用于制备睫状缘区样结构的方法

用于制备睫状缘区样结构的方法
【专利摘要】本发明提供用于制备含有睫状缘区样结构的细胞团聚体的方法，所述方法包括以下步骤：仅在表达RPE65基因的细胞出现之前的一段时间在各自含有作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中培养含有视网膜组织的细胞团聚体，在所述视网膜组织中Chx10阳性细胞以所述组织的20％以上和100％以下的比例存在，接着在各自不含作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中培养因此获得的“表达RPE65基因的细胞不在其中出现的细胞团聚体”等。根据本发明的制备方法，可以高效制备睫状缘区样结构。
【专利说明】
用于制备睫状缘区样结构的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及用于制备睫状缘区样结构的方法等。
【背景技术】
[0002] 已知体内视网膜的睫状缘区（CMZ)对于视网膜组织的结构形成和维持执行重要功 能（参见，例如，非专利文献1)并且，例如，已知RdhlO基因（非专利文献2)和Otxl基因（非专 利文献1)作为睫状缘区的基因标志物。
[0003] [文献列表]
[0004][非专利文献]
[0005] 非专利文献DEVELOPMENTAL DYNAMICS，第239卷，第2066-2077页（2010)
[0006] 非专利文献 2:Development，第 136 卷，第 1823-1833卷（2009)
[0007][发明概述]
[0008][本发明要解决的问题]
[0009] 已经存在对开发用于高效制备睫状缘区样结构的方法的需要。
[0010] 解决问题的方式
[0011] 本发明提供用于从包含视网膜组织的细胞团聚体制备睫状缘区样结构的方法， 等。
[0012] 具体地，本发明提供：
[0013] 1.用于制备包含睫状缘区样结构的细胞团聚体的方法，所述方法包括以下步骤： 仅在表达RPE65基因的细胞出现之前的一段时间在各自含有作用于Wnt信号途径的物质和 抑制FGF信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中培养包含视网膜组织的细胞团 聚体，在所述视网膜组织中ChxlO阳性细胞以所述组织的20%以上和100%以下的比例存 在，接着在各自不含作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中培养得 到的"表达RPE65基因的细胞不在其中出现的细胞团聚体"。（下文中有时也称为本发明的制 备方法）；
[0014] 2.上述1所述的制备方法，其中所述表达RPE65基因的细胞不在其中出现的细胞团 聚体是这样的细胞团聚体，其中ChxlO阳性细胞以所述视网膜组织的30%至0%内的比例存 在于所述组织中；
[0015] 3.上述1或2所述的制备方法，其中得到的"表达RPE65基因的细胞不在其中出现的 细胞团聚体"在各自不含作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中培 养直至存在于所述视网膜组织中的ChxlO阳性细胞的比例达到所述组织的30%以上；
[0016] 4.上述1至3中任一项所述的制备方法，其中所述视网膜组织来源于人多能干细 胞；
[0017] 5.通过上述1至4中任一项所述的制备方法制备的包含睫状缘区样结构的细胞团 聚体作为用于评价毒性或药效的试剂的用途；
[0018] 6.评价测试物质的毒性或药效的方法，所述方法包括将所述物质与通过上述1至4 中任一项所述的制备方法制备的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体接触，并且测定所述物 质对所述结构或所述团聚体的影响；
[0019] 7.通过上述1至4中任一项所述的制备方法制备的包含睫状缘区样结构的细胞团 聚体作为用于移植的生物材料的用途；
[0020] 8.治疗由视网膜组织的障碍所致的疾病的方法，所述方法包括向需要移植的受试 者移植有效量的通过上述1至4中任一项所述的制备方法制备的包含睫状缘区样结构的细 胞团聚体；
[0021 ] 9.通过上述1至4中任一项所述的制备方法制备的包含睫状缘区样结构的细胞团 聚体，其用于治疗由于所述睫状缘区样结构障碍导致的疾病;等。
[0022]发明效果
[0023] 根据本发明的制备方法，可以高效制备睫状缘区样结构。在通过本发明的制备方 法制备的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体中，睫状缘区样结构作为进展区行使功能，并 且那里可以高效形成与睫状缘区样结构相邻的具有层结构的连续神经视网膜。
[0024] [附图简述]
[0025] 图1显示含有视网膜组织的细胞团聚体的冷冻切片的染色图像(在自悬浮培养开 始的第18天）Z'A"是表达Rax基因的细胞的GFP荧光图像，"B"是ChxlO阳性细胞的免疫染色 图像，并且Τ'是细胞核的DAPI染色图像。
[0026]图2显示通过在不含作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的血清 培养基中将含有视网膜组织的细胞团聚体(在悬浮培养开始的第18天)悬浮培养6天，即至 自悬浮培养开始的第24天(A，B)，或悬浮培养17天，即至自悬浮培养开始的第35天(C，D)获 得的细胞团聚体的冷冻切片的染色图像。"A"和"C"显示ChxlO阳性细胞的免疫染色图像，并 且"B"和"D"显示MITF阳性细胞的免疫染色图像。
[0027]图3显示在含有作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的无血清培 养基中将含有视网膜组织的细胞团聚体(在自悬浮培养开始第18天)悬浮培养6天，即至自 悬浮培养开始第24天获得的细胞团聚体(A，B)和通过进一步将上述细胞团聚体(在自悬浮 培养开始第24天)在含有作用于Wnt信号途径的物质而不含抑制FGF信号途径的物质的含血 清培养基中悬浮培养11天，即至自悬浮培养开始第35天获得的细胞团聚体(C，D)的冷冻切 片的染色图像。"A"和"C"是ChxlO阳性细胞的免疫染色图像，并且"B"和"D"是MITF阳性细胞 的免疫染色图像。
[0028]图4显示将含有视网膜组织的细胞团聚体(在自悬浮培养开始第18天)在含有作用 于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的无血清培养基中悬浮培养6天，即至自 悬浮培养开始第24天获得的细胞团聚体(A，B)和通过将上述细胞团聚体(在自悬浮培养开 始第24天)在不含作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的含血清培养基中 进一步悬浮培养11天，即至自悬浮培养开始第35天获得的细胞团聚体(C，D)的冷冻切片的 染色图像。"A"和"C"是ChxlO阳性细胞的免疫染色图像，并且"B"和"D"是MITF阳性细胞的免 疫染色图像。
[0029]图5显示将含有视网膜组织的细胞团聚体(在自悬浮培养开始第18天)在含有作用 于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的无血清培养基中悬浮培养6天，并且在 不含作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的含血清培养基中进一步悬浮 培养39天，即至自悬浮培养开始第63天获得的细胞团聚体的冷冻切片的染色图像。"A"（Rx) 是表达Rax基因的细胞的GFP荧光图像，"B"是Otxl阳性细胞的免疫染色图像，并且"C"是 RdhlO阳性细胞的免疫染色图像。
[0030] 图6是这样的图，其显示在自悬浮培养开始第35天通过在实施例4中描述的三种条 件(A，B，C)下悬浮培养含有视网膜组织的细胞团聚体(在自悬浮培养开始第18天)获得的细 胞团聚体中，只含有神经视网膜的细胞团聚体的比例(灰色条形图），含有自睫状缘区样结 构连续形成的神经视网膜的细胞团聚体的比例（黑色条形图），和不含神经视网膜而含有视 网膜色素上皮和其他组织的细胞团聚体的比例（白色条形图）。
