肝葡萄糖激酶活性降低（Massa et al. ,IUBMB Life 63:1-6， 2011)。如利用血膜岛素所看到的，在禁食24小时后，AAV-GPE处理的G6pc-/-小鼠中的肝葡萄 糖激酶转录物显著低于对照同窝出生仔中的肝葡萄糖激酶转录物（图5C)。值得注意的是， 肝葡萄糖激酶mRNA的水平和空腹血膜岛素的水平在野生型和AAV-G阳处理的G6p(T/-小鼠中 均表现出线性关系（图5C)。
[0219] AAV-GPE输注的G6pc-/-小鼠的肝脏中的葡萄糖稳态
[0220] 禁食期间，通过在糖异生和糖原分解的最终步骤中由G6PT/G6Pase-a复合物使G6P 水解来在肝脏中产生内源葡萄糖来维持血糖稳态（化OU et al.Nat Rev Endocrinol 6: 676-688,2010)。缺少功能性66化36-〇的66口。-/-小鼠不能肝脏、肾或肠中产生内源葡萄糖。 禁食24小时后，野生型小鼠（n = 20)中的肝游离葡萄糖水平为389±17nmol/mg蛋白质，AAV- L(n = 6)、AAV-M(n = 9)和AAV-H(n = 5)小鼠中的肝游离葡萄糖水平分别为野生型小鼠中的 61 %、68 %和90 %。禁食AAV-L和AAV-M肝脏中的细胞内G6P水平分别为野生型肝脏中细胞内 G6P水平的2.9倍和1.6倍，但是禁食AAV-H肝脏中的细胞内G6P水平与野生型肝脏中的细胞 内G6P水平在统计学上类似。
[0221] 肝G6P参与多种代谢途径，包括细胞质中的糖原合成、糖酵解、戊糖憐酸途径W及 ER腔中的内源葡萄糖产生。禁食24小时后，在小鼠中检查参与上述途径的多种关键酶的肝 表达。运些包括催化肝糖异生中的第一个关键步骤的胞质憐酸締醇式丙酬酸激酶。6?0(- CKHanson and Reshef,BiocMmie 85:1199-1205,2003);将果糖-1,6-二憐酸转化成果 糖-6憐酸的果糖-1,6-二憐酸酶（FBPase-I)化ers, J Inherit Metab Dis 13:395-410， 1990);在糖原分解和糖原合成中催化葡萄糖-6-P和葡萄糖-I-P的可逆转化的葡萄糖憐酸 变位酶(PGMase)化ers,J Inherit Metab Dis 13:395-410,1990);通过将果糖-6-P转化成 果糖-1，6-二憐酸来催化糖酵解中的不可逆限速步骤的憐酸果糖激酶1 (PFK-1)化ers，J Inherit Metab Dis 13:395-410,1990);通过将G6P转化成6-憐酸葡糖酸内醋来催化戊糖 憐酸途径中的第一个反应的G6P脱氨酶(G6PDH) (Wamelink et al. ,J Inherit Metab Dis 31:703-717,2008);?及将胞质G6P转运到ER腔中的G6PT(Chou et al.，Nat Rev Elndocrinol 6:676-688,2010)。
[0222] 定量实时RT-PCR分析表明，在禁食肝脏中，与对照相比，AAV-GTO处理的G6pc-/-小 鼠中阳PCK-C和PGMase转录物无变化，而FB化se-1转录物增力日。AAkUff脏中的PFK-I转录物 和G6PDH转录物二者均增加，但是在AAV-M和AAV-H肝脏中其依然与野生型肝脏中在统计学 上类似。不论所恢复的肝G6化se-a活性水平如何，AAV-GTO处理的G6pc-/-小鼠中的肝G6PT mRNA水平为野生型对照中的2.2倍。G6PT介导的肝微粒体G6P摄取活性是内源葡萄糖产生中 的速度限制（Arion et al.，J Biol 化em251:6784-690,1976)，但是共同依赖于G6化se-a 活性化ei et al.，化t Genet 13:203-209,1996)。与野生型肝微粒体相比，由G6pc-/-小鼠 制备的肝微粒体（具有完整的G6PT)表现出显著更低的G6P摄取活性化ei et al.，Nat Genet 13:203-209,1996)，如果通过基因转移使G6化se-a活性恢复，其可W逆转（Zingone et al. J Biol Chem 275:828-832,2000)。在AAV-L、AAV-M和AAV-H肝脏中，微粒体G6P摄取 活性分别为野生型活性的43%、50%和72%，反映了与肝游离葡萄糖水平平行的肝G6化se? ct 活性的增加 (图 2A)。
