Cyp450受不可逆抑制的微粒体及其在代谢途径的酶表型分析中的用图

Cyp450受不可逆抑制的微粒体及其在代谢途径的酶表型分析中的用图
【专利摘要】制备包含受不可逆抑制的细胞色素P450(CYP450)的分离的微粒体的方法。分离的微粒体的特征在于其细胞色素P450受非可逆抑制剂的不可逆抑制。本发明的分离的微粒体在候选药物酶促反应表型分析方法中的用途。
【专利说明】CYP450受不可逆抑制的微粒体及其在代谢途径的酶表型分析 中的用途
[0001]本发明属于在新药的情况下，用于评价药物相互作用的产品和方法的研究和开发 领域。本发明涉及制备具体人细胞色素 P450 (CYP450)受不可逆抑制的分离的微粒体的方 法，该微粒体将用于定量该酶对活性成分代谢的贡献。
[0002 ]药物的有效性和毒性可因施用另一化合物(药物、环境污染物、食物)而改变。这些 是药物相互作用(DDI;药物-药物相互作用）。存在不同类型的相互作用机制，最重要的是代 谢性相互作用，其属于药物代谢动力学相互作用。
[0003] 代谢性药物相互作用尤其理解为这样的事实，药物A可以通过加速药物B的代谢 (激活或诱导）或通过减少药物B的代谢(抑制或阻遏），来改变共同施用的药物B的代谢。在 新药开发项目中，此代谢性药物相互作用使得有必要一方面鉴定参与活性成分代谢的酶， 另一方面鉴定该活性成分的潜在抑制剂或诱导剂。
[0004] 肝是代谢药物的主要部位。肝细胞包含关键代谢酶，包括细胞色素 P450 (CYP450)。 细胞色素 P450因此构成药物相互作用预测中的主要靶标。
[0005] 为了预测药物相互作用的风险，有必要鉴定和测定每种酶对活性成分代谢的贡 献;这就是酶促反应的表型分析。
[0006] 为了估计每种酶对活性成分代谢的贡献，可以利用对代谢途径进行表型分析的多 种方法。
[0007] -系列经表征的人肝微粒体的使用可以辅助鉴定参与活性成分代谢的酶。此方法 需要预先表征来自至少15个单批次获自人肝的微粒体的主要CYP450的酶活性。将15个批次 微粒体中的每一个与活性成分孵育，以确定其代谢速率和那些同一微粒体的每种细胞色素 P450的活性之间的相关性。但是，微粒体系列的使用不允许定量测定所涉及的酶，以致难以 进行相关。
[0008] 重组酶也用于估计每种细胞色素 P450对活性成分代谢的相对贡献。由于细胞色素 P450在重组系统中的表达水平不同，与天然人肝微粒体相比通常提高很多，有必要引入校 正因子，以外推与人微粒体相比重组微粒体中每种CYP450的贡献(校正因子=相对活性因 子）。此校正因子必须通过实验测量所测试的每种CYP450的酶活性来计算，首先，在天然人 微粒体的存在下测量，其次，在重组微粒体的存在下测量。此方法使得可能以选择性和半定 量的方式直接评价每种酶对活性成分代谢的相对贡献。但是，由于其固有特征，这些重组酶 与见于肝微粒体中的酶不同（截短的蛋白质序列、不同的膜环境、细胞色素 b5和P450之间的 不同偶联、多种CYP450之间的竞争的缺乏）。
[0009] 在活性成分与人肝微粒体共孵育后，用针对酶的生物抑制剂(如单克隆抗体）（对 比"无抗体的对照"）来定量估计活性成分的代谢。但是，所使用的相当数量的抗体显示缺乏 特异性和抑制力。最后，此技术不方便用于代谢途径的表型分析。
[0010] 如果抑制完全且对所研究的酶特异，则CYP450化学抑制剂使得可能借助活性成分 代谢的百分比抑制直接测定每种细胞色素 P450的贡献。抑制剂可以可逆地或非可逆地结合 酶。它们用于与活性成分和人肝微粒体共孵育或预孵育(与无抑制剂的对照条件相比)一一 活性成分氧化代谢途径的体内环境的代表性模型。
[0011] 与竞争型可逆抑制剂(最常见的类型)相关的抑制水平依赖于孵育条件，如孵育时 间和底物浓度。此外，常用于表型分析研究的许多CYP450抑制剂并非对单种CYP450特异(例 如，酮康唑、栎精……）。因此，可逆抑制剂不适合用于细胞色素 P450表型分析。
[0012] 为了纠正这些方法的缺点，使用非可逆或不可逆抑制剂，以获得代表体内条件的 稳健定量方法。在酶永不恢复其活性时称抑制是不可逆的；参考"自杀"抑制。细胞色素 P450 氧化非可逆抑制剂，形成不可逆地结合酶的中间代谢物。此过程称为MBI (代表基于机制的 抑制），因为起始化合物无抑制性，而是需要至少一个酶的催化循环，然后活化为共价结合 该酶的反应性代谢物。MBI抑制表征为所研究的细胞色素 P450的不可逆抑制，且不依赖于底 物浓度。这些抑制剂遵循具有以下常数的一级动力学:kinac；t对应于最大酶失活速率，K:对应 于最大失活速率一半时的抑制剂浓度。
[0013] 为了用不可逆抑制剂获得CYP450的完全抑制，必须组合若干条件：
[0014] 1)有必要使用足够浓度的非可逆抑制剂(取决于其K:);
[0015] 2)取决于其kinac；t，抑制剂与肝微粒体预孵育的时期必须足以产生足够的催化失活 循环；
[0016] 3)预孵育的时期不得产生自杀抑制剂的耗竭，使得其浓度变得太低而不能完全抑 制P450。
[0017] 如果CYP450的抑制完全且特异(没有其他P450受抑制），因此可能定量测定每种细 胞色素 P450在活性成分代谢中的参与。则所使用的实验安排如下：
[0018]
[0019]尽管有上述优势，但此实验安排的MBI的使用具有限制其益处的一定数量的限制：
[0020] --方面，所研究的活性成分的孵育条件依赖于非可逆抑制剂预孵育的最适条件 (微粒体蛋白质浓度、有机溶剂百分比）。实际上，为了精确测量活性成分代谢的百分比抑 制，必须在所谓初始条件下孵育活性成分(代谢速率作为时间和蛋白质浓度的函数的线性； 百分比溶剂不得超过某个水平）。为了在此线性实验安排中获得最大和特异的抑制，之前必 须在与活性成分孵育相容的蛋白质浓度或溶剂浓度的体外条件下孵育抑制剂本身。
[0021] -另一方面，预孵育时间改变微粒体CYP450的酶活性，微粒体CYP450具有约70至90 分钟的体外半衰期。例如，所观察到的CYP2D6酶活性的丧失，在预孵育时间为30分钟的情况 下为至多26%，在预孵育时间为40分钟的情况下为至多35%，在预孵育时间为60分钟的情 况下为46 %。因此，实验安排所施加的MBI预孵育和候选药物孵育的连续序列的持续时间由 此与微粒体CYP450的体外半衰期不相容。
[0022]-最后，用于一种CYP450的不可逆抑制剂通常也对一种或多种CYP450显示可逆抑 制（例如，CYP1A2的MBI抑制剂也是CYP2C19的竞争性抑制剂，CYP2B6的MBI抑制剂也是 CYP2A6和3A4的竞争性抑制剂）。因此，对于体外表型分析研究，以上线性实验安排不能令人 满意地消除能够竞争性作用于其他CYP450的剩余游离抑制剂部分。稀释预孵育物可以降低 游离抑制剂的浓度，产生更少的非特异性可逆抑制，但实际上这将以这样的方式降低微粒 体蛋白质的浓度，使得孵育期间活性成分的代谢将太弱而检测不到。
[0023] 因此，制备一方面可用于不可逆抑制剂，另一方面与用于活性成分的孵育条件相 容的孵育条件的这种困难，使得很少有可能使用该线性实验安排。
[0024] 此外，在线性实验安排的情况下，有必要加入两个系列的附加孵育(含和不含不可 逆抑制剂），用所测试的CYP450的特异性底物作为阳性对照，验证抑制剂的作用。这因此不 仅需要定量活性成分，还需定量全部特异性底物，待测试的许多CYP450的情况都是这样，这 使得实验显著更麻烦。
[0025] 鉴于参与活性成分代谢的酶促反应的表型分析方法的各种缺点，该酶促反应表型 分析的体外研究需要克服之前所述多种方法的不足。