[0031] 图7显示将含有视网膜组织的细胞团聚体(在自悬浮培养开始第18天)在含有作用 于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的无血清培养基中悬浮培养6天，即至自 悬浮培养开始第24天获得的细胞团聚体的冷冻切片的染色图像(A，B)。"A"是细胞核的DAPI 染色图像，并且"B"是RPE65阳性细胞的免疫染色图像。
[0032]实施方案描述
[0033] 以下详细说明用于进行本发明的方式。
[0034] 在本发明中，"干细胞"的实例包括甚至在细胞分裂后仍保持相同分化能力并且可 以在组织受损伤时再生组织的细胞。在本文中，"干细胞"可以是胚胎干细胞(ES细胞)或组 织干细胞(也称为组织的干细胞，组织特异性干细胞或体干细胞），或人工多能干细胞（iPS 细胞:诱导的多能干细胞），但不限于此。如由来源于干细胞的组织细胞可以再生组织的事 实理解的，已知干细胞可以分化为与活体内的接近的正常细胞。
[0035] 本发明中的"多能干细胞"的实例包括可以在体外培养并且具有分化为构成除了 胎盘外的活体的任意细胞(来源于三胚层(外胚层、中胚层、内胚层）的组织）的能力（多能 性)的干细胞，包括胚胎干细胞(ES细胞）。"多能干细胞"获自受精卵、克隆胚胎、生殖干细胞 和组织中的干细胞。其还包括在将多种类型的基因引入体细胞后具有诱导的与胚胎干细胞 类似的多能性的细胞(也称为人工多能干细胞）。多能干细胞可以通过本身已知的方法产 生。多能干细胞的制备方法的实例包括Cell 131(5)第861-872页（2007)，Cell 126(4)第 663-676页(2006)等中描述的方法。
[0036] 本发明中"胚胎干细胞(ES细胞)"的实例包括具有自我复制能力和多潜能性(特别 是，"多能性"）的干细胞，其是来自早期胚胎的多能干细胞。胚胎干细胞最早在1981年建立， 并且自从1989年起也已经被用于制备基因敲除小鼠。在1998年，建立了人胚胎干细胞，其也 被用于再生医学。
[0037] 本发明中的"人工多能干细胞"的实例包括通过直接重编程分化的细胞(如成纤维 细胞等)通过表达多种基因如0ct3/4、Sox2、Klf4和Myc而诱导成具有多能性的细胞，其由 Yamanaka的小组在2006在小鼠细胞中建立（Takahashi K和Yamanaka S · Cel 1 · 2006，126 (4)，p 663-676)。在2007年，人工多能干细胞还在人成纤维细胞中建立，并且具有与胚胎干 细胞类似的多能性(Cell，2007,131(5)，p861-872;Science，2007，318(5858)，pl917-1920; Nat Biotechnol·，2008,26(1)，pl01_106)。
[0038] 多能干细胞可从指定组织获得，或可以购买可商购的产品。例如，人胚胎干细胞， KhES-l、KhES-2和KhES-3,可从京都大学的前沿医学科学研究所（Institute for Frontier Medical Sciences)获得。分别地，EB5细胞（其是小鼠胚胎干细胞）可从Incorporated Administrative Agency RIKEN获得，并且D3细胞系可从ATCC获得。
[0039] 多能干细胞可以通过根据本身已知的方法培养来维持。例如，人干细胞可以通过 使用Knockout?血清代替物(KSR)培养来维持。例如，小鼠干细胞可以通过在添加胎牛血清 (FBS)和白血病抑制因子(LIF)而没有饲养细胞的情况下培养来维持。
[0040] 本发明中的"团聚体"的实例包括分散在培养基中但聚集而形成的细胞团块。本发 明中的"团聚体"包括由在悬浮培养开始时分散的细胞形成的团聚体和在悬浮培养开始时 已经形成的团聚体。
[0041] 当细胞聚集以形成细胞团聚体并且对所述团聚体进行悬浮培养时，"形成团聚体" 意为"快速聚集给定数量的分散的干细胞"以形成质量上均匀的细胞团聚体。例如，当多能 干细胞快速聚集以允许形成多能干细胞的团聚体时，可以在来自形成的团聚体的被诱导成 分化的细胞中以良好的再现性形成上皮样结构。
[0042] 形成团聚体的实验操作的实例包括涉及通过使用具有小孔的板(96孔板）、微孔等 将细胞保持在小的空间中的方法，涉及通过使用小的离心管等短时离心聚集细胞的方法。
[0043] 本发明中的"组织"的实例包括细胞群体的结构，其具有这样的构型，其中形状和 性质不同的多于一种类型的细胞以给定样式在空间上配置。
[0044] 在本发明中，"视网膜组织"的实例包括视网膜组织等，其中在体内视网膜中构成 相应视网膜层的至少两种或更多种类型的细胞如光感受器、水平细胞、双极细胞、无长突细 胞(amacrin cell)、视网膜神经节细胞、其先祖细胞、其视网膜先祖细胞等在空间上层状排 列。关于各种细胞，哪种细胞构成哪个视网膜层可以通过已知方法，例如，是否存在细胞标 志物的表达或其水平等来确认。
[0045] 作为本发明中的"视网膜组织"，也可以提及含有视网膜先祖细胞或神经视网膜先 祖的上皮组织，其可以通过在适于分化为视网膜的条件下悬浮培养团聚体而在多能干细胞 的细胞团聚体的表面上形成。
[0046] 本发明中的"视网膜层"意为构成视网膜的各个层。其具体实例包括视网膜色素上 皮层、光感受器层、外界膜、外核层、外网织层、内核层、内网织层、神经节细胞层、神经纤维 层和内界膜。
[0047] 作为本发明中的"视网膜先祖细胞"，可以提及能够分化为任何构成神经视网膜和 视网膜色素上皮的成熟视网膜细胞的先祖细胞。
[0048]作为"神经视网膜先祖"，可以提及先祖细胞，其是注定形成视杯的内层并且能够 分化为构成神经视网膜的任何成熟细胞的细胞。
[0049]视网膜细胞标志物的实例包括在视网膜先祖细胞中表达的Rax和PAX6,在神经视 网膜先祖细胞中表达的ChxlO,在下丘脑神经元的先祖细胞中表达但在视网膜先祖细胞中 不表达的Nkx2.1，在下丘脑神经上皮中表达但在视网膜中不表达的Soxl，在光感受器细胞 的先祖细胞中表达的Crx，等。视网膜层特异性神经元的标志物的实例包括在双极细胞中表 达的ChxlO和L7,在神经节细胞中表达的TUJI和Brn3,在无长突细胞中表达的钙视网膜蛋白 (Calretinin)，在水平细胞中表达的f丐结合蛋白（Calbindin)，在光感受器细胞中表达的视 紫红质和恢复蛋白（Recoverin)，在色素上皮细胞中表达的RPE65和Mitf，在视杆细胞中表 达的Nrl，在视锥细胞中表达的Rxr- γ等。
[0050]本发明中的"睫状缘区（CMZ)"的实例包括体内视网膜中的视网膜组织(具体是，神 经视网膜)和视网膜色素上皮的边界区域中存在的组织，其是包括视网膜的组织干细胞(视 网膜干细胞）的区域。睫状缘区也被称为睫状缘或视网膜缘，并且睫状缘区、睫状缘和视网 膜缘是相当的组织。已知睫状缘区在将视网膜先祖细胞和分化的细胞提供给视网膜组织、 维持视网膜组织结构等方面发挥重要作用。睫状缘区的标志物基因的实例包括RdhlO基因 (阳性）、Qtxl基因（阳性)等。
[0051]本发明中的"进展区"的实例包括位于组织的一部分中的未分化的细胞的群体，并 且其实例包括具有在发育和再生过程中连续生长以促进组织整体生长的性质和/或通过分 泌生长因子等促进周围组织生长的性质的细胞群体。进展区的具体实例包括在肢芽尖端处 的未分化细胞群体。
[0052]用于本发明的"培养基"可以由作为基础培养基用于培养动物细胞的培养基制备。 基础培养基的实例包括可以用于培养动物细胞的培养基如BME培养基、BGJb培养基、 CMRL1066培养基、Glasgow MEM培养基、Improved MEM Zinc Option培养基、頂DM培养基、 Mediuml 99培养基、Eagl e MEM培养基、αΜΕΜ培养基、DMEM培养基、ham培养基、F-12培养基、 DMEM/F-12培养基、RPMI1640培养基、Fischer ' s培养基和其混合培养基等。
[0053]本发明中的"无血清培养基"的实例包括不含未调节或未纯化的血清的培养基。在 本发明中，含有纯化的血液源的成份和动物组织来源的成份(例如，生长因子）的培养基也 包括在无血清培养基内，除非其中含有未调节的或未纯化的血清。