[0223] 不存在针对人G6化se-a的免疫应答
[0224] 为了确定在输注的小鼠中是否产生针对人G6化se-a的体液应答，使用从70-90周 龄的对照和AAV-GTO处理的GSpc-/-小鼠获得的血清进行蛋白质印迹分析。使用也识别鼠 G6化se-a的针对人G6I^se-a的单克隆抗体(Yiu et al. ,Mol Ilier 18:1076-1084,2010)作 为阳性对照。在任何存活到70至90周龄的AAV-G阳输注的G6pc-/-小鼠或野生型对照小鼠中 均未检出针对G6化S e-a的抗体。
[0225] 实施例3:G6PC启动子的上游增强子元件对于Ia型糖原胆积病中的最佳 [0。6] G6PC表达是关键的
[0227]本实施例描述的研究进一步评估了 AAV-G阳载体的效力。AAV-G阳是包含2684bp的 G6PC启动子/增强子的单链载体，将其与包含38化P的最小G6PC启动子/增强子的双链载体 AAV-miG阳相比较。本实施例中所述的结果表明与AAV-miG阳载体相比，AAV-G阳载体在GSD- Ia小鼠中指导了显著更高水平的肝G6化se-a表达，取得了肝糖原积累的更大的降低，并且 获得更好的空腹耐受性。
[022引材料和方法
[0229] 向G6pc-/-小鼠输注rAAV载体
[0230] 所有G6pc-/-小鼠利用葡萄糖疗法保持存活化ei et al. ,Nat.Genet. 13:203- 209，1996)。通过眶后静脉窦将rAAV载体输注到2周龄G6pc-/-小鼠中。使用年龄匹配的G6pc +/7G6pc+/-小鼠作为对照。对于rAAV载体输注的小鼠，在输注后立即终止葡萄糖疗法。在2周 龄说PC-/-小鼠中进行所有病毒转导并且在12周龄时评估效力。
[0231 ] 憐酸水解酶测定
[0232] 基本上如之前所述，确定微粒体分离和憐酸水解酶测定（Le i et a 1 .， Nat. Genet. 13:203-209，1996)。对于憐酸水解酶测定，将包含50mM pH 6.5的二甲神酸盐缓 冲液、1 OmM G6P和适量微粒体制品的反应混合物（100山)在30°C下解育10分钟。通过将完整 膜在0.2%脱氧胆酸盐中于(TC下解育20分钟来制备破坏的微粒体膜。通过将pH 5的破坏的 微粒体制品在37°C下预解育10分钟使酸性不稳定的G6化se-a失活来评估非特异性憐酸酶 活性。
[0233] 载体DNA和mRNA的定量
[0234] 使用Ge址lute? Mammalian Genomic DNA Miniprep Kits(Sigma-Aldrich,St Louis ,MO)分离来自小鼠组织的总DNA，使用TRIzol? ReagentQnvitrogen,Carlsbad,CA) 从小鼠组织分离总RNA。分别在使用App I i e d B i O S y S t ems Ta qMan探针的Applied Biosystems 7300实时PCR系统中（Applied Biosystems,Foster City,CA)通过PCR和实时 RT-PCR对载体基因组数目和mRNA表达进行定量。使用TaqMan探针组化00609178_ml (对于 G6PC)和Mm00607939_s 1 (对于0-激动蛋白）将人G6PC基因的数目归一化至小鼠0-激动蛋白。 标准曲线中使用对应于0.01至100拷贝的人G6PC基因的质粒DNA。为了确定载体基因组拷贝 数，将样品的Ct值与标准曲线比较。使用TaqMan膨探针组化00609178_ml (对于G6PC)和 Mm02601633_g 1 (对于化 119)将G6PC mRNA表达归一化至化 119RNA。
[0235] 表型分析
