用于增加酵母生物量的方法
【专利摘要】本发明涉及用于增强酵母培养物的生长和增加酵母培养物的生物量的方法。在对数生长期期间加入乙醇增加酵母生物量和从该生物量纯化的产物的产量。
【专利说明】用于増加酵母生物量的方法
[0001]发明背景
本发明涉及生物技术和酵母生物量领域。酵母生物量具有许多应用。在食品工业中其被视为极好的蛋白质、核酸和维生素源并且可用于制造面包、葡萄酒和啤酒。在非-食品工业中，例如生物燃料工业中，其用于生产乙醇。对于人类和兽医医学其已被开发用于抗生素、有用蛋白和β-葡聚糖的生产。β-葡聚糖是一种生物免疫调节剂，这使其具有引发和激活免疫系统的能力。增加酵母生物量的产量一直是一个挑战，因此正在开发新的方法和程序以增加酵母生物量的产量。
[0002]发明概述
本发明为用于增加酵母生物量的方法，其包括在包含至少一种发酵性碳源和一种非发酵性碳源的生长培养基中培养酵母细胞。
[0003]上述本发明的概述不意在描述每个公开的实施方案或本发明的每一实现。之后的说明书更具体地例示说明性的实施方案。在整个申请中的若干位置，通过实例的列表提供指导，这些实例可以以各种组合使用。在每种情况下，列举的列表均仅用作代表组并且不应解释为排他的列表。
[0004]附图简述
图1显示发酵罐中酿酒酵母的生长曲线。
[0005]图2显示不同培养基浓度时酿酒酵母的生长的图。
[0006]图3显示使用不同的碳源+乙醇时酿酒酵母的生长的图。
[0007]图4Α、4Β和4C显示乙醇-增强的不同酵母菌株的生长的图。
[0008]图5显示使用不同培养基的乙醇-增强的生长曲线的图。
[0009]图6显示酵母生物量中葡聚糖产量的图。
[0010]说明性实施方案的详述
酵母生物量的有效生长需要营养同化、能量产生、生物合成和细胞分裂的协调。一旦营养素耗尽至减少生物合成活动的点，酵母通过降低其生长速率响应。沿着这些线路，增加酵母生物量的限制涉及碳源偏好。碳源例如葡萄糖和蔗糖作为优选的能量源被迅速代谢，并且在利用这些糖之后酵母很快进入稳定期，这限制生物量产量和酵母-衍生的天然产物的量。已将这一生长停滞归因于营养素耗尽和/或氧化应激引起的代谢压力。分批补料方法的使用仅部分上减轻该问题。(Roc*1 Gomez-Pastor, Roberto Ferez-Torrado , ElenaGarre和Emilia Matallana (2011).Recent Advances in Yeast B1mass Product1n,B1mass - Detect1n , Product1n and Usage (酵母生物量生产的最近进展，生物量--检测、生产和使用)，Dr.Darko Matovic (Ed.), ISBN: 978-953-307-492-4，
InTech)
本发明以在对数生长早期期间添加乙醇，一种非发酵性碳源，来解决这一问题。向酵母培养物中添加乙醇促进在一种或多种碳源上生长的任何酵母菌株更好生长。在存在添加的乙醇的情况下，酵母继续生长并且似乎不存在碳源限制的代谢后果。该结果表明当在培养基中同时利用发酵性和非发酵性碳源二者时酵母无压力生长。进行实验表明在乙醇存在下酵母在不明显消耗不可代谢糖的情况下生长。然而，当起子培养物在包含发酵性碳源的培养基中生长并换到包含乙醇作为唯一碳源的培养基时，存在后续的培养物生长。若起子培养物不处于包含发酵性碳源的培养基的条件下，生长不发生。
[0011]—般而言，增加酵母生物量的产量涉及在碳-限制生长条件下向对数早期的酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cere visiae)的指数生长培养物中添加乙醇。表面上，乙醇作为除培养基中存在的发酵性碳源(葡糖糖、蔗糖，等)外的非发酵性碳源被利用。发酵性碳源在整个生长期产生乙醇，增加代谢和细胞压力。对数早期添加乙醇导致利用该非发酵性碳源的合成代谢途径的上调，从而减少来自发酵所产生的产物的压力。因此，酵母细胞变得有能力同时代谢非发酵性和发酵性碳源，导致增加的生物量产生。
[0012]实施例1
用于Cane Molasses Base Media (CMB)制备的方案改编自Demirci A等人，(J AgricFood Chem.1999 Jun; 47(6): 2496-500)。基于下列成分制备I升CMB:
CMF*7.5mL/L