[0026] 因此，本发明的目的是提出备选策略，该策略使得可能通过使用分离的受不可逆 抑制的微粒体，来克服实施参与活性成分代谢的酶促反应的表型分析研究中所固有的问 题。
[0027]本发明涉及制备具有受不可逆抑制的细胞色素 P450(CYP450)的分离的微粒体的 方法，其包括以下步骤：
[0028]-不可逆抑制细胞色素 P450;
[0029]-浓缩微粒体蛋白质。
[0030]非可逆抑制剂、不可逆抑制剂、MBI抑制剂、不可逆抑制或自杀抑制理解为指能够 共价结合酶的抑制剂;受这样抑制的酶不能恢复其初始功能活性。更具体而言，MBI(基于机 制的抑制)抑制剂不直接与酶形成不可逆的键，而是其反应性中间代谢物之一与酶形成共 价键。
[0031] 本发明的浓缩的目的是，一方面，从存在于制备物中的其他产物(尤其是保持游离 的过量不可逆抑制剂和溶剂)滤去微粒体蛋白质，另一方面，浓缩预孵育步骤稀释的微粒 体。
[0032] 本发明的微粒体蛋白质的浓缩可以通过过滤然后离心而获得。从具有10，000道尔 顿至40，000道尔顿、优选30，000道尔顿截留阈值的膜开始，获得浓缩步骤中的过滤功能。通 过能够进行浓缩的系统（例如用于3000g至4000g离心60至90分钟、优选80分钟的 系统）实现浓缩步骤中的浓缩功能。在丨亥步骤纟吉束时'，使Gen.trie.oii?反转， 并按800至1000g离心2至10分钟，优选5分钟。
[0033 ]为了改善微粒体蛋白质的分离和浓缩，可以在以下条件下进行附加的超速离心步 骤:80，000g 至 150，000g，约 60 分钟。
[0034] 可以通过重复上述序列(过滤，然后浓缩)至少两次来改善微粒体蛋白质的浓缩。
[0035] 本发明的微粒体蛋白质的浓缩步骤还可以通过连续超速离心来获得。有必要在以 下条件下进行至少两次连续超速离心:80，000g至150，000g，60至90分钟。
[0036] 本发明涉及制备分离的受不可逆抑制的微粒体的方法，其中加入一个或多个洗涤 步骤。这种制备分离的微粒体的方法包括放置在微粒体蛋白质浓缩步骤之前和/或之后的 洗涤步骤。例如，本发明的方法包括以下步骤：
[0037] -不可逆抑制细胞色素 P450;
[0038] -洗涤；
[0039]-浓缩微粒体蛋白质；
[0040 ]-洗涤微粒体蛋白质。
[0041]本发明的方法还可以包括以下步骤：
[0042]-不可逆抑制细胞色素 P450;
[0043]-浓缩微粒体蛋白质；
[0044] -洗涤微粒体蛋白质；
[0045] 或以下步骤：
[0046]-不可逆抑制细胞色素 P450;
[0047]-洗涤；
[0048]-浓缩微粒体蛋白质。
[0049] 洗涤理解为意指漂洗并去除非微粒体级分的步骤。洗涤步骤还可以包括将微粒体 浓缩物放入!^8!1(：1缓冲液?!17.4中。
[0050] 在本发明的制备分离的受不可逆抑制的微粒体的方法结束后，微粒体的浓度为 10mg/ml至30mg/ml，更具体而言，17mg/ml至25mg/ml，优选20mg/ml，微粒体蛋白质已浓缩5 至15倍。
[0051] 本发明的制备分离的失活微粒体的方法包括保存微粒体的最终步骤。微粒体保存 步骤优选包括冷冻保存步骤，其包括在存在或不存在冷冻保护液的情况下将分离和纯化的 微粒体冷却至非常低的温度(约-196Γ)，以暂停任何生物活性。此保存步骤的目的是方便 即时使用本发明的失活和分离的微粒体。分离的微粒体的这种使用可以发生在其制备后几 天至几个月。保存步骤决不改变微粒体的结构和功能特性。
[0052]优选地，该保存步骤是冷冻步骤。
[0053]受不可逆抑制和分离的微粒体的冷冻在_80°C进行。
[0054] 用于制备方法过程的微粒体是人、大鼠、小鼠、猪或猴肝微粒体。微粒体优选获自 包含全部P450酶的人肝。为了将个体间变异性考虑在内，微粒体来自几个供体，以形成微粒 体库。
[0055] 细胞色素 P450是由 18个亚家族（CYP1、CYP2、CYP3、CYP4、CYP5、CYP7、CYP8、CYP11、 CYP17、CYP19、CYP20、CYP21、CYP24、CYP26、CYP27、CYP39、CYP46、CYP51)组成的同工酶大家 族。本发明涉及制备分离的微粒体的方法，其中受不可逆抑制的细胞色素 P450选自细胞色 素家族 CYP1、CYP2、CYP3 和 CYP4。
[0056] 受不可逆抑制的细胞色素 P450选自 CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、 CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP2 J2、CYP3A4、CYP3A5 和 CYP4F2。
[0057] 受不可逆抑制的细胞色素 P450选自 CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、 CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1 和 CYP3A4。
[0058]在用于本发明的制备微粒体的方法的非可逆抑制剂中，可以以说明的方式且无任 何限制地提到：
[0059]
[0060] 本发明还涉及分离的微粒体本身，其包含受不可逆抑制的细胞色素 P450。
[0061] 本发明的分离的微粒体包含受不可逆抑制的细胞色素，其选自细胞色素家族 CYP1、CYP2、CYP3和CYP4。
[0062]本发明涉及分离的微粒体，其中选自以下的细胞色素受不可逆抑制：CYP1A1、 CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP2J2、CYP3A4、CYP3A5 和CYP4F2。
[0063]更尤其是，本发明涉及分离的微粒体，其中选自以下的细胞色素受不可逆抑制： CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1 和 CYP3A4。
[0064] 本发明的分离的受不可逆抑制的微粒体优选冷冻保存或冷冻保护。
[0065] 本发明还涉及处于用于在解冻后即时使用的冷冻形式的分离的受不可逆抑制的 微粒体。
[0066]分离的微粒体按照本专利申请中所述的制备方法获得。
[0067] 本发明涉及分离的受不可逆抑制的微粒体在参与待评价活性成分的代谢的酶促 反应的表型分析中的用途。
[0068] 本发明还涉及对参与活性成分代谢的酶促反应进行表型分析的方法。此表型分析 方法包括以下步骤：
[0069] -将按照本发明分离和受不可逆抑制的微粒体与待评价的活性成分孵育；
[0070] -测量参与活性成分代谢的受不可逆抑制的细胞色素 P450的贡献。
[0071] 在活性成分存在下进行孵育，一方面与本发明的分离的受不可逆抑制的肝微粒体 孵育，另一方面与按照本发明制备的未受抑制的分离的肝微粒体孵育(对照）。在最终孵育 时间点或以动力学方式(即在几个孵育时间点)监测孵育。
[0072] 在每个孵育时间点，定量活性成分和/或其代谢物。
[0073] 在抑制(活性Ai)和非抑制（具有活性A的对照)两种条件下，通过固有代谢清除率 (在动力学测量的情况下)或通过未改变的活性成分消失的速度或代谢物出现的速度(如果 选择了最终孵育时间点)来测量活性成分的代谢活性(A)。
[0074 ]活性成分代谢活性的百分比抑制计算如下：百分比抑制=(A-A i)/A。计算的百分 比抑制直接对应于参与活性成分代谢的受不可逆抑制的细胞色素 P450的贡献。
[0075] 最后，本发明涉及表型分析试剂盒，其包含：