[0054]无血清培养基可以含有血清代替物。血清代替物的实例包括清蛋白、转铁蛋白、月旨 肪酸、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇或3'巯基甘油、适当含有这些的等效物等的血清代 替物等。这样的血清代替物可以通过例如，W098/30679等中描述的方法制备。此外，血清代 替物可以是可商购的产品。此种可商购的血清代替物的实例包括Knockout?血清代替物 (In vitrogen:下文中有时也表示为KSR)，化学成分确定的脂质浓缩物（Chemically Defined Lipid Concentrate，由Gibco制备）和Glutamax(由Gibco制备）。
[0055]用于悬浮培养的"无血清培养基"可以含有脂肪酸、脂质、氨基酸(例如，非必需氨 基酸）、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂、无机盐等。 [0056]为了避免复杂的制备，补充以适量(例如，约1-约20%)的可商购的KSR的无血清培 养基(GMEM或DMEM培养基，补充有0.1 mM 2-巯基乙醇，0.1 mM非必需氨基酸混合物和ImM丙酮 酸钠;或补充以450μΜ 1--硫代甘油等的F-12培养基和頂DM培养基的1:1混合物)可以优选 作为无血清培养基被提及。
[0057]本发明中的"含血清培养基"的实例包括含有未调节或未纯化的血清的培养基。所 述培养基可以含有脂肪酸、脂质、氨基酸(例如，非必需氨基酸）、维生素、生长因子、细胞因 子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂、无机盐等。
[0058] 本发明中添加于培养基中的"血清"的实例包括哺乳动物血清，如牛血清、小牛血 清、胎牛血清、马血清、小马血清、胎马血清、兔血清、小兔血清、胎兔血清和人血清等。
[0059] 在本发明中，"含有物质X的培养基"是补充有外源物质X的培养基或含有外源物质 X的培养基，并且"不含物质X的培养基"是未补充外源物质X的培养基或不含外源物质X的培 养基。如本文中使用的，"外源物质X"意为相对于在培养基中培养的细胞或组织来说为外源 的物质X，并且不包括细胞或组织产生的内源物质X。
[0060] 例如，"含有作用于Wnt信号途径的物质的培养基"是补充有作用于Wnt信号途径的 外源物质的培养基或不含作用于Wnt信号途径的外源物质的培养基。"不含抑制FGF信号途 径的物质的培养基"是未补充抑制FGF信号途径的外源物质的培养基或不含抑制FGF信号途 径的外源物质的培养基。
[0061] 本发明中"悬浮培养"的实例包括在对细胞培养容器等非粘附条件下在培养基中 培养细胞团聚体。
[0062] 用于悬浮培养的细胞培养容器不特别限制，只要其使得能够悬浮培养细胞即可。 这样的细胞培养容器的实例包括烧瓶、组织培养烧瓶、盘、培养皿、组织培养盘、多皿 (multidish)、微板、微孔板、微孔(micropore)、多板(multiplate)、多孔板、室载玻片 (chamber slide)、碗(schale)、试管、浅盘、培养袋、转瓶等。优选的容器是细胞非粘附性容 器。
[0063] 作为细胞非粘附性容器，可以使用表面未人工处理成提高细胞粘附性(例如，利用 细胞外基质的包被处理等）的容器等。作为细胞非粘附性容器，可以使用表面被人工处理成 降低对细胞的粘附性(例如，超疏水处理)的容器等。
[0064]本发明的制备方法特征性地包括以下步骤:仅在表达RPE65基因的细胞出现前的 一段时间在各自含有作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的无血清培养 基或含血清培养基中培养包含视网膜组织的细胞团聚体，在所述视网膜组织中ChxlO阳性 细胞以所述组织的20%以上和100%以下的比例存在，接着将得到的"表达RPE65基因的细 胞不在其中出现的细胞团聚体"在各自不含作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或 含血清培养基中培养。通过本发明的制备方法制备的"包含睫状缘区样结构的细胞团聚体" 可用作用于评价化学物质等的毒性或药效的试剂或用作用于旨在细胞治疗等的测试或治 疗的材料。
[0065] 用作本发明的制备方法中的起始材料的"包含视网膜组织的细胞团聚体"是这样 的细胞团聚体，其中ChxlO阳性细胞以所述视网膜组织的20%以上和100%以下的比例存在 于所述组织中。上述"ChxlO阳性细胞的比例"，例如，优选为40%以上，更优选60%以上，特 别优选70%以上。
[0066] 在本发明的制备方法中用作起始材料的"包含视网膜组织的细胞团聚体"可以例 如由多能干细胞(优选人多能干细胞)制备。作为多能干细胞，可以提及胚胎干细胞和诱导 的多能干细胞。
[0067] 在本发明的制备方法中用作起始材料的"包含视网膜组织的细胞团聚体"可以具 体地例如通过包括以下步骤(A)和(B)的方法制备：
[0068] (A)将多能干细胞在无血清培养基中进行悬浮培养以形成多能干细胞的团聚体的 步骤，和
[0069] (B)将步骤(A)中形成的团聚体在各自不含作用于Sonic hedgehog信号转导途径 的物质而含有作用于BMP信号转导途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中进行悬浮 培养以得到包含视网膜先祖细胞的细胞团聚体的步骤。
[0070] 说明用于通过在无血清培养基中悬浮培养多能干细胞形成多能干细胞的团聚体 的步骤(A)。
[0071] 用于步骤(A)的无血清培养基不特别受限，只要其是如上文所述的。例如，可以提 及补充有适量的可商购的血清代替物如KSR等的无血清培养基(例如，补充有10%KSR、450y Μ 1--硫代甘油和lx化学成分确定的脂质浓缩物的IMDM和F-12的1:1混合物的培养基）。在 人ES细胞的情形中，添加到无血清培养基中的KSR的量通常为约1%至约20%，优选约2%至 约 20 %。
[0072] 步骤(A)中的培养条件如培养温度、C02浓度等可以适当确定。培养温度例如是约 30°C至约40°C，优选约37°C。C02浓度例如是约1 %至约10 %，优选约5 %。
[0073] 步骤(A)中多能干细胞的浓度可以确定为适于更均匀和有效地形成多能干细胞的 团聚体。例如，当使用96孔微孔板对人ES细胞进行悬浮培养时，将制备为约1 X 103至约1 X 1〇5个细胞，优选约3 X 103至约5 X 104个细胞，更优选约5 X 103至约3 X 104个细胞，最优选约 1.2 X 104个细胞/孔的液体加入孔中，并且将板静止以形成细胞团聚体。
[0074] 形成细胞团聚体所需的悬浮培养时间可以根据使用的多能干细胞酌情确定，以使 细胞可以均匀聚集。为了形成均匀的细胞团聚体，希望其尽可能短。例如，在人ES细胞的情 况下，团聚体优选在约24hr内，更优选在约12hr内形成。细胞团聚体形成所需的时间可以通 过控制用于聚集细胞的工具、离心条件等适当调节。
[0075] 多能干细胞的团聚体的形成可以基于细胞团聚体的大小和细胞数、宏观形态、通 过组织染色分析的微观形态及其均匀性、分化和未分化标志物的表达及其均匀性、分化标 志物的表达的控制及其同步性、细胞团聚体间分化效率的再现性等确定。
[0076] 说明用于通过将步骤(A)中形成的细胞团聚体在各自不含作用于Sonic hedgehog 信号转导途径的物质而含有作用于BMP信号转导途径的物质的无血清培养基或含血清培养 基中悬浮培养获得包含视网膜先祖细胞的细胞团聚体的步骤(B)。
[0077]用于步骤(B)的培养基是未补充作用于Sonic hedgehog信号转导途径的物质而补 充有作用于BMP信号转导途径的物质的无血清培养基或含血清培养基，其不需要加入基底 膜制剂。