[0236] 使用获自!"Iiermo Electron(Lc)Uisville ,CO)的试剂盒分析血糖。如之前所述，测J 量肝糖原和憐酸S醋含量(参见实施例1和2, W及Yiu et al.，Mol. Ther. 18:1076-1084, 2010;Lee et al. ,Hepatology 56:1719-1729,2012)。为了确定肝甘油S醋，将肝脏组织在 RIPA缓冲液巧OmM pH 8.0的Tris HCl、150mM NaCl、l%Triton X-100、0.5%脱氧胆酸钢和 0.1%SDS)(The;rmo Scientific,Rockford,IL)中均质化，并且使用来自 Sigma Dia即ostics(St Louis,MO)的试剂盒测量甘油S醋。
[0237] 小鼠的葡糖耐量测试由采血前禁食6小时，然后腹膜内注射2mg/g体重的葡萄糖溶 液，并且重复通过尾静脉采血2小时组成。
[0238] 统计学分析
[0239] 使用GraphPadPrism敏程序版本4(GraphPad Software,San Diego,CA)进行未配 对的t检验。p<0.05时认为值是统计学上显著的。
[0240] 结果
[0241] rAAV-G阳处理的或rAAV-miG阳处理的说PC-/-小鼠中的肝G6Pase-a表达
[0242] 在处理的G6pc-/-小鼠中进行12周的研究W检查rAAV-G阳(参见实施例1和Yiu et al.，Mol.Ther. 18:1076-1084,2010)和rAAV-miG阳化oeberl et al.，Mol.Ther. 16:665- 672,2008)载体的效力。每种载体在两个不同研究中屯、使用两个剂量，1 XlQi3病毒颗粒 (VP)Ag(高剂量)和2Xl〇i2vp/kg(低剂量），每组6只小鼠。两个中屯、获得了类似结果。尽管 转导的G6pc-/-小鼠中的肝G6化se-a活性代表了两个中屯、的组合数据，但是其他报道的数 据来自单个研究。研究表明，rAAV介导的肝基因转移的效率和持久性在早期发育中较低，运 是因为与肝脏生长有关的快速肝细胞增殖速率，其稀释了rAAV有效转染的细胞的数目（Yiu et al. ,Mol .Hier. 18:1076-1084,2010;Cunnin曲am,Mol .Hier. 16:1081-1088,2008)。在本 研究中，当肝细胞增殖保持为高时，向2周龄G6pc-/-小鼠给予rAAV载体。结果，在12周龄时 检查的肝G6化se-a表达显著低于用相同载体剂量输注的成年小鼠中看到的肝G6化se-a表 达。依然需要确定人疾病中的最佳介入时间。
[0243] 所有处理的G6pc-/-小鼠存活至12周龄，两个中屯、均没有过早死亡。在12周龄野生 型小鼠的肝脏中，微粒体G6F*ase-a活性为203.5 ± 10.3nmol/min/mg(n = 24)。在两个中屯、独 立确定的组合数据(每次处理n = 12)表明，在12周龄时，高剂量rAAV-G阳疗法重建了约18 % 的野生型肝G6化se-a活性，其为rAAV-miG阳活性的3.5倍W上，而低剂量rAAV-G阳疗法产生 的活性为rAAV-miG阳的3.6倍W上（图6A)。肝G6化se-a活性与肝载体基因组拷贝数呈线性 关系增加，AAV-G阳处理的G6pc-/-小鼠（n = 6)中的拷贝数显著高于rAAV-miGPE处理的小鼠 (n = 6)(图 6A)。
[0244] rAAV-GPE 或 rAAV-miGPE 处理的 G6pc-/-小鼠的代谢谱
[0245] 所有rAAV-G阳和r AAV-miG阳处理的G6pc-/-小鼠表现出与其野生型同窝出生仔平 行的生长曲线，但是具有更低体重（图6B)。不论载体或剂量水平如何，经处理小鼠的体重指 数(BMI)值与野生型小鼠无区别（图6C)。所有经处理的G6pc-/-小鼠的血糖水平始终低于野 生型对照，但是依然高于正常范围的下限（图6D)，输注的动物均不具有GSD-Ia的典型的频 繁低血糖癒痛（Chou et al.,Curr.Mol.Med.2:121-143,2002;Chou et al.化t.Rev.Elndocrinol.6:676-688,2010;Lee et al.,Hepatology 56:1719-1729, 2012)0
