从利用褐藻多酚分馏物的间充质干细胞制备诱导多能干细胞的方法
【专利摘要】本发明涉及包含从选自由腔昆布、育叶网翼藻、网地藻、铜藻、展枝马尾藻及铁钉菜组成的组中的一种褐藻类提取及分离的多酚分馏物的诱导多能干细胞重编程用培养基组合物。并且，本发明涉及利用上述培养基组合物的诱导多能干细胞制备方法。若利用本发明的培养基组合物，则可通过利用间充质干细胞安全又容易且有效地制备诱导多能干细胞，制备的多能干细胞可分化成多种细胞，因此，可用作细胞治疗剂。
【专利说明】
从利用褐藻多酚分馏物的间充质干细胞制备诱导多能干细胞 的方法
技术领域
[000?]本发明涉及制备包含从褐藻类提取的褐藻多酸(phlorotannin)分馏物的间充质 干细胞的多能干细胞人工培养基组合物和利用其的诱导多能干细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 干细胞（stem cell)作为可被分化成构成生物组织的多种细胞的细胞，是可从胎 儿及成体的各个组织获得的被分化之前步骤的未分化细胞的总称。上述干细胞可通过多种 方法分类。其中，最为普遍的方法中的一种基于分离干细胞的个体，上述干细胞可分为从胚 胎（embry 〇)分离的胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES cell)和从成体分离的成体干 细胞(adult stem cell)。其他普遍的分类基于干细胞的分化能力，上述干细胞可分为多能 (pluripotency)、多分化能(multipotency)及单分化能(unipotency)干细胞。多能干细胞 为具有均可被分化成构成生物体的三种胚层(germ layer)的多功能性的干细胞，通常，多 功能干细胞为胚胎干细胞。
[0003] 成体干细胞可分为多分化能或单分化能干细胞。具有代表性的成体干细胞为间充 质干细胞（MSCs，mesenchymal stem cells)和造血干细胞（HSCs，hematopoietic stem cells)。间充质干细胞分化成软骨细胞(chondroblast)、骨细胞(osteoblast)、脂肪细胞 (adipocyte)、肌肉细胞(myocyte)、神经细胞(neurion)，造血干细胞分化成红细胞、白细 胞、血小板等主要血液内的血细胞。成体干细胞可从骨髓、血液、大脑、皮肤等获得，因此存 在很少的伦理问题，但是，与胚胎细胞相比，成体干细胞具有限定的分化能力 (multipotency)〇
[0004] 相反，多能干细胞均可被分化成构成生物体的三种胚层，由此，多能干细胞是指具 有均可分化成人体的所有细胞或脏器组织的多功能性的干细胞，通常，多功能干细胞为胚 胎细胞。胚胎细胞为具有可被分化成构成一个个体的所有组织的细胞的潜能的多功能干细 胞，但是，在细胞制备过程中，存在胚胎的破坏等严重的伦理问题。
[0005] 为了解决上述问题，进行了用于通过使源自成体的细胞逆分化来制备与胚胎细胞 类似的适当多功能细胞的多种方法。人类胚胎干细胞源自可变为人类生命体的胚胎，因此 存在多种伦理问题，但是，与成体干细胞相比，人类胚胎干细胞具有优秀的细胞增殖及分化 能力。成体干细胞可从骨髓、血液、大脑、皮肤等获得，因此存在很少的伦理问题，但是，与胚 胎干细胞相比，成体干细胞具有限定的分化能力。
[0006] 作为代表性方法，具有细胞融合法（fusion with ES cell)、体细胞核移植法 (somatic cell nuclear transfer)、特定因子注入法（reprog ramming by gene factor) 等。细胞融合法因诱导的细胞还具有两对基因，由此在细胞的稳定性方面存在问题，体细胞 核移植法存在需要大量卵子且效率极低的问题。而且，特定因子注入法是为了通过插入特 定基因来诱导逆分化而利用包含致癌基因的病毒的方法，上述方法存在高的致癌危险，且 因低效率和方法方面上的难度，而在细胞治疗剂开发可能性方面存在问题。