Na2SO41.13g/L
CaCl2.2Η200.14g/L
MgCl2.6Η200.94g/L
KH2PO43.0g/L
D-生物素0.4mg/L
微量元素溶液lmL/L
微量元素溶液如下制备:
MgSO4.7Η203.0g/L
MnSO4-H2O0.5g/L
NaCl1.0g/L
FeSO4-7H200.lg/L
CoSO4-5H200.18g/L
CaCl2-2H200.08g/L
ZnSO4-7H200.lg/L
CuSO4-5H200.0lg/L
Al2(SO4)3-^H2O0.0lg/L
H3BO30.0lg/L
Na2MoO4-2H200.0lg/L
制备后将溶液过滤灭菌。
[0013]*Cane Molasses Feeding培养基(CMF):
Cane Molasses530g/L
尿素21.7g/L
CaCl2-2H200.14g/L
NH4H2PO44.0g/L
MgCl2-6H200.94g/L
KH2PO43g/L 微量元素溶液lmL/L
*尿素& KH2PO4过滤灭菌&加热灭菌后加入培养基
在下列实验中，加入CMB培养基的CMF浓度为原始发表浓度的2-4倍(lx-4x)。
[0014]实施例2
为了在摇瓶中生长，起子培养物在含有50 ml培养基的250 ml烧瓶中建立。该培养物在振荡培养箱中于30°C和170 rpm生长过夜。通过1:5或1:10稀释起子培养物以分别得到0.3或0.150的起始0D600来接种实验培养物。继续在振荡培养箱中于30°C和170 rpm孵育培养物。当培养物的0D600达到0.45-0.8时(其通常为从接种之后约两代)，加入乙醇至2%的浓度。生长培养物并定期获取额外的0D，持续最多120个小时。
[0015]实施例3
对于分批发酵，使用装备有Ai rf I οw充气系统、高效搅拌系统、pH控制和温度控制的Sartorius B1STAT? Aplus台面(bench top)反应器。I L工作体积容器装备有空气、碱、酸和培养基入口。整个实验中维持30°C温度、1.3 Ι/min通气和400 rpm搅拌。取样并分析细胞密度以建立酿酒酵母菌株的生长曲线。培养物的样品在12、24和32小时获取以分析总生物量产量和葡聚糖含量。
[0016]如图1中所示，在补充有2%乙醇的CMB-CMF培养基中于发酵罐中生长的酿酒酵母显示增加的生长速率和延长的生长。具体地，Ix-CMB-CMF + 2%乙醇培养基显示比仅培养基(对照)改善的生长，而2X-CMB-CMF + 2%乙醇培养基提供比对照甚至更好的生长速率和延长的生长。
[0017]优化生长状况和生物量体积的一个方法为通过改变发酵性碳源的浓度。图2显示在2x、3x和4x CMF/CMF-CMB培养基中生长并在培养时间O小时和4小时的任一添加乙醇的酿酒酵母菌株的生物量结果。
[0018]对于许多不同的碳源均显示向生长的酵母培养物中添加乙醇的益处。在图3中，酿酒酵母在包含麦芽糖、乳糖、棉子糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、核糖、木糖、纤维二糖及其组合作为碳源并不含(_)或含有(+ )乙醇的培养基中生长。结果表明使用任何碳源向培养物中添加2%乙醇均增加生物量产生。因此，该益处扩展至培养基中利用的任何碳源。
[0019]向生长培养基中添加乙醇的益处还适用于其它酵母菌株，包括，例如，酿酒酵母、白色念珠菌(Ca/3c/ic/a albicans)幻和/O似从。图4A、4B和4C显示生长期间添加2%乙醇增加多种酵母菌株的生物量产生。在仅CMF-CMB或补充有氨基酸的CMF-CMB培养基中生长专利(proprietary)酿酒酵母菌株、白色念珠菌和酿酒酵母菌株BY4743和W303-1B。专利菌株和白色念珠菌SC5314的培养物生长22小时，酿酒酵母BY4743和W3031B生长144小时。图4A显示22小时时在摇瓶和B1stat发酵罐二者中含有或不含2%乙醇以及IX或2X CMF培养基的专利菌株的生长。其还显示使用摇瓶方法22小时时-/+ 2%乙醇与IX或2X CMF培养基的SC5314的生长。图4B和4C分别代表使用摇瓶方法并从0-144小时测量，-/+ 2%乙醇与IX或2X CMF培养基的酿酒酵母W3031B和BY4743的生长曲线。如从数据显而易见的，乙醇添加显著增强培养物中的酵母生长。