[0246] 肝脏相对于体重的相对重量是对肝糖原和/或中性脂肪积累的一种量度(Chou et al.,Curr.Mol.Med.2:121-143,2002;Chou et al化t.Rev.Endocrinol.6:676-688, 2010)，其在所有4个经处理的G6pc-/-小鼠组中均高于野生型小鼠，但是高剂量rAAV-G阳处 理的小鼠比其他组显著更接近于正常（图7A)。与此一致的是，rAAV-G阳和rAAV-miG阳处理 的G6pc-/-小鼠中的糖原含量显著低于其野生型对照（图7B)，较高载体剂量比较低载体剂 量更好地减少糖原，证明恢复更高的肝G6化se-a表达改善了肝肿大。但是，仅比较高剂量疗 法时，rAAV-miG阳处理的小鼠具有的糖原比rAAV-GPE处理的小鼠多43%。尽管肝糖原持续 升高，但是在任何12周龄的rAAV处理的G6pc-/-小鼠的肝脏组织切片中均没有观察到组织 学异常。除了低剂量的rAAV-miG阳处理的小鼠W外，野生型和其他3组rAAV处理的G6pc-/- 小鼠之间的肝甘油=醋含量没有统计学差异（图7C)。
[0247] rAAV-G阳处理的和rAAV-miG阳处理的G6pc-/-小鼠中的空腹葡萄糖和葡糖耐量谱
[0248] 对于野生型小鼠（n = 24)，禁食前的平均血糖水平为172.2 ± 2.6mg/dl (零时间）， 其在禁食8小时后降低到134.6 ± 3.8mg/dl (图8A)。高剂量疗法的小鼠（每种处理n = 6)的空 腹血糖谱显著好于低剂量疗法的小鼠（每种处理n = 6)，但是即使在高剂量下，rAAV-GPE处 理的小鼠保持显著更高的葡萄糖水平，其在禁食6小时内稳定至野生型水平，而rAAV-miGPE 处理的小鼠的稳定期（plateau)更低，为野生型水平的60% (图8A)。高剂量rAAV-GPE和 rAAV-miG阳处理的小鼠还可W维持24小时禁食，但是rAAV-G阳处理的小鼠中的空腹血糖水 平比rAAV-miGPE处理的小鼠中的空腹血糖水平显著更高（图8B)。总之，相比于rAAV-miGPE 处理的G6pc-/-小鼠，rAAV-GTO处理的G6pc-/-小鼠更接近于野生型并且更加能够耐受禁 食。
[0249] 在腹膜内葡萄糖注射后监测经处理的G6pc-/-小鼠（每种处理n = 6)的血糖耐量 谱。总的来说，所述谱平行于野生型小鼠（图SC)，高剂量处理的小鼠的应答比低剂量处理的 小鼠更好。
[0巧0] 通过定量PCR分析12周龄的高剂量rAAV-GTO处理的G6pc-/-小鼠中人G6PC转基因 在肝脏、肾、肠、脑、睾丸和卵巢中的生物学分布(表1)。在转导的肝脏中，载体基因组拷贝 数Aig DNA为94，440 ± 7，624(或者0.51 ±0.04载体拷贝/二倍体基因组）。在转导的肾和肠 中，数目急剧降低，平均分别仅为肝拷贝数的2.57%和0.64%，表明rAAV8病毒不能有效转 导肾和肠。脑和睾丸中的基因组拷贝数/yg DNA甚至更低，分别为肝拷贝数的0.12%和 0.02%。在卵巢中仅检出了背景水平的人G6PC基因组。
[0251] 包含组织特异性启动子/增强子元件的rAAV-GTO载体主要在肝脏、肾近端小管和 肠中表达（Chou et al.,Curr.Mol.Med.2:121-143,2002;Chou et al., Nat. Rev.化docrinol. 6:676-688，2010)。人G6PC转录物的定量实时RT-PCR分析示出了基因 组拷贝数和基因表达之间的相关性(表3)。在肝脏中，与化119转录物相比的人G6PC mRNA的 水平为0.62740±0.04445。如从基因拷贝数分析所预期的，肾仅表达肝人66口(：1111?論的 0.03%，在肠、脑、睾丸和卵巢中仅检出了背景水平的人G6PC mRNA。
[0252] 表3.12周龄高剂量rAAV-G阳处理的G6pc-/-小鼠中人G6PC基因组分布和mRNA表达 「0巧31