[0007] 为了成功且大量获得多能干细胞，在培养分离的源自脐带的单核细胞的步骤中的 培养组合物极为重要，且需要进行通过高效率的诱导方法，以更多的量制备多能干细胞的 研究。
[0008] 另一方面，在韩国公开专利第2009-0043115号中公开了利用褐藻类的腔昆布治疗 或预防过敏性疾病的组合物，在韩国公开专利第2012-0126148号中公开了氧化染色用染毛 剂组合物。
[0009] 本发明人利用腔昆布提取物成功开发了诱导多能干细胞逆分化用培养基组合物 (韩国公开专利第2015-0050823号）。但是，尚未指出腔昆布提取物中的哪个成分具有诱导 多能干细胞逆分化效果。
[0010]通过上述【背景技术】说明的事项仅是为了进一步理解本发明的背景，上述【背景技术】 相当于本发明所属技术领域的普通技术人员所知道的现有技术。
【发明内容】
[0011] 技术问题
[0012] 本发明人员为了安全性和生产效率高的细胞治疗剂开发的实用化，而寻找以高效 率诱导多能干细胞的方法。结果，在向细胞培养基添加从作为安全的天然物质的褐藻类提 取及分离的一部分化合物的情况下，确认了可利用间充质干细胞安全且高效地制备诱导多 能干细胞，由此完成了本发明。
[0013] 因此，本发明的目的在于，提供用于将包含褐藻多酚分馏物的间充质干细胞 (mesenchymal stem cell)重编程为诱导多能干细胞（ind uced pluripotency stem cell)的培养基组合物。
[0014] 本发明的再一目的在于，提供包括在包含褐藻多酚分馏物的培养基中，将间充质 干细胞重编程为诱导多能干细胞的步骤的诱导多能干细胞的制备方法。本发明的另一目的 在于，提供包含通过上述制备方法制备的诱导多能干细胞的细胞治疗用组合物。本发明的 其他目的及优点通过以下发明的详细说明、发明要求保护范围及附图变得更加明确。
[0015] 解决问题的方案
[0016] 上述问题可通过包含褐藻多酚分馏物并用于将间充质干细胞重编程为诱导多能 干细胞的培养基组合物实现。
[0017]优选地，上述褐藻多酚分馏物可以为由以下化学式1表示的二鹅掌菜酚化合物或 其盐类物质。
[0018] 化学式1
[0020] 优选地，上述褐藻多酚分馏物可从选自由腔昆布(Ecklonia cava)、育叶网翼藻 (Dictyopteris prolifera Okamura)、网地藻（Dictyota dich otoma Lamouroux)、铜藻 (Sargassum horneri C. Agardh)、展枝马尾藻（Sargassum patens C.Agardh)及铁钉菜 (Ishige okamurae Yendo)组成的褐藻类组中的一种褐藻类提取及分离或人工合成。
[0021] 并且，优选地，上述褐藻多酚分馏物可从腔昆布提取或分离。
[0022] 并且，优选地，上述褐藻多酚分馏物包含在选自由达尔伯克改良伊格尔培养基 (DMEM，Dulbeccc/s Modified Eagles Medium)、最小必需培养基(MEM，Minimal Essential Medium)、伊格尔基本培养基(BME，Basal Medium Eagle)、RPMI 1640、？-10小-12、达尔伯克 改良伊格尔培养基-F12(DMEM-F12)、α-最小必需培养基（a-MEM，a-Minimal Essential Medium)、G_ 最小必需培养基（G_MEM，Glasgo w's Minimal Essential Medium)、依斯考夫 改良达尔伯克培养基（IMD M Jscove's Modified Dulbeccc/s Medium) JacCoy's 5A培养 基、新型二代羊水培养基(AminoMaxII complete Medium)及间充质干细胞无血清培养基 (MesenCult-XF Medium)组成的组中的培养基。
[0023]优选地，以培养基组合物为基准，可包含10至500μg/ml的上述褐藻多酚分馏物。 [0024] 并且，优选地，上述培养基组合物可还包含1至ΙΟv/v%的能量水。