[0076] -按照本发明分离和不可逆抑制的微粒体；
[0077]-对照微粒体。
[0078]对照微粒体理解为已在缺乏不可逆抑制剂的情况下进行了本发明的制备方法的 微粒体。
[0079] 优选地，表型分析试剂盒一方面包含不可逆抑制并冷冻保存的分离的微粒体，另 一方面包含也可以冷冻保存的对照微粒体。
[0080] 通过以下附图和实施例来说明本发明而不由此限制本发明：
[0081 ]图1:不可逆抑制的CYP1A2微粒体中细胞色素 P450活性的百分比抑制。
[0082] 针对各CYP450研究的具体活性对应于非那西丁-0-脱乙酰酶(CYP1A2,按4.5μΜ孵 育非那西丁 (phenacetin))、香豆素-7-羟化酶(CYP2A6,按2μΜ孵育香豆素）、安非布他酮-羟 化酶(2Β6,按50μΜ孵育安非布他酮(bupropion))、紫杉醇-6α-羟化酶(2C8,按4μΜ孵育紫杉 醇(paclitaxel))、双氯芬酸_4'_轻化酶(2C9,按4μΜ孵育双氯芬酸(diclofenac))、奥美拉 唑-5-羟化酶(2C19，按5μΜ孵育奥美拉唑(omeprazole))、右美沙芬-0-脱甲基酶(2D6，按5μΜ 孵育右美沙芬（dextromethorphan))、氯唑沙宗-6-羟化酶（2Ε1，按40μΜ孵育氯唑沙宗 (chlorzoxazone))和睾酮_6β_轻化酶、咪达唑仑-1 轻化酶和硝苯地平-还原酶(3Α4，孵育 睾酮30μΜ、咪达唑仑(midazolam)0.5μΜ、硝苯地平(nifedipine) 10μΜ)。通过用咲拉茶碱不 可逆抑制的微粒体上和对照微粒体上的Ρ450活性的比较来获得百分比抑制。
[0083] 图2: 5μΜ和10μΜ呋拉茶碱对人肝微粒体上和重组微粒体上CYP1A2的影响
[0084]图3:不可逆抑制的CYP3A4微粒体中细胞色素 Ρ450活性的百分比抑制。
[0085]针对各CYP450研究的具体活性对应于图1中所述的那些。通过用艾查苗林不可逆 抑制的微粒体上和对照微粒体上的Ρ450活性的比较来获得百分比抑制。
[0086] 图4:CYP3A4和CYP3A5(重组微粒体)对硝苯地平和咪达唑仑的代谢。
[0087] 图5:不可逆抑制的CYP3A4微粒体中Km和Vmax时咪达唑仑活性的百分比抑制。
[0088]图6:不可逆抑制的CYP2C8微粒体中细胞色素 P450活性的百分比抑制。
[0089] 针对各CYP450研究的具体活性对应于图1中所述的那些，并加入阿莫地喹羟化酶 (2C8，按0.5μM孵育阿莫地喹（amOdiaquine))。通过用吉非贝齐葡糖醛酸化物 (glucuronide)不可逆抑制的微粒体上和对照微粒体上的P450活性的比较来获得百分比抑 制。
[0090] 图7:在不可逆抑制的CYP2C8微粒体中按对应于2C8依赖性阿莫地喹羟化反应的Km 和Vmax的浓度孵育阿莫地喹的百分比活性抑制。
[0091] 图8:在不可逆抑制的CYP2C9微粒体中，按对应于2C9依赖性双氯芬酸-4'-羟化反 应的Km和Vmax的浓度孵育双氯芬酸的百分比活性抑制。
[0092]图9:不可逆抑制的CYP2C9微粒体中细胞色素 P450活性的百分比抑制。
[0093] 针对各CYP450研究的具体活性对应于图1中所述的那些。通过用氯噻苯氧酸不可 逆抑制的微粒体上和对照微粒体上的P450活性的比较来获得百分比抑制。
[0094]图10:不可逆抑制的CYP2D6微粒体中细胞色素 P450活性的百分比抑制。针对各 CYP450研究的具体活性对应于图1中所述的那些。通过用帕罗西汀不可逆抑制的微粒体上 和对照微粒体上的P450活性的比较来获得百分比抑制。
[0095]图11:不可逆抑制的CYP2B6微粒体中细胞色素 P450活性的百分比抑制。
[0096] 针对各CYP450研究的具体活性对应于非那西丁-0-脱乙酰酶(CYP1A2,按200μΜ孵 育非那西丁）、香豆素-7-羟化酶(CYP2A6,按20μΜ孵育香豆素）、安非布他酮-羟化酶(2Β6,按 100μΜ孵育安非布他酮）、阿莫地喹-脱乙基酶(2C8,按20μΜ孵育阿莫地喹）、双氯芬酸-4'-羟 化酶(2C9,按200μΜ孵育双氯芬酸）、S-美芬妥英-羟化酶(2C19,按60μΜ孵育S-美芬妥英(S- mephenytoin))、右美沙芬-0-脱甲基酶(2D6，按100μΜ孵育右美沙芬）、氯唑沙宗-6-羟化酶 (2Ε1，按200μΜ孵育氯唑沙宗)和睾酮-6β-羟化酶、咪达唑仑-Γ -羟化酶和硝苯地平-还原酶 (3Α4,孵育睾酮75μΜ、咪达唑仑50μΜ、硝苯地平50μΜ)的活性。
[0097]通过用硫替哌不可逆抑制的微粒体上和对照微粒体上的Ρ450活性的比较来获得 百分比抑制。
[0098]图12:CYP1A2活性的百分比抑制作为-80°C下不同保存时间的函数。
[0099] 图13 :米氮平(mirtazapine)在分离的不可逆抑制的微粒体CYP1A2(A)、3A4(B)、 2D6(C)及其对照存在下消失的动力学(n = 3)。
[0100] 图14:与其同源对照相比，在分离的不可逆抑制的微粒体的试剂盒存在下，米氮平 的固有清除率的百分比抑制。
[0101 ] 图15:洛哌丁胺（loperamide)分别在分离的不可逆抑制的微粒体3A4(A)和2C8(B) 及其同源对照存在下消失的动力学(n = 3)。
[0102]图16:与其同源对照相比，在分离的不可逆抑制的微粒体的试剂盒存在下，洛哌丁 胺的固有清除率的百分比抑制。
[01 03 ]图17:安非布他酮(bupr op i on)在分离的不可逆抑制的微粒体2B6及其同源对照存 在下消失的动力学(n = 3)。
[0104]图18:与其同源对照相比，在分离的不可逆抑制的微粒体的试剂盒存在下，安非布 他酮的固有清除率的百分比抑制。
[0105]图19:布洛芬（ibuprofen)在分离的不可逆抑制的微粒体2C9及其同源对照存在下 消失的动力学(n = 3)。
[0106]图20:与其同源对照相比，在分离的不可逆抑制的微粒体的试剂盒存在下，布洛芬 的固有清除率的百分比抑制。
[0107] 图21:Cel〇C〇Xib在分离的不可逆抑制的微粒体2C9及其同源对照存在下消失的动 力学(n = 3)。
[0108] 图22:与其同源对照相比，在分离的不可逆抑制的微粒体的试剂盒存在下， celocoxib的固有清除率的百分比抑制。
[0109]图23:吡格列酮(pioglitazone)在分离的不可逆抑制的微粒体2C8及其同源对照 存在下消失的动力学(n = 3)。
[0110]图24:与其同源对照相比，在分离的不可逆抑制的微粒体的试剂盒存在下，吡格列 酮的固有清除率的百分比抑制。
[0111 ]图25:波替单抗(bortezomib)在分离的不可逆抑制的微粒体3A4及其同源对照存 在下消失的动力学(n = 3)。
[0112]图26:与其同源对照相比，在分离的不可逆抑制的微粒体的试剂盒存在下，波替单 抗的固有清除率的百分比抑制。
[0113]图27:瑞格列奈(repaglinide)在分离的不可逆抑制的微粒体2C8及其同源对照存 在下消失的动力学(n = 3)。
[0114]图28:与其同源对照相比，在分离的不可逆抑制的微粒体的试剂盒存在下，瑞格列 奈的固有清除率的百分比抑制。
[0115]图29:珊特拉林（sertraline)在分离的不可逆抑制的微粒体2B6及其同源对照存 在下消失的动力学(n = 3)。
[0116] 图30:与其同源对照相比，在分离的不可逆抑制的微粒体的试剂盒存在下，珊特拉 林的固有清除率的百分比抑制。
[0117] 实施例1:制备分离的受不可逆抑制的失活微粒体