[0254] 数据为平均值±SEM。不包含转基因的野生型组织的值为肝脏、肾、肠、脑、睾丸和 卵巢的平均值±SEM。括号中的数值为肝脏值的％。
[02W]实施例4:具有和不具有填充序列的AAV载体的比较
[0256] 本实施例描述了 W下发现:表达G6化se-a的AAV载体中内含子侧翼的填充核巧酸 序列对于有效肝转导很重要。
[0257] 为了评估填充序列对G6化se-a的转基因递送和肝表达的贡献，构建了质粒UFll- K29-G6PCdUF11-K29-G6PC(沈Q ID N0:2)与UFll-G阳-G6PC(沈Q ID N0:1)的区别在于缺少 内含子周围的填充序列。每种质粒中的G6PC启动子/增强子(GPE)和G6PC编码序列相同。
[0258] 向G6pc-/-小鼠给予 1 X l〇i3vp/kg的重组AAV-K29-G6PC或重组AAV-G阳-G6PC。结果 表明与AAV-G阳-G6PC相比，AAV-K29-G6PC在GSD-Ia小鼠中表现出显著降低的肝转导效率。 八八￥-1(29-66?(：转导的肝脏和44￥-6?6-66?(：转导的肝脏中的66化36活性分别为7.3和 33.0nmol/min/mg。运些结果证明，内含子侧翼的填充序列对于有效肝转导很重要。
[0259] 实施例5:编码密码子优化的G6PC的AAV载体的产生
[0260] 本实施例描述了含密码子优化的G6PC的AAV载体的构建和表征。 惦61] UFll-G阳-CO-G6PC质粒(包含密码子优化的G6PC;SEQ ID NO:3)来源于UFll-GW- G6PC质粒(SEQ ID N0:1)，但是将AAV-G阳-G6PC中的野生型G6化Se编码序列替换成了合成 的密码子优化的G6I^se(SEQ ID N0:3的核巧酸3368-4441)。
[0262] 转录物体内表达测定表明，CO-G6化Se表现出的酶活性为野生型人G6化Se的1.9 倍。另外，在GSD-Ia小鼠中评估了两个批次的重组AAV-GPE-CO-G6PC的体内活性并且与重组 AAV-G阳-G6PC的活性相比较。第一批次的AAV-GPE-CO-G6PC在转导肝脏方面的效率比AAV- GPE-G6PC高50%。第二批次的AAV-GPE-co-G6PC在转导肝脏方面的效率比重组AAV-GPE- G6PC高2.5倍。
[0263] 运些结果证明，G6PC的密码子优化提高了表达G6化se-a的重组AAV的肝脏转导能 力。
[0264] 实施例6:表达密码子优化的人G6化Se的重组AAV载体的效力的评估
[02化]本实施例描述了在GSD-Ia小鼠中比较rAAV8-G阳-G6Pase和rAAV8-G阳-CO-GSPase 介导的基因递送的效力的研究。
[0%6] 使用2-3个独立批次的两种AAV载体比较GSD-Ia小鼠中的基因递送的效力：1) rAAV8-G阳-G6Pase(在~3kb的人G6PC启动子/增强子(G阳）指导下表达人G6I^se-a的rAAV8 载体；W及2)rAAV8-GPE-c〇-G6I^se (在G阳的指导下表达密码子优化的（CO)人G6化se-a的 rAAV8载体）。图11中的结果表明，4周龄和12周龄的rAAV8-GPE-c〇-hG6化Se处理的GSD-Ia小 鼠中肝G6Pas e活性为通过r AAV8-G阳-G6Pas e载体恢复的各活性的1.9倍。
[0267]所有处理的GSD-Ia小鼠表现出正常的胆固醇、甘油S醋、尿酸和乳酸的血清谱W 及正常的肝脂肪水平。在rAAV输注的小鼠中，肝重量与所恢复的肝G6化Se活性逆相关。与 r AAV-G阳-CO-G6化Se处理的小鼠相比，rAAV-G阳-G6Pase处理的小鼠表现出显著更严重的 肝肿大（图12)。
[0%引在功能上，12周龄时，rAAV8-G阳-CO-GSPase处理的GSD-Ia小鼠表现出正常的葡糖 耐量谱(图13A)并且在24小时禁食中保持血糖正常（图13B)。
[0269] 实施例7:使用基于AAV的基因疗法治疗人GSD-Ia
[0270] 本实施例描述了临床上使用编码的G6PC的AAV载体治疗GSD-Ia的示例性方法。