[0020]使用许多类型的生长培养基中的任一种，乙醇-诱导的生物量产量和生长增加同样显而易见。在图5中，酿酒酵母在2%乙醇和2x CMF.lx CMF.lx CMF +酵母提取物、酵母提取物或酵母合成完全培养基中生长。起子培养物在CMF-CMB培养基中生长过夜。将起子接种物加至如图5中所标记的各个培养基中以达到一致的起始0D。培养物在振荡培养箱中于30°(:和170 rpm孵育4-5小时或约2代，然后加入2%乙醇。30°C孵育培养物并在图5中所示的时间点测量OD6qq ο使用的对照为仅IX CMF和仅2%乙醇。
[0021]如图6中所示，在乙醇中生长也增加从生物量获得的β-葡聚糖的产量。增加产量是由增加的生物量以及增加的每克生物量的β-葡聚糖产量所致。起子培养物在CMF-CMB培养基中生长过夜。将起子接种物加至如图6中所标记的各个培养基中以达到一致的起始OD ο培养物在振荡培养箱中于30°C和170 rpm孵育4-5小时或约2代，然后加入2%乙醇。将培养物放回30 °C孵育，120小时时测量0D_并收获培养物。碱提取培养物沉淀的葡聚糖并冻干。测量所提取葡聚糖的干重。使葡聚糖样品经受针对葡聚糖含量的GEM分析。每OD的葡聚糖产量计算为(GEM葡聚糖%*所提取葡聚糖的干重)/(100*120小时时的0D600)。对于标准酿酒酵母菌株，2%乙醇产生最高产量。然而，在其它条件下0.5%-4%之间的乙醇浓度也为有益的。
[0022]总之，包含糖、二糖、寡糖或多糖并补充有乙醇的培养基中的酵母生长增加生长速率、延长生长、增加产生的生物量并增加酵母生长的特定产物的产量。这一增加在多个酵母菌株、种类和生长培养基中观察到。该发现有希望增加依赖生长酵母的工业和研究方法的效率，所述生长酵母包括，但不限于，天然酵母产物、酵母产物食品和通过酵母遗传修饰表达的生物药物。
[0023]本文引用的所有专利、专利申请和出版物以及电子可得材料的完整公开内容通过引用以其整体结合。当本申请的公开内容与通过引用结合至本文中的任何文献的公开内容之间存在任何不一致的情况下，应以本申请的公开内容为准。前面的详述和实施例仅为了清晰的理解而给出。不应从其理解不必要的限制。本发明不限于所显示和描述的精确细节，因为对本领域技术人员显而易见的变更将包含在通过权利要求定义的本发明内。
[0024]除非另外指出，表述在说明书和权利要求中如此使用的组分、分子量等等的量的所有数字应理解为在所有情况下受术语“约”修饰。因此，除非另外指示相反，说明书和权利要求中列出的数字参数为可根据本发明寻求获得的期需性质改变的近似值。至少，并且在不试图限制权利要求范围的等同教义的情况下，每个数字参数应至少根据报道的有效数字的数字并通过应用普通舍入技术解释。
[0025]尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数为近似值，具体实例中列出的数值为尽可能精确地报道的。然而，所有数值固有地包含由其各自的检验测量中存在的标准差所必然产生的范围。
【主权项】
1.用于增加酵母生物量的方法，所述方法包括在包含至少一种发酵性碳源和一种非发酵性碳源的生长培养基中培养酵母细胞。2.权利要求1的方法，其中所述非发酵性碳源为乙醇。3.权利要求1或2的方法，其中所述非发酵性碳源的浓度为约0.5%-4%。4.权利要求1的方法，其中所述发酵性碳源的浓度为约0.5%-4%。5.权利要求1的方法，其中所述非发酵性碳源在滞后期、对数期或指数生长后期期间加入。6.增加经工程改造以代谢天然不被代谢的碳源的酵母菌株的生长速率和生物量的方法，所述方法包括在包含非发酵性碳源的培养基中生长所述酵母菌株。7.权利要求6的方法，其中所述不被代谢的碳源为戊糖类、己糖类、二糖类、三糖类、多糖类之一或其组合。8.权利要求1-8的方法，其中在乙醇存在下于24-37°C的不同温度下生长酵母以最大化期需产物的产量。9.权利要求1-9的方法，其中所述酵母可在乙醇存在下在不同的搅拌和通气程度下生长以最大化期需产物的产量。
【文档编号】C12N1/00GK105960451SQ201480063343
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2014年9月18日
【发明人】P.利普克, U.埃杜帕甘地
【申请人】纽约城市大学研究基金