[0078] 用于这样的培养基的无血清培养基或含血清培养基不特别受限，只要其是如上文 所述的即可。例如，可以提及补充有适量的可商购的血清代替物如KSR等的无血清培养基 (例如，补充有10%KSR、450yM 1--硫代甘油和lx化学成分确定的脂质浓缩物的IMDM和F- 12的1:1混合物的培养基）。在人ES细胞的情况下，加入无血清培养基中的KSR的量通常是约 1 %至约20 %，优选约2 %至约20 %。
[0079] 作为用于步骤(B)中的无血清培养基，可以直接使用用于步骤(A)的无血清培养 基，或可以用新鲜无血清培养基替代。当将用于步骤(A)的无血清培养基直接用于步骤(B) 时，可以将作用于BMP信号转导途径的物质加入至所述培养基。
[0080]作用于Sonic hedgehog(下文有时表示为Shh)信号转导途径的物质是能够增强 Shh介导的信号转导的物质。作用于Shh信号转导途径的物质的实例包括属于Hedgehog家族 的蛋白（例如，Shh)、Shh受体、Shh受体激动剂、Purmorphamine或SAG等。
[0081]作用于BMP信号转导途径的物质是能够增强BMP介导的信号转导的物质。作用于 BMP信号转导途径的物质的实例包括BMP蛋白如BMP2、BMP4、BMP7等，GDF蛋白如GDF7等，抗_ BMP受体抗体，BMP部分肽等。BMP2蛋白、BMP4蛋白和BMP7蛋白可从例如R&D Systems获得，并 且GDF7蛋白可从例如Wako Pure Chemical Industries,Ltd获得。
[0082]作用于BMP信号转导途径的物质的浓度仅需要是可以诱导形成多能干细胞的团聚 体的细胞向视网膜细胞分化的浓度。例如，在BMP4的情况下，将其加入至培养基中至约 Ο. OlnM至约ΙμΜ，优选约Ο. InM至约ΙΟΟηΜ，更优选约1.5nM的浓度。
[0083] 作用于BMP信号转导途径的物质仅需要在步骤(A)中的悬浮培养开始起约24小时 后加入，并且可以在自悬浮培养开始起的数天内（例如，15天内）加入至培养基。优选地，作 用于BMP信号转导途径的物质在自悬浮培养开始起的第1天至第15天，更优选第1天至第9 天，更优选第6天加入至培养基中。
[0084] 在将作用于BMP信号转导途径的物质加入至培养基后，和在开始将形成多能干细 胞的团聚体的细胞分化诱导为视网膜细胞后，不需要向培养基中添加作用于BMP信号转导 途径的物质，并且培养基可以与各自不含作用于BMP信号转导途径的物质的无血清培养基 或含血清培养基交换。以此方式，培养基的成本可以被遏制。开始向视网膜细胞的分化诱导 的细胞可以通过，例如，检测细胞中Rax基因的表达来确认。对通过使用用荧光报告蛋白基 因如GFP等敲入Rax基因基因座中的多能干细胞在步骤(A)中形成的细胞团聚体在作用于 BMP信号转导途径的物质以分化诱导为视网膜细胞所需的浓度存在的情况下进行悬浮培 养，并且检测从表达的荧光报告蛋白发出的荧光，从而可以确定开始分化诱导为视网膜细 胞的时间。步骤(B)的一个实施方案是这样的步骤，其用于通过将步骤(A)中形成的细胞团 聚体在各自不含作用于Sonic hedgehog信号转导途径的物质而含有分化诱导为视网膜细 胞所需浓度的作用于BMP信号转导途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养 直至表达Rax基因的细胞开始出现而获得包含视网膜先祖细胞的细胞团聚体。
[0085] 步骤(B)中的培养条件如培养温度、C02浓度等可以适当确定。培养温度例如是约 30°C至约40°C，优选约37°C。C02浓度例如是约1 %至约10 %，优选约5 %。
[0086] 获得包含视网膜先祖细胞的细胞团聚体可以通过例如检测表达Rax或PAX6(其是 视网膜先祖细胞标志物）的细胞在团聚体中的存在来确定。通过包括上述步骤(A)和(B)的 方法获得的"包含视网膜先祖细胞的细胞团聚体"可以用作"包含视网膜组织的细胞团聚 体"作为本发明的制备方法中的起始材料。
[0087] 在本发明的制备方法中用作起始材料的"包含视网膜组织的细胞团聚体"也可以 具体例如通过包括以下步骤(C)、(D)和(E)的方法制备：
[0088] (C)将多能干细胞在含有抑制Wnt信号途径的物质的无血清培养基中进行悬浮培 养以形成多能干细胞的团聚体的步骤，
[0089] (D)将步骤(C)中形成的细胞团聚体在含有基底膜制剂的无血清培养基中进行悬 浮培养的步骤，和
[0090] (E)将步骤(D)中培养的细胞团聚体在含血清培养基中进行悬浮培养的步骤。
[0091] 用于步骤(C)的抑制Wnt信号途径的物质不特别受限，只要其可以抑制Wnt介导的 信号转导即可。抑制Wnt信号途径的物质的实例包括Dkkl、Cerberus蛋白、Wnt受体抑制剂、 可溶型Wnt受体、Wnt抗体、酪蛋白激酶抑制剂、显性阴性Wnt蛋白、CKI-7 (N-( 2-氨基乙基)- 5-氯-异喹啉-8-磺胺）、D4476(4-{4-(2,3-二氢苯并[l，4]二嚷英-6-基)-5-吡啶-2-基-lH- 咪唑-2-基}苯甲酰胺）、IWR-1-endo(IWRle)、IWP-2等。抑制Wnt信号途径的物质的浓度仅需 要是可以形成多能干细胞的团聚体的浓度。例如，常见抑制Wnt信号途径的物质如IWRle以 约0 . ΙμΜ至约100μΜ，优选约ΙμΜ至约10μΜ，更优选约3μΜ的浓度加入。
[0092] 可以在悬浮培养开始前将抑制Wnt信号途径的物质加入至无血清培养基，或在自 悬浮培养开始起的数天内（例如，5天内）加入至无血清培养基。优选地，在自悬浮培养开始 起的5天内，更优选在3天内，最优选在悬浮培养开始的同时将抑制Wnt信号途径的物质加入 至无血清培养基中。此外，在添加抑制Wnt信号途径的物质的情况下进行悬浮培养直至自悬 浮培养开始起的第18天，更优选第12天。
[0093] 步骤(C)中的培养条件如培养温度和C02浓度可以适当确定。虽然培养温度不受特 别限制，但是其例如是约3 0 °C至约4 0 °C，优选约3 7 °C。C 0 2浓度例如是约1 %至约10 %，优选 约5%〇
[0094] 步骤(C)中多能干细胞的浓度可以由本领域技术人员酌情确定以更均匀和有效地 形成多能干细胞的团聚体。形成细胞团聚体时的多能干细胞的浓度不特别受限，只要其允 许形成干细胞的均匀团聚体即可。例如，当使用96孔微孔板对人ES细胞进行悬浮培养时，加 入被制备成约1 X 1〇3至约5 X 104个细胞，优选约3 X 103个细胞至约3 X 104个细胞，更优选约 5 X 103个细胞至约2 X 104个细胞，最优选约9 X 103个细胞/孔的液体，并且将板静置以形成 细胞团聚体。
[0095] 形成细胞团聚体所需的悬浮培养时间可以根据使用的多能干细胞酌情确定，只要 所述细胞可以快速聚集即可。为了形成均匀的细胞团聚体，希望其尽可能短。例如，在人ES 细胞的情况下，希望细胞团聚体优选在24hr内，更优选在12hr内形成。细胞团聚体形成所需 的时间可以由本领域技术人员通过控制用于聚集细胞的工具、离心条件等适当调节。
[0096] 本领域技术人员可以基于细胞团聚体的大小和细胞数、宏观形态、通过组织染色 分析的微观形态及其均匀性、分化和未分化标志物的表达及其均匀性、分化标志物的表达 的控制及其同步性、细胞团聚体间分化效率的再现性等确定多能干细胞的细胞团聚体是否 形成。
[0097] 用于步骤(D)的基底膜制剂是指这样的制剂，其含有与上皮细胞的那些类似的具 有控制细胞形态、分化、生长、运动、功能表达等的功能的基底膜构成成分（当在其上铺板并 培养能够形成基底膜的目的细胞时）。本文中，"基底膜构成成分"是指动物组织中的上皮细 胞层和间质细胞层之间存在的薄膜形态的胞外基质分子等。基底膜制剂可以通过例如利用 能够溶解细胞的脂质的溶液、碱溶液等移除经由基底膜附着在支持物上的能够形成基底膜 的细胞制备。优选的基底膜制剂的实例包括可作为基底膜成分商购的产品（例如， Matrigel?(由Becton，Dickinson and Company生产：下文中，有时称为Matrigel ))，和已知 为基底膜成分的胞外基质分子(例如，层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 (heparan sulfate proteoglycan)、巢蛋白等）。