[0118] 生物材料
[0119] 微粒体获自包含全部P450酶的人肝。它们来自微粒体库，因为它们获自几个供体， 以将个体间变异性考虑在内。
[0120] 微粒体的孵育
[0121] 对于受不可逆抑制的微粒体的每个制备批次，在相同条件下制备对照批次，差别 是用等体积溶剂取代不可逆抑制剂。
[0122] 将所研究的细胞色素 P450的非可逆抑制剂（或溶剂，对于对照批次）与微粒体在 Tris/HCl缓冲液pH 7.4和MgCl2中37°C搅拌孵育。通常预加热制备物5至10分钟，然后加入 NADPH以起始酶促反应。在时间点t，将反应混合物放置在冰中几分钟，然后进行浓缩步骤。 在微粒体与不可逆抑制剂孵育过程中形成通过共价键连接的酶\抑制剂复合物。以不可逆、 完全和特异的方式抑制所研究的细胞色素 P450。
[0123] 受不可逆抑制的失活微粒体的过滤和浓缩
[0124] 过滤从微粒体与所研究的细胞色素 P450的非可逆抑制剂的孵育获得的样品。此蛋 白质过滤步骤可以用具有10,000至40,000道尔顿截留阈值的膜进行。用(：611忱丨€〇1^系统 来进行此过滤步骤。
[0125] 有时有必要加入一个或多个洗涤步骤，以便于去除保持游离的不可逆抑制剂。将 样品3000g至4000g离心80分钟，然后800至1000g离心5分钟。可对样品进行一系列离心，以 优化微粒体蛋白质的浓度。
[0126] 根据需要，然后对浓缩的微粒体样品进行超速离心，以进一步提高蛋白质浓度。超 速离心在80，000g离心4小时以上至150，000g离心45分钟以上、优选100，000g离心1小时的 一系列条件下进行。
[0127] 蛋白质浓缩物采用Tris/HCl缓冲液pH 7.4，然后分装，并在_80°(：下冷冻。
[0128] 在此制备结束时，获得可即时用于参与活性成分代谢的酶促反应的表型分析的分 离的受不可逆抑制的失活微粒体。
[0129] 实施例2:抑制主要细胞色素 P450的条件及受不可逆抑制的微粒体在细胞色素 P450的特异性底物上的验证
[0130] CYP1A2
[0131 ]呋拉茶碱是细胞色素 CYP1A2的MBI抑制剂之一。
[0132]用于呋拉茶碱对CYP1A2的最大MBI抑制的实验条件如下：
[0133] -2mg/ml的微粒体蛋白质；
[0134] -ΙΟμΜ的呋拉茶碱；
[0135] -30分钟的预孵育时间。
[0136] 4.5μΜ(小于或等于其Km的浓度）的CYP1A2特异性底物非那西丁与之前在以上条件 下抑制的微粒体孵育后，非那西丁脱乙酰酶活性（依赖CYP1A1/CYP1A2)的百分比抑制为 83% (图1)。应指出，剩余的17%代谢是由于与CYP1A1相关的残留非那西丁脱乙酰酶活性， 而不是由于缺乏CYP1A2的抑制。实际上，已知在非饱和条件（<5μΜ)下孵育的非那西丁大部 分由CYP1A2代谢，部分由CYP1A1代谢。
[0137] 5μΜ至ΙΟμΜ呋拉茶碱与人重组CYP1A2预孵育30分钟产生非那西丁的纯CYP1A2活性 的约100%抑制，由此证明其在所选择的条件下的最大抑制力（图2)。
[0138] 在以上条件下制备的受不可逆抑制的微粒体和对照批次存在下，按比非那西丁对 CYP1A2的Km高非常多的浓度孵育非那西丁时，非那西丁脱乙酰酶活性（依赖CYP1A1/ CYP1A2)的百分比抑制仍为约80%。此结果证明呋拉茶碱对CYP1A2的抑制不受过量底物的 影响，且检测不到竞争型抑制。
[0139] 在上文定义的受呋拉茶碱不可逆抑制的人肝批次和对照批次存在下孵育其他主 要CYP450 (CYP2A6、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、2E1和3A4)的特异性底物，以证明呋拉茶碱的特 异性。观察到其他主要CYP450的活性保持不变。
[0140]这些结果整体显示，按照本发明分离并就CYP1A2进行不可逆和特异性抑制的微粒 体可以有价值地用于测量CYP1A2对活性成分或候选药物代谢的贡献。
[0141] CYP3A4
[0142] 艾查苗林是细胞色素 CYP3A4的MBI抑制剂之一。
[0143] 用于CYP3A4存在下艾查苗林的最大MBI抑制的实验条件如下：
[0144] -2mg/ml的微粒体蛋白质；
[0145] _5μΜ的艾查苗林；
[0146] -15分钟的预孵育时间。
[0147] 在上文详述条件下制备的受不可逆抑制的微粒体和对照批次存在下，孵育CYP3A4 特异性底物咪达唑仑〇 . 5μΜ、睾酮30μΜ和硝苯地平ΙΟμΜ(小于或等于底物的Km)后，咪达唑 仑-Γ-羟化酶、睾酮-6β-羟化酶和硝苯地平-还原酶(依赖CYP3A4/CYP3A5)活性的百分比抑 制分别为81 %、96 %和83 % (图3)。应指出，剩余的19 %、4 %和17 %代谢是由于CYP3A5活性， 而不是由于缺乏CYP3A4的抑制。实际上，已知三种特异性底物(且更尤其是硝苯地平和咪达 唑仑）主要由CYP3A4但也由CYP3A5代谢。图4尤其显示重组微粒体(bactosome)CYP3A4和 CYP3A5对硝苯地平的代谢。5μΜ艾查苗林与人重组CYP3A4预孵育15分钟产生咪达唑仑的纯 CYP3A4活性的约92 %抑制，证明其在所选条件下的最大抑制力。在将CYP3A4的特异性底物 (用咪达唑仑为例）按比其对CYP3A4的Km高非常多的浓度与之前按照本发明制备的微粒体 孵育时，CYP3A4依赖性活性的百分比抑制保持不变(图5)。此结果证明艾查苗林对CYP3A4的 抑制不受过量底物影响，且检测不到竞争型抑制。
[0148] 在上文定义的受艾查苗林不可逆抑制的人肝微粒体批次和对照批次存在下，孵育 其他主要 CYP450 (CYP1A2、CYP2A6、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6 和 2E1)的特异性底物，以证明艾 查苗林的特异性。图3显示，其他主要CYP450的活性在受不可逆抑制的人微粒体批次和对照 批次之间保持不变，证明艾查苗林确实对CYP3A4活性特异。
[0149] 这些结果整体显示，按照本发明分离并就CYP3A4进行不可逆和特异性抑制的微粒 体可以有价值地用于测量CYP3A4对活性成分或候选药物代谢的贡献。
[0150] CYP2C8
[0151] 吉非贝齐葡糖醛酸化物是细胞色素 CYP2C8的MBI抑制剂之一。用于CYP2C8存在下 吉非贝齐葡糖醛酸化物的最大MBI抑制的实验条件如下：
[0152] -2mg/ml的微粒体蛋白质；
[0153] -30μΜ的吉非贝齐葡糖醛酸化物；
[0154] -30分钟的预孵育时间。
[0155] 在按照本发明制备的受不可逆抑制的微粒体和对照批次存在下，孵育CYP2C8特异 性底物阿莫地喹〇.5μΜ或紫杉醇4μΜ(小于或等于CYP2C8的两种底物的Km的浓度)后，阿莫地 喹(CYP2C8)和紫杉醇-羟化酶(依赖CYP2C8)活性的百分比抑制分别为88 %和100 % (图6)。
[0156] 在与上述条件相同的条件下按比其对CYP2C8的Km高非常多的浓度孵育阿莫地喹 时，阿莫地喹羟化酶活性的百分比抑制保持不变（图7)。此结果证明阿莫地喹对CYP2C8的抑 制不受过量底物影响，且检测不到竞争型抑制。
[0157] 在上文定义的条件下孵育其他主要CYP450的特异性底物，以证明吉非贝齐葡糖醛 酸化物的特异性。图6显示，除CYP2C19的轻微抑制外，其他主要CYP450的活性在受不可逆抑 制的人微粒体批次和对照批次之间保持不变，证明吉非贝齐葡糖醛酸化物确实对CYP2C8活 性特异。