[0025] 并且，本发明的问题通过包括向细胞培养基添加褐藻多酚分馏物的步骤；以及在 上述培养基，将间充质干细胞重编程为诱导多能干细胞的步骤的诱导多能干细胞的制备方 法实现。
[0026] 优选地，上述褐藻多酚分馏物可以为由以下化学式1表示的二鹅掌菜酚化合物或 其盐类物质。
[0027] 化学式1
[0029] 并且，优选地，本发明提供包含上述步骤中制备的诱导多能干细胞的细胞治疗用 组合物。
[0030] 发明的效果
[0031] 概述本发明的特征及优点如下。
[0032] (i)本发明利用从褐藻类提取的褐藻多酚分馏物提供诱导多能干细胞逆分化用培 养基组合物。
[0033] (ii)并且，本发明提供利用上述培养基组合物的诱导多能干细胞制备方法。
[0034] (iii)若利用本发明的培养基组合物，则可通过利用间充质干细胞有效制备诱导 多能干细胞，制备的多能干细胞可分化成多种细胞，因此，可用作细胞治疗剂。
【附图说明】
[0035] 图1示出从腔昆布提取物分离分馏物的条件。
[0036] 图2示出由化学式1表示的-2-0-( 2，4，6-三羟基苯基)-6，6 二鹅掌菜酚(2-0-( 2， 4，6_tr ihydroxypheny 1) -6，6 ' _bi 昆布醇）的质谱结果。
[0037]图3示出由化学式1表示的2-0-( 2，4，6-三羟基苯基)-6，6 二鹅掌菜酚的核磁共 振氢谱Gh-nmr)结果。
[0038] 图4示出由化学式1表示的2-0-(2,4,6_三羟基苯基)-6,6'_二鹅掌菜酚的核磁共 振碳谱(13c-nmr)结果。
[0039] 图5示出由化学式2表示的二鹅掌菜酚(Di昆布醇)的质谱结果。
[0040] 图6示出由化学式2表示的二鹅掌菜酚的核磁共振氢谱结果。
[0041] 图7示出由化学式2表示的二鹅掌菜酚的核磁共振碳谱结果。
[0042] 图8示出由化学式3表示的咲喃昆布醇-A(PFF_A，Phlorofucofur oeckol-A)的质 谱结果。
[0043] 图9示出由化学式3表示的呋喃昆布醇-A的核磁共振氢谱结果。
[0044] 图10示出由化学式3表示的呋喃昆布醇-A的碳核磁共振氢谱结果。
[0045]图11示出由化学式4表示的974-A的质谱结果。
[0046]图12示出由化学式4表示的974-A的核磁共振氢谱结果。
[0047]图13示出由化学式4表示的974-A的核磁共振碳谱结果。
[0048]图14示出由化学式4表示的974-B的质谱结果。
[0049] 图15示出由化学式5表示的974-B碳核磁共振氢谱结果。
[0050] 图16示出由化学式5表示的974-B的核磁共振碳谱结果。
[0051]图17示出通过本发明的方法(实验例1-1)处理腔昆布提取物的褐藻多酚分馏物来 形成根据浓度诱导的多能干细胞集落。
[0052]图18利用作为多能干细胞特异性蛋白质的阶段特异性胚胎表面抗原-4(SSEA-4) 和碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)的表达确认通过本发明的方法诱导的细胞(实验例 1_1) 〇
[0053]图19利用作为多能干细胞特异性基因的0CT4和S0X2的表达确认通过本发明的方 法诱导的细胞(实验例1-1)。
[0054] 图20示出通过本发明的方法(实验例1-2)处理褐藻多酚分馏物内化合物来形成根 据浓度诱导的多能干细胞集落。
[0055] 图21利用作为多能干细胞特异性蛋白质的阶段特异性胚胎表面抗原-4和碱性磷 酸酶的表达确认通过本发明的方法诱导的细胞(实验例1-2)。
[0056]图22利用作为多能干细胞特异性基因的0CT4和S0X2的表达确认通过本发明的方 法诱导的细胞(实验例1-2)。
【具体实施方式】
[0057]根据本发明的一实施方式，本发明提供用于将包含从褐藻类提取及分离的褐藻多 酚分馏物的间充质干细胞重编程为诱导多能干细胞的培养基组合物。
[0058]本发明人努力寻找在没有破坏胚胎的伦理问题的情况下，以高效率诱导用于安全 性和生产效率高的细胞治疗剂开发的实用化的多能干细胞的方法。结果，向细胞培养基添 加安全的天然提取物，优选地，从腔昆布提取物分离的褐藻多酚分馏物的情况下，确认了可 高效制备诱导多能干细胞。