[0098] Matrigel?是由来源于Engelbreth Holm Swarn(EHS)小鼠肉瘤的基底膜制备的产 品。Matrigel?的主要成分是IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白。 除这些之外，还包含TGF-β、成纤维细胞生长因子(FGF)、组织纤溶酶原激活物和由EHS肿瘤 天然产生的生长因子。Matrigel?的"生长因子减少的(GFR)产品"具有比常规Matrigel?低 的生长因子浓度。在本发明，优选使用GFR产品。
[0099] 虽然步骤(D)中加入至无血清培养基以用于悬浮培养的基底膜制剂的浓度不特别 受限，只要神经组织（例如，视网膜组织）的上皮结构被稳定维持即可，但是例如，当使用 Martigel?时，其优选为培养基的1/20至1/200体积，更优选约1/100体积。虽然可以在开始 培养干细胞时将基底膜制剂加入至培养基，但优选地在自悬浮培养开始起的5天内，更优选 在2天内将其加入至无血清培养基。
[0100] 作为用于步骤(D)的无血清培养基，可以直接使用用于步骤(C)的无血清培养基， 或可以用新鲜无血清培养基替代。
[0101] 当将步骤(C)中使用的无血清培养基直接用于该步时，可以将"基底膜制剂"加入 至所述培养基。
[0102] 步骤(D)中的培养条件如培养温度和C02浓度可以适当确定。虽然培养温度不受特 别限制，但其例如是约3 0 °C至约4 0 °C，优选约3 7 °C。C 0 2浓度例如是约1 %至约10 %，优选约 5%〇
[0103] 作为要用于步骤(E)的含血清培养基，可以使用步骤(D)的培养中使用的无血清培 养基（向其直接加入血清），或用新鲜的含血清培养基替代。
[0104]在自悬浮培养开始起的第7天或第7天后，更优选在第9天或第9天后，最优选在第 12天加入血清。加入的血清的浓度是约1 %至约30 %，优选约3 %至约20 %，更优选约10 %。
[0105] 在步骤(E)中，除血清以外，添加作用于Shh信号途径的物质可以提高视网膜组织 的制备效率。
[0106] 作用于Shh信号途径的物质不特别受限，只要其可以增强Shh介导的信号转导即 可。作用于Shh信号途径的物质的实例包括属于Hedgehog家族的蛋白（例如，Shh)、Shh受体、 Shh 受体激动剂、Purmorphamine、SAG 等。
[0107] 在例如常见的作用于Shh信号途径的物质如SAG的情况下，该步骤中使用的作用于 Shh信号途径的物质的浓度是约0.1 nM至约ΙΟμΜ，优选约10nM至约ΙμΜ，更优选约ΙΟΟηΜ。
[0108] 在这样培养的细胞团聚体中，存在覆盖细胞团聚体表面的视网膜组织。视网膜组 织可以通过免疫染色方法等确认。通过上述包括步骤(C)、（D)和(E)的方法获得的细胞团聚 体可以用作作为本发明的制备方法中的起始材料的"包含视网膜组织的细胞团聚体"。
[0109] 视网膜组织在通过包括步骤(A)和(B)的上述方法或包括步骤(C)、（D)和(E)的上 述方法获得的细胞团聚体中的存在也可以如下确认。例如，将通过上述方法获得的细胞团 聚体在含血清培养基中进行悬浮培养。用于悬浮培养的细胞培养容器的实例包括上述那 些。培养条件如悬浮培养的培养温度、C〇2浓度和〇2浓度可以适当确定。培养温度不特别受 限，其例如是约30 °C至约40°C，优选约37 °C。C〇2浓度例如是约1 %至约10 %，优选约5 %。〇2浓 度例如是约20 %至约70%，优选约20%至约60 %，更优选约30 %至约50 %。培养时间不特别 限制，其通常是48hr以上，优选7天以上。
[0110]完成悬浮培养后，将细胞团聚体用固定剂如多聚甲醛溶液等固定，并且制备冷冻 切片。将获得的冷冻切片免疫染色，并且确认视网膜组织的层结构的形成。因为视网膜组织 的各个层由不同视网膜先祖细胞(光感受器，水平细胞，双极细胞，无长突细胞，视网膜神经 节细胞)构成，所以层结构的形成可以通过使用针对表达在这些细胞中的上述标志物的抗 体的免疫染色来确认。
[0111] 在如上述制备的细胞团聚体中含有的视网膜组织中的"ChxlO阳性细胞的比例"可 以通过例如以下方法检查。
[0112] (1)首先，制备"包含视网膜组织的细胞团聚体"的冷冻切片。
[0113] (2)然后，进行Rax蛋白的免疫染色。当使用通过将表达Rax基因的细胞改变成表达 荧光蛋白如GFP而获得的基因重组细胞时，使用荧光显微镜等观察上述荧光蛋白的表达。表 达Rax基因的视网膜组织区域在获得的免疫染色图像或荧光显微图像中被指明。
[0114] (3)使用与冷冻切片（其中表达Rax基因的视网膜组织区域已被指明）相同的切片 或相邻切片作为样品，将核用核染色剂如DAPI染色。然后，将上述表达Rax基因的视网膜组 织区域中染色的核的数目计数，从而测量所述视网膜组织区域中所述细胞的数量。
[0115] (4)使用与冷冻切片（其中表达Rax基因的视网膜组织区域已被指明）相同的切片 或相邻切片作为样品，将ChxlO蛋白免疫染色。将上述视网膜组织区域中的ChxlO阳性细胞 的数量计数。
[0116] (5)基于上述(3)和(4)中测量的各个核数量，将ChxlO阳性细胞中核的数量除以上 述表达Rax基因的视网膜组织区域中的核的数量，从而计算"ChxlO阳性细胞的比例"。
[0117]在本发明的制备方法中，首先，仅在表达RPE65基因的细胞出现之前的一段时间在 各自含有作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的无血清培养基或含血清 培养基中培养包含视网膜组织的细胞团聚体，在所述视网膜组织中ChxlO阳性细胞以所述 组织的20 %以上和100 %以下的比例存在。
[0118] 作为本文中优选的培养，可以提及悬浮培养。
[0119] 作为无血清培养基，可以提及作为补充有N2或KSR的基础培养基的无血清培养基。 更具体地，可以提及作为补充有N2补充物(N2，Invitrogen)的DMEM/F-12培养基的无血清培 养基。作为含血清培养基，可以提及作为补充有胎牛血清的基础培养基的含血清培养基。 [0120]培养条件如培养温度、C02浓度可以适当设置。培养温度例如是在约30 °C至约40 °C 的范围内，优选例如约3 7 °C。C0 2浓度例如是在约1 %至约10 %的范围内，优选例如约5 %。
[0121] 当在培养基中培养上述"包含视网膜组织的细胞团聚体"时，无血清培养基或含血 清培养基中含有的作用于Wnt信号途径的物质不特别受限，只要其可以增强Wnt介导的信号 转导即可。作用于Wnt信号途径的物质的具体实例包括属于Wnt家族的蛋白（例如，Wnt3a)、 Wnt受体、Wnt受体激动剂、GSK30抑制剂（例如，6-溴靛玉红-3'-肟（BI0)、CHIR99021、 Kenpaullone)等。
[0122] 在常见的作用于Wnt信号途径的物质如CHIR99021的情况下，包含在无血清培养基 或含血清培养基中的作用于Wnt信号途径的物质的浓度例如在约Ο.ΙμΜ至约100μΜ的范围 内，优选例如在约ΙμΜ至约30μΜ的范围内，更优选例如为约3μΜ。
[0123] 当在培养基中培养上述"包含视网膜组织的细胞团聚体"时，无血清培养基或含血 清培养基中含有的抑制FGF信号途径的物质不受特别限制，只要其可以抑制FGF介导的信号 转导即可。抑制FGF信号途径的物质的实例包括FGF受体、FGF受体抑制剂（例如，SU-540 2、 AZD4547、BGJ398)、ΜΑΡ激酶级联抑制性物质（例如，ΜΕΚ抑制剂、ΜΑΡΚ抑制剂、ERK抑制剂）、 ΡΙ3激酶抑制剂、Akt抑制剂等。
[0124] 无血清培养基或血清培养基中含有的抑制FGF信号途径的物质的浓度仅需要是可 以诱导形成多能干细胞的团聚体的细胞向视网膜细胞分化的浓度。例如，在SU-5402的情况 下，将其加入至培养基中至约〇. ΙμΜ至约100μΜ，优选约ΙμΜ至约30μΜ，更优选约5μΜ的浓度。