[0158] 这些结果整体显示，按照本发明分离并就CYP2C8进行不可逆抑制的微粒体可以有 价值地用于测量CYP2C8对活性成分或候选药物代谢的贡献。
[0159] CYP2C9
[0160] 氯噻苯氧酸是细胞色素 CYP2C9的MBI抑制剂之一。
[0161 ]用于CYP2C9存在下氯噻苯氧酸的最大MBI抑制的实验条件如下：
[0162] -2mg/ml的微粒体蛋白质；
[0163] -ΙΟμΜ的氯噻苯氧酸；
[0164] -20分钟的预孵育时间。
[0165] 在按照本发明制备的受不可逆抑制的微粒体和对照批次存在下，按4μΜ(小于或等 于底物对CYP2C9的Km的浓度)和100μΜ(比其对CYP2C9的Km高非常多的浓度)孵育CYP2C9特 异性底物双氯芬酸后，双氯芬酸羟化酶(依赖CYP2C9)活性的抑制几乎是完全的，或分别为 92%和88%抑制（图8)。此结果不仅证明CYP2C9抑制完全，还证明它不受过量底物影响，且 检测不到竞争型抑制。
[0166] 在上文定义的条件下孵育其他主要CYP450的特异性底物，以证明氯噻苯氧酸的特 异性。图9显示，其他主要CYP450的活性在受不可逆抑制的微粒体批次和对照批次之间保持 不变，证明氯噻苯氧酸确实对CYP2C9活性特异。
[0167] 这些结果整体显示，按照本发明分离并就CYP2C9进行不可逆抑制的微粒体可以有 价值地用于测量CYP2C9对活性成分或候选药物代谢的贡献。
[0168] CYP2D6
[0169] 帕罗西汀是细胞色素 CYP2D6的MBI抑制剂之一。
[0170] 用于CYP2D6存在下帕罗西汀的最大MBI抑制的实验条件如下：
[0171] -2mg/ml的微粒体蛋白质；
[0172] -50μΜ的帕罗西汀；
[0173] -30分钟的预孵育时间。
[0174] 在按照本发明制备的受不可逆抑制的微粒体和对照批次存在下，按5μΜ(小于或等 于底物的Km的浓度)和50μΜ(比其对CYP2D6的Km高非常多的浓度)孵育CYP2D6特异性底物右 美沙芬后，右美沙芬-0-脱甲基酶（依赖CYP2D6)活性的抑制几乎是完全的，或为96%抑制 (图10)。此结果证明CYP2D6抑制完全，它不受过量底物影响，且检测不到竞争型抑制。
[0175] 在上文定义的条件下孵育其他主要CYP450的特异性底物，以证明帕罗西汀的特异 性。图10显示，除CYP2D6外，在所有其他CYP450活性中，只有CYP2B6的安非布他酮羟化酶依 赖性活性被抑制91 %，证明帕罗西汀并非对CYP2D6活性完全特异。
[0176] 这些结果整体显示，按照本发明制备的微粒体使得可能完全和几乎特异地抑制 CYP2D6活性。它们因此可用于测量CYP2D6/CYP2B6对新候选药物代谢的贡献。
[0177] CYP2B6
[0178] 硫替哌是细胞色素 CYP2B6的MBI抑制剂之一。
[0179] 用于CYP2B6存在下硫替哌的最大MBI抑制的实验条件如下：
[0180] -2mg/ml的微粒体蛋白质；
[0181] -15μΜ的硫替哌；
[0182] -30分钟的预孵育时间。
[0183] 在按照本发明制备的受不可逆抑制的微粒体和对照批次存在下，按100μΜ孵育 CYP2B6特异性底物安非布他酮后，安非布他酮羟化酶(依赖CYP2B6)活性的抑制几乎是完全 的，或为92%抑制（图11)。此结果证明CYP2B6抑制完全，它不受过量底物影响，且检测不到 克争型抑制。
[0184]在上文定义的条件下孵育其他主要CYP450的特异性底物，以证明硫替哌的特异 性。图11显示，除CYP2B6外，在所有其他CYP450活性中，只有CYP2A6的香豆素羟化酶依赖性 活性被抑制64%，证明硫替哌并非对CYP2B6活性完全特异。
[0185]这些结果整体显示，按照本发明制备的微粒体使得可能完全和几乎特异地抑制 CYP2B6活性。它们因此可用于测量CYP2B6/CYP2A6对新候选药物代谢的贡献。
[0186] 实施例3:分离、不可逆抑制并冷冻保存的微粒体中细胞色素 P450抑制的稳定性
[0187] 将按照本发明浓缩并保存在-80°C的就CYP1A2进行不可逆抑制的分离的人肝微粒 体按lmg/mL与CYP1A2特异性底物非那西丁 (4.5μΜ)孵育15分钟。测量按照本发明获得并在- 80°C保存48小时、1个月和1.5个月的微粒体的抑制百分比（图12)。观察到，浓缩和冷冻/融 化的步骤不影响呋拉茶碱对CYP1A2的MB I抑制。
[0188] 冷冻和融化的步骤不影响细胞色素 P450的不可逆抑制的稳定性。
[0189] 实施例4:用于生物异源物质代谢途径酶促表型分析的受不可逆抑制的分离的微 粒体的试剂盒
[0190] 在本发明的用于对9种生物异源物质的代谢途径进行酶促表型分析的受不可逆抑 制的分离的微粒体的试剂盒中测试了 9种活性成分(米氮平、洛哌丁胺、安非布他酮、布洛 芬、celocoxib、吡格列酮、波替单抗、瑞格列奈、珊特拉林）。按照本发明的包括以下步骤的 酶促反应表型分析方法测试了 9种活性成分：
[0191] -将按照本发明分离和不可逆抑制的微粒体与待评价的活性成分孵育；
[0192] -测量参与活性成分代谢的受不可逆抑制的细胞色素 P450的贡献。
[0193] 一方面在CYP450 1A2、2B6、2C8、2C9、2D6和3A4受不可逆抑制的分离的肝微粒体存 在下，另一方面在按照本发明制备的分离的非抑制肝微粒体(同源对照)存在下，按ο.?μΜ在 加入MgCl2 5mM的Tris/HCl缓冲液（0.1mM、pH 7.4)中37°C孵育每种活性成分。通过加入 NADPH ImM起始反应。以动力学形式监测孵育。在7分钟、17分钟、30分钟和然后60分钟的孵 育时间点，米集孵育的整分试样（1 ο ο μ L )，通过向该整分试样加入1体积冰中放置10分钟的 溶剂(100yL甲醇)来终止酶促反应。
[0194] 在每个孵育时间点，通过偶联质谱分析法(MS)的高效液相色谱(HPLC)来定量活性 成分。
[0195] 通过未改变的活性成分在抑制(活性Ai)和非抑制(具有活性A的对照)两种条件下 的固有代谢清除率来测量活性成分的代谢活性(A)。
[0196] 计算的百分比抑制（百分比抑制= (A_Ai)/A)直接对应于参与活性成分代谢的受 不可逆抑制的细胞色素 P450的贡献。
[0197] 米氮平
[0198] 将米氮平在之前所述条件下与浓度为2mg/ml的微粒体蛋白质孵育(允许其固有清 除率的最佳测量）。在对照微粒体(非抑制，按照本发明制备)存在下，测量到3.9至7.8ml/分 钟/g蛋白质的固有清除率。与对照微粒体相比，在CYP450 1A2、2D6和3A4受不可逆抑制的分 离的肝微粒体存在下，发现米氮平的固有清除率的抑制分别为41%、36%和24% (图13和 14)。在CYP450 2B6、2C8、2C9受不可逆抑制的分离的肝微粒体存在下未观察到米氮平固有 清除率的显著抑制。显著抑制理解为小于25%的固有清除率，该百分比代表在肝微粒体上 的清除率测量中观察到的变异性的阈值。因此，米氮平的氧化性代谢分别按41%、36%和 24% 的水平参与 CYP450 1A2、2D6 和 3A4。
[0199] 在过量表达主要的人CYP450的重组微粒体存在下，按2.5至1000μΜ孵育米氮平之 后，及在测量了适于那些CYP450中的每一个的校正因子之后，St&rmer等(Metabolism of the antidepressant mirtazapine in vitro:contribution of cytochromes P-4501A2， 2D6and 3A4.Drug Metab Dispos.2000;28(10) :1168-1175)显示，CYP4501A2、2D6和3A4在 米氮平的代谢中分别显示41%、39%和23%参与。Stormer等所获得的结果证实用按照本 发明分离和不可逆抑制的微粒体的试剂盒获得的结果(表1)。