[0059] 根据本发明的一实施例，上述褐藻类提取物可以为基于选自褐藻类水提取物、褐 藻类乙醇提取物、褐藻类甲醇提取物或水、乙醇及甲醇中的两种以上的溶剂的混合溶剂的 褐藻类提取物。
[0060] 根据本发明的一实施例，可利用4~100°C的水，提取2~48小时褐藻类来制备褐藻 类水提取物。可利用30~80%的乙醇，在20~60°C下，提取2~36小时褐藻类来制备褐藻类 乙醇提取物。并且，可利用35~80 %的甲醇，在20~60 °C下，提取2~36小时褐藻类来制备上 述褐藻类甲醇提取物。
[0061] 在本发明的培养基组合物中的褐藻类中，腔昆布为主要在南海岸、济州岛海岸等 一代及郁陵岛海岸一代栖息的褐藻植物昆布目昆布科的多年生海藻类，主要为鲍鱼和海螺 等的食物，且为制备褐藻酸或碘化钾的主要原料或用于食用。
[0062] 本发明所包含的腔昆布提取物可利用水、（a)碳数1~4的无水或含水低级乙醇（甲 醇、乙醇、丙醇、丁醇、正丙醇、异丙醇及正丁醇等）、（b)上述低级乙醇和水的混合溶剂、（c) 丙酮、（d)乙酸乙酯、（e)氯仿、（f)l，3_丁二醇、（g)己烷、（h)二乙醚等的有机溶剂来提取，优 选地，可利用甲醇或乙醇和水和混合溶剂来提取。在利用混合溶剂提取腔昆布提取物的情 况下，优选地，甲醇或乙醇的含量为50至80v/v%。但是，并不局限于此。
[0063]从褐藻类提取物分离的褐藻多酚为以间苯三酚(phloroglucinol)为基本结构单 位的多酚类化合物。褐藻多酚在自然界，从海洋植物，尤其从褐藻类发现较多，上述褐藻多 酚具有抗菌效果、抗氧化效果、保肝活性、弹性蛋白酶抑制活性、透明质酸酶 (hyaluronidase)抑制活性、心血管保护效果、抗病毒活性等多种有用的效果。
[0064]在本发明中，尤其，从腔昆布提取物的褐藻多酚分馏物分离及提取由以下化学式1 表示的二鹅掌菜酚化合物、由化学式2表示的二鹅掌菜酚化合物、由化学式3表示的呋喃昆 布醇-A化合物、由化学式4表示的昆布醇类化合物及由化学式5表示的昆布醇类化合物，并 确认了上述化合物的诱导多能干细胞表达能。在上述化合物中，在向细胞培养基添加由化 学式1表示的二鹅掌菜酚化合物的情况下，确认了可高效制备人功能多能干细胞。
[0065] 化学式1
[0067] 化学式2
[0075] 更加具体地，上述化学式1为2-0- (2，4，6-三羟基苯基)-6，6 二鹅掌菜酚，化学式 2为二鹳掌菜酸，化学式3为咲喃昆布醇-A，化学式4由974-A表不，化学式5由974-B表不，在 本发明中，可单独或复合提取上述化合物并向细胞培养基添加。
[0076] 本发明所使用的术语"胚胎干细胞"作为从受精后繁殖初期的胚泡(blastocyst) 的内细胞团（inner cell mass)分离并培养的细胞，是指具有多能性的细胞。本发明所使用 的术语"多能干细胞"为具有可分化成构成生物体的三种胚层，即，内胚层(endoderm)、中胚 层(m esoderm)、外胚层(ectoderm)的多能行的干细胞。
[0077] 本发明所使用的术语"分化((11打6^111^31：；[011)"是指在细胞分裂增殖并成长的期 间，结构或功能相互特殊化的现象，即，生物的细胞、组织等为了执行各自所负责的任务而 发生形态或功能变化。
[0078] 本发明所使用的术语"细胞治疗剂"为通过从人分离、培养及特殊操作制备的细胞 及组织，细胞治疗剂作为用于治疗、诊断及预防的医药品，为了使细胞或组织的功能恢复， 在体外增殖或筛选同种或异种细胞，或者用于通过以其他方法改变细胞的生物学特性等一 系列的行为来进行治疗、诊断及预防的医药品。根据细胞的分化程度，细胞治疗剂大体分为 体细胞治疗剂、干细胞治疗剂，尤其，本发明涉及干细胞治疗剂。