[0125] 本发明的制备方法中的"仅在表达RPE65基因的细胞出现前培养一段时间"意为在 表达RPE65基因的细胞出现前的整个时间或部分时间进行培养。即，在整个时间或部分时间 (任意时间）（在此期间，培养系统中的"包含视网膜组织的细胞团聚体"由基本上不表达 RPE65基因的细胞构成）的培养是足够的。通过使用这样的培养，可以获得表达RPE65基因的 细胞不在其中出现的细胞团聚体。"表达RPE65基因的细胞不在其中出现的细胞团聚体"包 括"表达RPE65基因的细胞根本不在其中出现的细胞团聚体"和"表达RPE65基因的细胞基本 上不在其中出现的细胞团聚体"。作为"表达RPE65基因的细胞基本上不在其中出现的细胞 团聚体"，可以提及在细胞团聚体中含有的视网膜组织中以约1 %以下的比例含有RPE65阳 性细胞的细胞团聚体。
[0126] 为了确定这样的具体时间，"包含视网膜组织的细胞团聚体"用作样品，并且存在 或不存在样品中含有的RPE65基因的表达仅需要通过通常的基因工程方法或生化方法测 量。具体而言，例如，是否存在RPE65基因的表达或其水平可以通过对上述"包含视网膜组织 的细胞团聚体"的冷冻切片进行使用抗RPE65蛋白抗体的免疫染色方法来检查。
[0127] "在表达RPE65基因的细胞出现前的一段时间"例如是这样的一段时间，在其期间 上述视网膜组织中存在的ChxlO阳性细胞的比例比在开始在各自含有作用于Wnt信号途径 的物质和抑制FGF信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中培养上述细胞团聚体 时减小，并且落在30%至0%的范围内。"表达RPE65基因的细胞不在其中出现的细胞团聚 体"是这样的细胞团聚体，其中ChxlO阳性细胞以上述视网膜组织的30%至0%内的比例存 在于所述组织中。
[0128] 虽然"在表达RPE65基因的细胞出现前的一段时间"的天数根据作用于Wnt信号途 径的物质和抑制FGF信号途径的物质的类型，无血清培养基或含血清培养基的类型，其他培 养条件等而变化，但其例如是在14天内。更具体地，当使用无血清培养基(例如，这样的无血 清培养基，其是补充有N2的基础培养基)时，上述时间优选例如是在10天内，更优选例如3天 至6天。当使用含血清培养基(例如，这样的含血清培养基，其是补充有胎牛血清的基础培养 基)时，上述时期优选例如在12天内，更优选例如6天至9天。
[0129] 然后将通过如上所述的培养获得的"表达RPE65基因的细胞不在其中出现的细胞 团聚体"在各自不含作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中培养。
[0130] 作为本文中优选的培养，可以提及悬浮培养。
[0131] 作为无血清培养基，可以提及作为补充有N2或KSR的基础培养基的培养基。作为含 血清培养基，可以提及作为补充有胎牛血清的基础培养基的培养基。更具体地，可以提及作 为补充有胎牛血清的DMEM/F-12培养基的血清培养基。
[0132] 上述无血清培养基或含血清培养基可以含有已知的生长因子、促进生长的添加剂 和化学物质等。已知的生长因子的实例包括EGF、FGF、IGF、胰岛素等。促进生长的添加剂的 实例包括N2补充物(N2，Invitrogen)、B27补充物（Invitrogen)、KSR等。促进生长的化学物 质的实例包括维甲酸类(例如，视黄酸)和牛磺酸。
[0133] 优选的培养期例如是这样的培养期，其间存在于上述视网膜组织中的ChxlO阳性 细胞的比例比在开始在各自不含作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养 基中培养上述细胞团聚体时增加，并且达到30%以上。
[0134] 培养条件如培养温度、C02浓度可以适当设置。培养温度例如是在约30 °C至约40 °C 的范围内，优选例如约3 7 °C。C0 2浓度例如是在约1 %至约10 %的范围内，优选例如约5 %。
[0135] 虽然直至获得"包含睫状缘区样结构的细胞团聚体"的上述培养天数根据无血清 培养基或含血清培养基的类型，其他培养条件等而改变，但其例如是在100天内。上述培养 天数优选为例如20天至70天，更优选例如30天至60天。
[0136] 在这样产生的"包含睫状缘区样结构的细胞团聚体"中，视网膜色素上皮和视网膜 组织(具体地，神经视网膜)与相同细胞团聚体中的睫状缘区样结构邻近地存在。所述结构 可以通过显微观察等确认。具体地，例如，当细胞团聚体由其中GFP基因被敲入Rax基因座 (RAX: : GFP敲入细胞）的多能干细胞产生时，神经视网膜(其是RAX: : GFP强阳性区）、视网膜 色素上皮(其是这样的上皮组织，其中用透射光可以观察到色素沉着)和在神经视网膜和视 网膜色素上皮之间的边界区域中并且具有特征结构的睫状缘区样结构的存在可以通过使 用荧光立体显微镜(例如，Olympus公司生产的SZX16)来确认。
[0137] 在这样产生的"包含睫状缘区样结构的细胞团聚体"中，在两个神经视网膜组织之 间的区域中形成睫状缘区样结构。即，有时形成连续含有神经视网膜组织、睫状缘区样结构 和另一神经视网膜组织的组织。在该情况下，睫状缘区样结构的存在可以通过显微观察确 认，因为睫状缘区样结构的特征是比相邻神经视网膜组织更薄。
[0138] 高度纯的视网膜组织（具体地，神经视网膜)可以通过用镊子等从上述"包含睫状 缘区样结构的细胞团聚体"物理切下视网膜组织(具体地，神经视网膜)来制备。高度纯的视 网膜组织（具体地，神经视网膜）可以被进一步连续培养（具体地，长期培养达例如60天以 上），而维持其具有的良好的组织结构。培养条件如培养温度、C02浓度、02浓度可以是通常用 于组织培养的那些。在该情况下，培养可以在血清、已知的生长因子、促进生长的添加剂和 化学物质等的存在下进行。已知的生长因子的实例包括EGF、FGF等。促进生长的添加剂的实 例包括N2补充物（Invitrogen)、B27补充物（Invitrogen)等。
[0139] 本发明还包括通过本发明的制备方法制备的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体 作为用于评价毒性或药效的试剂的用途，通过本发明的制备方法制备的包含睫状缘区样结 构的细胞团聚体作为用于移植的生物材料的用途等。
[0140] 〈包含睫状缘区样结构的细胞团聚体作为用于评价毒性或药效的试剂的用途〉
[0141 ]通过本发明的制备方法制备的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体可以用于筛选 用于由视网膜细胞障碍导致的疾病的治疗药物，用于疾病或药物发现材料的研究的材料。 通过本发明的制备方法制备的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体还可用于评价化学物质 等的毒性或药效，以及毒性如光毒性、神经毒性等的研究，毒性测试等。例如，将通过本发明 的制备方法制备的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体与测试物质接触，并且测定所述物质 对细胞或组织的影响，基于此来评价所述物质的毒性或药效。
[0142]〈包含睫状缘区样结构的细胞团聚体作为用于移植的生物材料的用途〉
[0143]通过本发明的制备方法制备的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体可以用作移植 用生物材料，所述移植用生物材料用于补充处于细胞损伤状态的患病组织本身(例如，用于 移植手术)等。例如，将有效量的通过本发明的制备方法制备的包含睫状缘区样结构的细胞 团聚体移植入需要移植的受试者，从而治疗视网膜组织障碍导致的疾病。
[实施例]
[0144] 以下通过参考实施例更详细地说明本发明，所述实施例不被认为是限制性的。
[0145] 实施例1(使用人ES细胞的包含视网膜组织的细胞团聚体的制备实施例）