[0200] 本发明的试剂盒允许通过CYP450受不可逆抑制的分离的肝微粒体和对照微粒体 存在下的固有清除率的简单比较，来推断CYP450在米氮平的氧化性代谢中的参与。
[0201] 相反，过量表达人CYP450的重组微粒体在米氮平酶促途径表型分析中的用途需要 间接测量，其需要一方面在米氮平存在下和另一方面在特异性底物存在下，首先表征过量 表达人CYP450的重组微粒体和其次表征人肝微粒体的每种CYP450活性，以测量校正因子。
[0203] *来自Stdrmer等(2〇〇〇)，在人重组酶模型中
[0204] 表1:从本发明的分离和不可逆抑制的微粒体的试剂盒开始及用人重组酶（ Stormer等），获得的CYP450在米氮平氧化性代谢中的百分比参与。
[0205] 洛哌丁胺
[0206] 将洛哌丁胺在之前所述条件下与浓度为2mg/ml的微粒体蛋白质孵育（允许其固有 清除率的最佳测量）。在对照微粒体（非抑制，按照本发明制备）存在下，测量到14.5至 17.2ml/分钟/g蛋白质的固有清除率。与对照微粒体相比，在CYP4503A4和2C8受不可逆抑制 的分离的肝微粒体存在下，发现洛哌丁胺的固有清除率的抑制分别为53%和40% (图15和 16)。在0￥?450^2、286、209、206受不可逆抑制的分离的肝微粒体存在下，未观察到洛哌丁 胺固有清除率的显著抑制。显著抑制理解为小于25%的固有清除率，该百分比代表在肝微 粒体上的清除率测量中观察到的变异性的阈值。因此，洛哌丁胺的氧化性代谢分别按53% 和40 %的水平参与CYP4503A4和2C8。
[0207] 健康志愿者研究显示，口服施用600mg CYP2C8抑制剂吉非贝齐使按4mg口服共同 施用的洛哌丁胺的暴露量（AUC)提高2 · 2倍（Niemi等Itraconazole，gemfibrozil and their combination markedly raise the plasma concentrations of loperamide.Eur J Clin Pharmacol. 2006;62:463-472)。此暴露量的提高对应于CYP2C8在总洛哌丁胺清除 率中5 5 %的估计参与。在同一体内研究中，与1 0 0mg CYP 3 A4抑制剂伊曲康唑 (itraconazole)共同施用4mg洛哌丁胺显示暴露量提高3.8倍，对应于约74 %的总洛哌丁胺 清除率。
[0208] 此外，Tayrouz 等（Ritonavir increases loperamide plasma concentrations without evidence for P-glycoprotein involvement.Clin Pharmacol Ther.2001Nov； 70(5) :405-14)显示，在健康志愿者中，与600mg CYP3A4抑制剂利托那韦(ritonavir)共同 施用16mg洛哌丁胺导致暴露量提高2.65倍，对应于62%的总洛哌丁胺清除率。
[0209] Niemi等和Tayrouz等在临床情境中描述的数据证实用按照本发明分离和不可逆 抑制的微粒体的试剂盒获得的结果(表2)。
[0210]
[0211 ] 1来自Niemi等(2006)，健康志愿者中的体内研究中
[0212] 2来自Tayrouz等(2001)，健康志愿者中的体内研究中
[0213] 表2:从本发明的分离和不可逆抑制的微粒体的试剂盒开始及在健康志愿者中 (Niemi等;Tayrouz等），获得的CYP450在洛哌丁胺氧化性代谢中的参与百分比。
[0214] 安非布他酮
[0215] 将安非布他酮在之前所述条件下与浓度为2mg/ml的微粒体蛋白质孵育(允许其固 有清除率的最佳测量）。在对照微粒体（非抑制，按照本发明制备）存在下，测量到6.7至 10.6ml/分钟/g蛋白质的固有清除率。与对照微粒体相比，在CYP450 2B6受不可逆抑制的分 离的肝微粒体存在下，发现安非布他酮的固有清除率的抑制为89% (图17和18)。还观察到 在CYP2D6受不可逆抑制的分离的肝微粒体存在下安非布他酮的固有清除率的抑制为84%。 已知CYP2D6的MBI抑制剂帕罗西汀不是特异性的，还抑制CYP2B6,推断CYP2D6抑制实际上对 应于CYP2B6的抑制。
[0216] 在CYP450 1A2、2C8、2C9和3A4受不可逆抑制的分离的肝微粒体存在下未观察到安 非布他酮固有清除率的显著抑制。显著抑制理解为小于25%的固有清除率，该百分比代表 在肝微粒体上的清除率测量中观察到的变异性的阈值。因此，安非布他酮的氧化性代谢按 89%的水平参与CYP4502B6。
[0217] Π)Α建议将安非布他酮作为人类体内相互作用研究中最敏感的CYP2B6底物(Π)Α关 于药物开发和药物相互作用的网站http://www.fda.gov/Drugs/ GuidanceComplianceRegulatorylnformation/G uidances/default·htm和http ://www.fda.gov/Drugs/DevelopmentApproval Process/DevelopmentResources/ DrugInteractionsLabelin 1277g/ucm080499.htm)〇
[0218] FDA所描述的数据证实用按照本发明分离和不可逆抑制的微粒体的试剂盒获得的 结果。
[0220] *来自FDA(敏感底物CYP2B6)
[0221] 表3:从本发明的分离和不可逆抑制的微粒体的试剂盒开始获得的CYP450在安非 布他酮氧化性代谢中的参与百分比。
[0222] 布洛芬
[0223] 将布洛芬在之前所述条件下与浓度为0.25mg/ml的微粒体蛋白质孵育（允许其固 有清除率的最佳测量）。在对照微粒体(非抑制，按照本发明制备)存在下，测量到31至54ml/ 分钟/g蛋白质的固有清除率。与对照微粒体相比，在CYP450 2C9受不可逆抑制的分离的肝 微粒体存在下，发现布洛芬的固有清除率的抑制为90% (图19和20)。
[0224] 在CYP450 1A2、2B6、2D6、2C8和3A4受不可逆抑制的分离的肝微粒体存在下未观察 到布洛芬固有清除率的显著抑制。显著抑制理解为小于25%的固有清除率，该百分比代表 在肝微粒体上的清除率测量中观察到的变异性的阈值。因此，洛哌丁胺的氧化性代谢按 90%的水平参与CYP450 2C7。
[0225] 在过量表达主要的人CYP450的重组微粒体存在下孵育3μΜ布洛芬后，及在测量了 适合用于那些CYP450中的每一个的校正因子后，McGinnity等(Automated definition of the enzymology of drug oxidation by the major human drug metabolizing cytochrome P450s.Drug Metab Dispos.2000Nov;28(ll):1327-34)显示，CYP450 2C9按 90%的水平参与布洛芬的代谢。McGinnity等所述的数据证实用本发明的分离和不可逆抑 制的微粒体的试剂盒获得的结果(表4)。应指出的是，本发明的试剂盒通过本发明的微粒体 和对照微粒体的固有清除率的简单比较确定了CYP450在布洛芬氧化性代谢中的参与。相 反，重组微粒体的使用使得有必要间接测量，这需要多重流程。