[0271] 选择诊断为患有GSD-Ia的患者进行治疗。通常，患者为至少18岁，并且可能或不可 能已经预暴露于免疫调节。向所述患者给予治疗有效量的表达G6PC的重组AAV载体，例如本 文公开的AAV-GPE-G6PC或AAV-GPE-CO-G6PC。重组AAV可W静脉内给予。可W由医生选择合 适的治疗剂量。在一些情况下，治疗有效剂量为1 X 1〇11至约1 X 1〇14病毒颗粒(vpVkg，例如 约1 X l〇i2vp/kg。在大部分情况下，向所述患者给予单剂量。在不存在免疫调节的情况下，所 述患者可能仅耐受单次rAAV输注。如果所述患者已经预暴露于免疫调节，可W给予两个或 更多个剂量。可W随时间监测受试者的健康W确定治疗的有效性。
[0272] 考虑到可W应用所公开的发明的原理的许多可能实施方案，应认识到所举例说明 的实施方案仅是本发明的优选实例，并且不应解释为限制本发明的范围。相反地，本发明范 围由所附权利要求限定。因此，本发明人要求保护运些权利要求的范围和精神内的所有发 明。
【主权项】
1. 一种重组核酸分子，其包含SEQ ID NO :3的核苷酸182-4441或SEQ ID NO :1的核苷酸 182-4441〇2. 根据权利要求1所述的重组核酸分子，其包含SEQ ID N0:3的核苷酸17-4819或SEQ ID NO: 1 的核苷酸17-4819。3. 根据权利要求1或权利要求2所述的重组核酸分子，其包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 1的核苷酸序列。4. 一种载体，其包含权利要求1至3中任一项所述的重组核酸分子。5. 根据权利要求4所述的载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。6. 根据权利要求5所述的载体，其中所述AAV载体是AAV血清型8 (AAV8)载体。7. -种分离的宿主细胞，其包含权利要求1至3中任一项所述的重组核酸分子，或者所 述权利要求4-6中任一项所述的载体。8. -种重组AAV(rAAV)，其包含权利要求1至3中任一项所述的重组核酸分子。9. 根据权利要求8所述的rAAV，其中所述rAAV是rAAV8。10. -种组合物，其包含在可药用载体中的权利要求8或权利要求9所述的rAAV。11. 根据权利要求10所述的组合物，其被配制用于静脉内给药。12. -种治疗被诊断为患有糖原贮积病的受试者的方法，包括选择患有Ia型糖原贮积 病(GSD-Ia)的受试者并且给予所述受试者治疗有效量的权利要求8或权利要求9所述的 r AAV，或者权利要求10或权利要求11所述的组合物。13. 根据权利要求12所述的方法，其中静脉内给予所述rAAV。14. 根据权利要求12或权利要求13所述的方法，其中以约I X IO11至约I X IO14病毒颗粒 (vp) /kg的剂量给予所述rAAV。15. 根据权利要求14所述的方法，其中以约I X IO12至约8 X 1013vp/kg的剂量给予所述 rAAV 〇16. 根据权利要求14所述的方法，其中以约IX 1013至约6X1013vp/kg的剂量给予所述 rAAV 〇17. 根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其中给予所述rAAV包括给予单次剂量 的rAAV〇18. 根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其中给予所述rAAV包括给予多次剂量 的rAAV〇
【文档编号】C12N15/86GK105934515SQ201480074046
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2014年11月25日
【发明人】J·J·周, B·J·伯恩
【申请人】美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表), 佛罗里达大学研究基金会有限公司