[0146] 将RAX: :GFP基因敲入人ES细胞（来源于KhES-l;Nakano，I\ 等人Cell Stem Cell 2012,10(6)，771-785)根据"Ueno，M.等人PNAS 2006,103(25) ,9554-9559"和"Watanabe，K. 等人Nat Biotech 2007，25，681-686"中描述的方法培养。作为培养基，使用补充有20%KSR (Knockout Serum? Replacement;Invitrogen)，0.1mM 2-疏基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，lx 非 必需氨基酸和8ng/ml bFGF的DMEM/F12培养基（Sigma)。将上述培养的ES细胞单个分散在 TrypLE Express(Invitrogen)中，并且将单个分散的ES细胞悬浮在100μΙ无血清培养基中 至1 · 2 X 104个细胞/孔（非细胞粘附性96孔培养板，SUMIL0N球形板，SUMITOMO BAKELITE CO .，LTD .)，以允许团聚体的快速形成，将其在37°C，5 %C02进行悬浮培养。然后使用的无血 清培养基是作为添加有10%KSR、450yM 1--硫代甘油、lx化学成分确定的脂质浓缩物、20μ Μ Υ27632的F-12培养基和MDM培养基的1:1混合物的无血清培养基。在自开始悬浮培养起 的第6天以1.5ηΜ的终浓度加入ΒΜΡ4,并且继续悬浮培养。每3天将所述孔中一半量的培养基 换成不含作用于BMP信号转导途径的物质的上述培养基。
[0147] 在自悬浮培养开始起的第18天将这样产生的细胞团聚体用4%多聚甲醛固定以制 备冷冻切片。将制备的冷冻切片进行GFP荧光图像的荧光显微观察（图1A)，用Chxl0(其是一 种神经视网膜先祖细胞标志物）（图1B)免疫染色或DAPI染色用于将细胞核染色（图1C)。从 显示全部视网膜组织细胞的存在的图1A和显示ChxlO阳性细胞的存在的图1B的比较来看， 如上所述制备的细胞团聚体中含有的视网膜组织在约80%的所述组织中含有ChxlO阳性细 胞(参见图1)。
[0148] 比较实施例1(在不含作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的含 血清培养基中培养包含视网膜组织的细胞团聚体）
[0149 ]将通过实施例1中描述的方法制备的在自悬浮培养开始起的第18天的包含视网膜 组织的细胞团聚体在不含作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的含血清 培养基(是补充有10%胎牛血清，1 %N2补充物，0.5μΜ视黄酸，和100μΜ牛磺酸的DMEM/F-12 培养基的培养基）中进行悬浮培养达6天，即至自悬浮培养开始起的第24天（图2Α，Β)，或17 天，即至自悬浮培养开始起的第35天（图2C，D)。
[0150] 将获得的细胞团聚体用4%多聚甲醛固定以制备冷冻切片。将制备的冷冻切片用 ChxlO(其是一种神经视网膜先祖细胞标志物)免疫染色（图2A，C)，或用MITF(其是一种视网 膜色素上皮细胞标志物)免疫染色（图2B，D)。发现，在自悬浮培养开始起的第24天和在自悬 浮培养开始起的第35天，细胞团聚体中含有的约80%的视网膜组织是ChxlO阳性细胞（图 2八，〇，并且其中存在的祖了？阳性细胞的比例不超过3%(图28,0)。
[0151] 实施例2(在含有作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的无血清 培养基中培养包含视网膜组织的细胞团聚体）
[0152] 将通过实施例1中描述的方法制备的在自悬浮培养开始起的第18天的包含视网膜 组织的细胞团聚体在含有作用于Wnt信号途径的物质（3μΜ CHIR99021)和抑制FGF信号途径 的物质（5μΜ SU5402)的无血清培养基（是补充有1%Ν2补充物的DMEM/F-12培养基的培养 基）中进行悬浮培养达6天，即至自悬浮培养开始起的第24天（图3Α，Β)，并且进一步在含有 作用于Wnt信号途径的物质（3μΜ CHIR99021)和没有抑制FGF信号途径的物质的含血清培养 基(是补充有1%胎牛血清和1%Ν2补充物的DMEM/F-12培养基的培养基）中悬浮培养11天， 即至自悬浮培养开始起的第35天（图3C，D)。
[0153 ]将获得的细胞团聚体用4 %多聚甲醛固定以制备冷冻切片。将制备的冷冻切片用 ChxlO(其是一种神经视网膜先祖细胞标志物)免疫染色（图3A，C)，或用MITF(其是一种视网 膜色素上皮细胞标志物)免疫染色（图3B，D)。发现，在自悬浮培养开始起的第24天和在自悬 浮培养开始起的第35天，细胞团聚体中含有的约80 %的视网膜组织是MITF阳性细胞（图3B， D)，并且其中存在的Chx 10阳性细胞的比例不多于3 % (图3A，C)。在自悬浮培养开始起的第 24天的细胞团聚体不显示表达RPE65基因的细胞的出现。
[0154] 图2和图3的比较显示由于在含有作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径 的物质的无血清培养基中的培养操作导致的细胞团聚体中含有的视网膜组织中出现的 ChxlO阳性神经视网膜向MITF阳性视网膜色素上皮(RPE)样组织的命运转变。
[0155] 实施例3(在不含作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中悬浮培养"表达 RPE65基因的细胞不在其中出现的细胞团聚体"-1)
[0156] 在40%02条件下，将通过实施例2中描述的方法制备的在自悬浮培养开始起的第 24天的包含视网膜组织的细胞团聚体在不含作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途 径的物质的含血清培养基(是补充有10 %胎牛血清，1 %N2补充物，0.5μΜ视黄酸和100μΜ牛 磺酸的DMEM/F-12培养基的培养基）中进一步进行悬浮培养达11天，即至自悬浮培养开始起 的第35天，或39天，即至自悬浮培养开始起的第63天，并且将获得的细胞团聚体用4%多聚 甲醛固定以制备冷冻切片。
[0157] 将自在自悬浮培养开始起的第24天的细胞团聚体（图4Α，Β)和在第35天的细胞团 聚体（图4C，D)制备的冷冻切片进行利用ChxlO的免疫染色（图4A，C)和利用MITF的免疫染色 (图4B，D)。发现在自悬浮培养开始起起的第24天的细胞团聚体中含有的视网膜组织具有视 网膜色素上皮样性质，因为在自悬浮培养开始起的第24天，所述细胞团聚体中含有的视网 膜组织的约80 %为MI TF阳性细胞（图4B )，并且其中存在的Chx 10阳性细胞的比例不多于3 % (图4A)。在自悬浮培养开始起的第24天的细胞团聚体不显示表达RPE65基因的细胞的出现。 发现在自悬浮培养开始起的第35天的细胞团聚体中含有的视网膜组织具有ChxlO阳性神经 视网膜的性质，因为在自悬浮培养开始起的第35天，所述细胞团聚体中含有的视网膜组织 的约80%是ChxlO阳性细胞（图4C)，并且其中存在的MITF阳性细胞的比例不多于3% (图 4D)。图3和图4的比较显示在自开始悬浮培养起的第24天和第35天之间在细胞团聚体中含 有的视网膜组织中发生的视网膜色素上皮样组织向神经视网膜样组织的命运转变。
[0158] 将由在自开始悬浮培养起的第6 3天的细胞团聚体制备的冷冻切片（图5 A，B，C)进 行Rax: :GFP荧光免疫染色图像的荧光显微观察（图5A)，利用Otxl(其是一种睫状缘区标志 物）的免疫染色（图5B)，或利用RdhlO(其是一种睫状缘区标志物）的免疫染色（图5C)。图5A、 B的比较表明部分的Rax阳性的神经视网膜是Otxl共阳性的，并且从图5C清楚的是，存在 RdhlO阳性细胞。以上述方式，可以确认，在不含作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基 中悬浮培养39天后的细胞团聚体中，对利用Otxl和RdhlO中的一种或两者的染色都呈阳性 的细胞（即，表达作为睫状缘区样结构的标志物基因的Otxl和RdhlO基因中的一种或两者的 细胞)作为视网膜组织（具体，神经视网膜)和视网膜色素上皮的边界区域中存在的组织中 的接近均匀的群区域存在(参见图5B，C)，并且高效制备了包含睫状缘区样结构的细胞团聚 体。
[0159]实施例4(在不含作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中悬浮培养"表达 RPE65基因的细胞不在其中出现的细胞团聚体"-2)