[0226] 最后，健康志愿者中的研究显示，口服施用400mg氟康唑（fluconazole)使按400mg 口服共同施用的布洛芬的暴露量（AUC)提高83%(Hynninen等Effects of the Antifungals Voriconazole and Fluconazole on the Pharmacokinetics of S-(+)_and R-(-)-Ibuprofen.Antimicrob Agents Chemother.Jun 2006;50(6):1967-1972)eLazar等 (Drug interactions with fluconazole . Rev Infect Dis.1990Mar-Apr；12Suppl 3: S327-33)显示，CYP2C9抑制剂氟康唑产生公认为对CYP2C9敏感的底物甲苯磺丁脲 (tolbutamide)的暴露量的 109%提高（fm = 80%，Brown等Prediction of in vivo drug- drug interactions from in vitro data: impact of incorporating parallel pathways of drug elimination and inhibitor absorption rate constant.Br J Clin Pharmacol. 2005Nov;60(5): 508-18)。由于在人类中共同施用相同的抑制剂后布洛芬和甲 苯磺丁脲暴露量的增加非常相似，可能可以得出结论，CYP2C9对这两种分子的代谢的贡献 非常相似。用本发明的试剂盒获得的结果得到确认(表4)，并证明了此体外模型与临床情境 相比的优良代表性。
[0228] 1来自McGinnity等(2000)，在重组人酶模型中
[0229] 2来自 Hynninen等（2006)
[0230] 3来自 Lazar JD等（1990)
[0231] 4来自 H.S. Brown 等（2005)
[0232] 表4:从分离和不可逆抑制的微粒体的试剂盒开始、在重组人酶存在下(McGinnity 等)及在健康个体的体内情境中（Hynninen等、Lazar等和Brown等），获得的CYP450在布洛芬 氧化性代谢中的百分比参与。
[0233] Celocoxib
[0234] 将Celocoxib在之前所述条件下与浓度为2mg/ml的微粒体蛋白质孵育（允许其固 有清除率的最佳测量）。在对照微粒体（非抑制，按照本发明制备）存在下，测量到13.4至 18.9ml/分钟/g蛋白质的固有清除率。与对照微粒体相比，在CYP450 2C9受不可逆抑制的分 离的肝微粒体存在下，发现Celocoxib的固有清除率的抑制为81 % (图21和22)。在CYP450 1八2、286、206、208和344受不可逆抑制的分离的肝微粒体存在下未观察到061〇〇(?113固有清 除率的显著抑制。显著抑制理解为小于25%的固有清除率，该百分比代表在肝微粒体上的 清除率测量中观察到的变异性的阈值。因此，Celocoxib的氧化性代谢按81 %的水平参与 CYP450 2C9〇
[0235] 健康志愿者研究显示，按200mg反复口服施用氟康唑，使按200mg口服共同施用的 celocoxib的暴露量(AUC)提高 134% (NDA020998 1998-12-31Pharmacia)。
[0236] 由于在人类中共同施用氟康唑后，celocoxib暴露量和上述甲苯磺丁脲(Lazar等） 暴露量的增加非常相似，可能可以得出结论，CYP2C9对这两种活性成分的代谢的贡献非常 相似。Brown等针对甲苯磺丁脲显示CYP2C9的80%参与。用按照本发明不可逆抑制的分离的 微粒体的试剂盒获得的结果证明了此体外模型与临床情境相比的良好代表性(表5)。
[0238] 1来自 NDA020998 1998-12-31 (Pharmacia)
[0239] 2来自 Lazar JD等（1990)
[0240] 3来自 H.S. Brown等（2005)
[0241] 表5:从本发明的受不可逆抑制的分离的微粒体的试剂盒开始及在健康个体的体 内情境中（NDA020998、Lazar等和Brown等），获得的CYP450在celocoxib氧化性代谢中的百 分比参与。
[0242] 吡格列酮
[0243] 将吡格列酮在之前所述条件下与浓度为0.2mg/ml的微粒体蛋白质孵育(允许其固 有清除率的最佳测量）。在对照微粒体(非抑制，按照本发明制备)存在下，测量到43至70ml/ 分钟/g蛋白质的固有清除率。与对照微粒体相比，在CYP450 2C8受不可逆抑制的分离的肝 微粒体存在下，发现吡格列酮的固有清除率的抑制为69% (图23和24)。
[0244] 在CYP450 1A2、2B6、2D6、2C9和3A4受不可逆抑制的分离的肝微粒体存在下，未观 察到吡格列酮固有清除率的显著抑制。显著抑制理解为小于25%的固有清除率，该百分比 代表在肝微粒体上的清除率测量中观察到的变异性的阈值。因此，吡格列酮的氧化性代谢 按69%的水平参与CYP450 2C8。
[0245]健康志愿者研究显示，按600mg反复口服施用CYP2C8抑制剂吉非贝齐使按3mg 口服 共同施用的吡格列酮的暴露量(AUC)提高239% (Deng等Effect of gemfibrozil on the pharmacokinetics of pioglitazone.Eur J Clin Pharmacol ,2005,61,831-6) 〇此暴露量 的提高对应于CYP2C8的参与估计为吡格列酮总清除率的71 %。因此用本发明的试剂盒获得 的结果支持Deng等在临床情境中描述的数据(表6)。
[0247] 1来自Deng LJ等，2005,体内研究
[0248] 表6:从本发明的受不可逆抑制的分离的微粒体的试剂盒开始及在体内情境中 (Deng等），获得的CYP450在吡格列酮氧化性代谢中的百分比参与。
[0249]波替单抗
[0250] 将波替单抗在之前所述条件下与浓度为1.5mg/ml的微粒体蛋白质孵育(允许其固 有清除率的最佳测量）。在对照微粒体（非抑制，按照本发明制备）存在下，测量到6.9至 1 lml/分钟/g蛋白质的固有清除率。与对照微粒体相比，在CYP450 3A4受不可逆抑制的分离 的肝微粒体存在下，发现波替单抗的固有清除率的抑制为73 % (图25和26)。
[0251] 在CYP450 1A2、2B6、2D6、2C8和2C9受不可逆抑制的分离的肝微粒体存在下未观察 到波替单抗固有清除率的显著抑制。显著抑制理解为小于25%的固有清除率，该百分比代 表在肝微粒体上的清除率测量中观察到的变异性的阈值。因此，波替单抗的氧化性代谢按 73%的水平参与CYP450 3A4。
[0252] Uttams ingh 等（Re lat i ve contributions of the five major human cytochromes p450,1A2,2C9,2C19,2D6,and 3A4,to the hepatic metabolism of the proteasome inhibitor bortezomib.Drug Metab Dipos2005,33(11) :1723-1728)显不，抗 CYP 3A4单克隆抗体抑制人肝微粒体对波替单抗(2μΜ)的代谢的79%。因此用本发明中所述 的试剂盒获得的结果支持Uttams ingh等所述的数据(表7)。
[0254] 1来自Uttamsingh等(2005)，在人肝微粒体中（使用单克隆抗体）
[0255] 表7:从本发明的受不可逆抑制的分离的微粒体的试剂盒开始及从通过特异性单 克隆抗体抑制的人肝微粒体开始(Uttamsingh等），获得的CYP450在波替单抗氧化性代谢中 的百分比参与。
[0256] 瑞格列奈
[0257] 将瑞格列奈在之前所述条件下与浓度为2mg/ml的微粒体蛋白质孵育（允许其固有 清除率的最佳测量）。在对照微粒体（非抑制，按照本发明制备）存在下，测量到38.4至 48.9ml/分钟/g蛋白质的固有清除率。与对照微粒体相比，在CYP450 2C8受不可逆抑制的分 离的肝微粒体存在下，发现瑞格列奈的固有清除率的抑制为80 % (图27和28)。在CYP450 1A2、2B6、2D6、2C9和3A4受不可逆抑制的分离的肝微粒体存在下未观察到瑞格列奈固有清 除率的显著抑制。显著抑制理解为小于25%的固有清除率，该百分比代表在肝微粒体上的 清除率测量中观察到的变异性的阈值。因此，瑞格列奈的氧化性代谢按80%的水平参与 CYP450 2C8〇
[0258] 健康志愿者研究显示，口服施用CYP2C8抑制剂吉非贝齐(至多900mg)，使按0.25mg 口服共同施用的瑞格列奈的暴露量（AUC)提高8.3倍（Honkalammi J.等Dose-Dependent Interaction between gemfibrozil and repaglinide in humans: strong inhibition of CYP2C8with subtherapeutic gemfibrozil doses .Drug Metab Dispos,2011,39, 1977-1986)。此暴露量的提高对应于CYP2C8的参与估计为瑞格列奈总清除率的88 %。 Honka 1 ammi J.等在临床情境中描述的数据证实用本发明的不可逆抑制的分离的微粒体的 试剂盒获得的结果(表8)。
[0260] 1来自Honkalammi J.等，2011
[0261] 表8:从本发明的受不可逆抑制的分离的微粒体的试剂盒开始及在健康个体P的体 内情境中(Honkalammi J.等），获得的CYP450在瑞格列奈氧化性代谢中的百分比参与。
[0262] 珊特拉林
[0263] 将珊特拉林在之前所述条件下与浓度为0.2mg/ml的微粒体蛋白质孵育(允许其固 有清除率的最佳测量）。在对照微粒体（非抑制，按照本发明制备）存在下，测量到52.5至 70.5ml/分钟/g蛋白质的固有清除率。与对照微粒体相比，在CYP450 2B6受不可逆抑制的分 离的肝微粒体存在下，发现珊特拉林的固有清除率的抑制为58% (图29和30)。还观察到在 CYP2D6受不可逆抑制的分离的肝微粒体存在下珊特拉林的固有清除率的抑制为64%。已知 CYP2D6的MBI抑制剂帕罗西汀不是特异性的，还抑制CYP2B6,推断CYP2D6抑制实际上对应于 CYP2B6的抑制。
[0264] 在CYP450 1A2、2C8、2C9和3A4受不可逆抑制的分离的肝微粒体存在下未观察到珊 特拉林固有清除率的显著抑制。显著抑制理解为小于25%的固有清除率，该百分比代表在 肝微粒体上的清除率测量中观察到的变异性的阈值。因此，珊特拉林的氧化性代谢按58% 的水平参与CYP4502B6。
[0265] 在人肝微粒体和CYP450的特异性抑制剂存在下孵育珊特拉林后，Obach S等 (Sertraline is metabolized by multiple cytochrome P450enzymes,monoamine oxidases,and glucuronyl transferases in human:an in vitro study.Drug Metab 018口〇8.2005?613;33(2):262-70)显示，在主要的0￥?450中，0￥?286对珊特拉林的代谢贡献 最多，其参与为15至65% (在人肝库中为60% ) Abach S等所述的结果支持用本发明所述试 剂盒获得的结果(表9)。
[0267] 1来自Obach S等(2004)，在人肝微粒体+/-CYP450的特异性抑制剂中
[0268] 表9:从本发明的分离的受不可逆抑制的微粒体的试剂盒开始及在存在或不存在 CYP450的人肝微粒体中(Obach等），获得的CYP450在珊特拉林氧化性代谢中的百分比参与。
[0269] 所获得的结果显示，用表型分析试剂盒在体外测量的参与所选择的活性成分代谢 的酶的贡献，与根据体内数据和/或从其他体外模型获得的数据估计或测量的那些非常相 似或甚至相同。与临床数据相比，在生物异源物质代谢途径酶促表型分析背景下，不可逆抑 制、分离和冷冻保存的微粒体试剂盒的验证，证明了此体外模型与人类中体内情境相比的 代表性。
[0270] 此外，获得对活性成分代谢的酶促贡献的直接测量不仅使得可能获得解释的时间 和实施上的益处，还避免了进行其他体内模型的多重操作中所固有的误差。
【主权项】
1. 制备包含受不可逆抑制的细胞色素 P450(CYP450)的分离的微粒体的方法，其特征在 于它包括以下步骤： a) 不可逆抑制细胞色素 P450; b) 浓缩微粒体蛋白质。2. 权利要求1的方法，其特征在于它包括一个或多个洗涤步骤。3. 权利要求2的方法，其特征在于一个或多个洗涤步骤置于浓缩微粒体蛋白质的步骤 之前和/或之后。4. 权利要求1的方法，其特征在于通过过滤/离心或超速离心来获得微粒体的浓缩。5. 权利要求1的方法，其特征在于将微粒体浓缩至10mg/ml至30mg/ml的浓度。6. 权利要求1的方法，其特征在于它包含最后的保存步骤。7. 权利要求6的方法，其特征在于保存步骤是冷冻。8. 权利要求1的方法，其特征在于微粒体是人肝微粒体。9. 权利要求1的方法，其特征在于受不可逆抑制的细胞色素 P450选自CYPl家族、CYP2家 族和CYP3家族。10. 权利要求9的方法，其特征在于细胞色素 P450选自以下细胞色素:CYP1A2、CYP2A6、 CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4。11. 分离的微粒体，其特征在于细胞色素 P450受不可逆抑制。12. 权利要求11的分离的微粒体，其特征在于受不可逆抑制的细胞色素 P450选自CYPl 家族、CYP2家族和CYP3家族。13. 权利要求12的分离的微粒体，其特征在于受不可逆抑制的细胞色素 P450选自以下 细胞色素 ：CYPl A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4。14. 权利要求11至13中任一项的微粒体，其特征在于它通过冷冻来保存。15. 分离的微粒体，其特征在于它按照本发明权利要求1至10中任一项的制备方法获 得。16. 对参与活性成分代谢的酶促反应进行表型分析的方法，其特征在于它包括以下步 骤： -将权利要求11至14的分离的微粒体与活性成分孵育； -测量参与活性成分代谢的受不可逆抑制的细胞色素 P450的贡献。17. 表型分析试剂盒，其特征在于它包含： -权利要求11至14的分离的微粒体； -对照微粒体。
【文档编号】C12Q1/26GK105960465SQ201480074865
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2014年12月5日
【发明人】F·卡拉德克, Y·帕尔芒捷, C·波蒂埃
【申请人】法国施维雅药厂