[0160]在以下三种条件下将包含视网膜组织的细胞团聚体各自进行悬浮培养，并且准备 在自悬浮培养开始起的第35天的细胞团聚体。
[0161] (培养条件A)将通过实施例1中描述的方法制备的在自悬浮培养开始起的第18天 的包含视网膜组织的细胞团聚体在不含作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的 物质的含血清培养基(是补充有10%胎牛血清，1 %N2补充物，0.5μΜ视黄酸，和100μΜ牛磺酸 的DMEM/F-12培养基的培养基)进行悬浮培养达17天，即至自悬浮培养开始起的第35天（图 6Α) 〇
[0162] (培养条件Β)将通过实施例1中描述的方法制备的在自悬浮培养开始起的第18天 的包含视网膜组织的细胞团聚体在含有作用于Wnt信号途径的物质（3μΜ CHIR99021)和抑 制FGF信号途径的物质（5μΜ SU5402)的无血清培养基(是补充有1%Ν2补充物的DMEM/F12培 养基的培养基）中进行悬浮培养达3天，即至自开始悬浮培养的第21天。在自开始悬浮培养 续形成的神经视网膜的细胞团聚体的比例（图6,黑色条形图）以及不含神经视网膜而含有 视网膜色素上皮及其他组织的细胞团聚体的比例（图6,白色条形图）。
[0163] 结果，在本发明的制备方法中，含有由睫状缘区样结构连续形成的神经视网膜的 团聚体团块的比例在培养条件Α下不多于3%，并且在培养条件Β下增加至30%，并且在培养 条件C下增加至39 %。
[0164] 实施例5(在含有作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的无血清 培养基中培养包含视网膜组织的细胞团聚体）
[0165] 将通过实施例1中描述的方法制备的在自悬浮培养开始起的第18天的包含视网膜 组织的细胞团聚体在含有作用于Wnt信号途径的物质（3μΜ CHIR99021)和抑制FGF信号途径 的物质（5μΜ SU5402)的无血清培养基（是补充有1%Ν2补充物的DMEM/F-12培养基的培养 基）中进行悬浮培养达6天，即至自悬浮培养开始起的第24天。
[0166] 将获得的细胞团聚体用4%多聚甲醛固定以制备冷冻切片。将制备的冷冻切片进 行用于细胞核染色的DAPI染色（图7Α)、利用RPE65(其是一种成熟视网膜色素上皮细胞标志 物）的免疫染色（图7B)和利用Mitf (其是一种视网膜色素上皮细胞标志物）的免疫染色。发 现在自悬浮培养开始起的第24天细胞团聚体中含有的视网膜组织中存在的RPE65阳性细胞 的比例不多于1% (图7A，B)。在该情况下，细胞团聚体中含有的视网膜组织的约80%是MITF 阳性细胞。
[0167] 参考实施例1(通过使用诱导的多能干细胞(iPS细胞)的包含视网膜组织的细胞团 聚体的制备实施例）
[0168] 将人iPS细胞系201B7(可从Incorporated Administrative Agency RIKEN BioResource Center或iPS Academia Japan,Inc.获得）根据"Ueno，M.等人PNAS 2006,103 (25)，9554-9559"、"Watanabe，K·等人Nat Biotech2007，25，681-686" 中所述的方法培养。 作为培养基，使用这样的培养基，其是补充有20% KSR( Knockout?血清代替物； Invitrogen)，0.1mM 2-疏基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，lx非必需氨基酸，5ng/ml bFGF的DMEM/ F-12培养基（Sigma)。将上述培养的iPS细胞使用TrypLE Express(Invitrogen)单个分散， 以1.2 X 104个细胞/孔(非细胞粘附性96孔培养板，SUMIL0N球形板，SUMITOMO BAKELITE)悬 浮在100μ1无血清培养基中，并且在37°C，5%C02进行悬浮培养。作为无血清培养基，使用这 样的无血清培养基，其是补充有10%KSR，450yM 1--硫代甘油，lx化学成分确定的脂质浓 缩物，20μΜ Y27632的F-12培养基和頂DM培养基的1:1混合物。在自开始悬浮培养起的第1天 至第15天之间的某个时间点，加入终浓度1.5nM的人重组BMP4(R&D)、终浓度100ng/ml的 BMP2(R&D)、终浓度lOOng/ml的BMP7(R&D)和终浓度lOOng/ml的⑶F7(R&D)中的任一种并进 行悬浮培养。每3天将所述孔中一半量的培养基换成不含作用于BMP信号转导途径的物质的 上述培养基。在自悬浮培养开始起的第18天，部分回收团聚体，用4%多聚甲醛固定以制备 冷冻切片。将制备的冷冻切片进行利用ChxlO(其是一种神经视网膜先祖标志物）的免疫染 色，基于此检查如上所述制备的细胞团聚体中含有的视网膜组织中的ChxlO的表达。
[0169] 可以通过本发明的制备方法通过使用这样制备的"包含视网膜先祖细胞的细胞团 聚体"作为用作起始材料的"包含视网膜组织的细胞团聚体"来制备包含睫状缘区样结构的 细胞团聚体。
[0170] 本申请基于在日本提交的专利申请号2013-255836(申请日：2013年12月11日），所 述申请的内容完整地结合于此。
[0171] 工业实用性
[0172] 根据本发明的制备方法，可以高效制备睫状缘区样结构。
【主权项】
1. 用于制备包含睫状缘区样结构的细胞团聚体的方法，所述方法包括以下步骤:仅在 表达RPE65基因的细胞出现之前的一段时间在各自含有作用于Wnt信号途径的物质和抑制 FGF信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中培养包含视网膜组织的细胞团聚 体，在所述视网膜组织中ChxIO阳性细胞以所述组织的20 %以上和IOO %以下的比例存在， 接着在各自不含作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中培养得到的 "表达RPE65基因的细胞不在其中出现的细胞团聚体"。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其中所述表达RPE65基因的细胞不在其中出现的细 胞团聚体是这样的细胞团聚体，其中ChxlO阳性细胞以所述视网膜组织的30%至0%内的比 例存在于所述组织中。3. 根据权利要求1或2所述的制备方法，其中得到的"表达RPE65基因的细胞不在其中出 现的细胞团聚体"在各自不含作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基 中培养直至存在于所述视网膜组织中的ChxlO阳性细胞的比例达到所述组织的30%以上。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其中所述视网膜组织来源于人多能干 细胞。5. 通过根据权利要求1至4中任一项所述的制备方法制备的包含睫状缘区样结构的细 胞团聚体作为用于评价毒性或药效的试剂的用途。6. 评价测试物质的毒性或药效的方法，所述方法包括将所述物质与通过根据权利要求 1至4中任一项所述的制备方法制备的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体接触，并且测定所 述物质对所述结构或所述团聚体的影响。7. 通过根据权利要求1至4中任一项所述的制备方法制备的包含睫状缘区样结构的细 胞团聚体作为用于移植的生物材料的用途。8. 治疗由视网膜组织的障碍所致的疾病的方法，所述方法包括向需要移植的受试者移 植有效量的通过根据权利要求1至4中任一项所述的制备方法制备的包含睫状缘区样结构 的细胞团聚体。9. 通过根据权利要求1至4中任一项所述的制备方法制备的包含睫状缘区样结构的细 胞团聚体，其用于治疗由睫状缘区样结构的障碍所致的疾病。
【文档编号】A61P43/00GK105960454SQ201480074995
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2014年10月16日
【发明人】桑原笃, 笹井芳树
【申请人】住友化学株式会社, 国立研究开发法人理化学研究所