[0079] 本发明的间充质干细胞为从源自哺乳动物的胚胎干细胞或成体干细胞分离的细 胞，优选地，间充质干细胞为源自脐带的间充质干细胞，更加优选地，间充质干细胞为源自 人体脐带的间充质干细胞。上述干细胞可从在人体连接胎盘和胎儿的脐带提取。可通过多 种方式从脐带提取间充质干细胞，例如，从人体提取脐带并通过杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水 (DPBS)冲洗脐带至不再出血，且以手术用刀片铰碎洗完的脐带，在37°C下，进行孵化 (incubation)，从而可获得包含单核细胞的溶液。
[0080] 本发明所使用的术语"培养基"是指在包含糖、氨基酸和各种营养物、血清、生长因 子、无机物等的细胞的成长及增殖等所需要的要素的体外（in vitro)，用于干细胞等的细 胞的培养或分化的混合物。
[0081] 在本发明所属技术领域中销售多种培养基，也可人工制备培养基来使用。正在销 售的培养基具有达尔伯克改良伊格尔培养基、最小必需培养基、伊格尔基本培养基、RPMI 1640、？-10、？-12、达尔伯克改良伊格尔培养基?-12、€(-最小必需培养基、6-最小必需培养 基、依斯考夫改良达尔伯克培养基、羊水培养基、新型二代羊水培养基(Gibc〇，Newy〇rk， USA)、间充质干细胞无血清培养基等，能够与可人工制备的培养基一同使用包含在本发明 的培养基组合物中的基本培养基。
[0082] 可向上述基本培养基添加通常添加的血清成分（例如，胎牛血清（FBS，Fetal Bovine Serum))及抗生剂(例如，青霉素、链霉素)等。向上述基本培养基添加的血清成分或 抗生剂成分的浓度可在实现本发明的效果的范围内改变，优选地，可添加10%的胎牛血清， 100uni t/ml的青霉素，50μg/ml的链霉素等。
[0083]另一方面，向上述达尔伯克改良伊格尔培养基添加的化合物的浓度可在实现本发 明的效果的范围内改变。
[0084] 并且，本发明的培养基还可包含营养混合物(Nutrient Mixture)。上述营养混合 物为包含通常用于细胞培养的各种氨基酸、维生素、无机盐等的混合物，混合上述氨基酸、 维生素、无机盐等来制备营养混合物，或者可使用商业性制备的营养混合物。商业性制备的 营养混合物可举M199、MCDB110、MCDB202、MCDB302等，但并不局限于此。
[0085] 并且，本发明的培养基为了多能干细胞的诱导和稳定化而可可还包含能量水。优 选地，还包含0.05至20v/v%的上述能量水，更加优选地，还包含0.1至10v/v%的能量水。
[0086] 本发明的培养基组合物为对多能干细胞诱导特异性培养基，可通过向上述基本培 养基添加从褐藻类提取物分离的褐藻多酚分馏物来形成培养基混合物，优选地，以整体培 养基组合物为基准，能够以1至l〇〇〇μg/ml浓度，更加优选地，以10至500μg/ml浓度包含从腔 昆布提取物分离的褐藻多酚分馏物。
[0087] 而且，以整体培养基组合物为基准，能够以10至200μg/ml浓度，更加优选地，以20 至150μg/ml使用选自由以上述化学式1表示的2-0-(2，4，6-三羟基苯基)-6，6 ' -二鹅掌菜酚 (2-〇-(2,4,6_三羟基苯基)_6,6'_二鹳掌菜酸），由化学式2表不的二鹳掌菜酸，由化学式3 表不的咲喃昆布醇-A，由化学式4表不的974-A及由化学式5表不的974-B组成的组中的一种 以上。
[0088]根据本发明的再一实施方式，本发明提供诱导多能干细胞的制备方法，诱导多能 干细胞的制备方法包括：向细胞培养基添加从腔昆布提取物分离的褐藻多酚分馏物的步 骤;以及在上述培养基，将间充质干细胞重编程为诱导多能干细胞的步骤。
[0089]此时，可将源自脐带的单核细胞放入具有2-0-( 2，4，6-三羟基苯基)-6，6 二鹅掌 菜酚基本培养基组合物或具有包含2-0-(2,4,6_三羟基苯基)-6,6'_二鹅掌菜酚的混合物 的基本培养基组合物，并在湿度为95 %、37°C、5 %的C02条件的培养基进行培养。
[0090] 在本发明的一实施例中，在上述条件的培养基培养之后，在5日之后，去除浮上的 细胞，每3~4日更换培养基来进行培养。当利用包含2-0-( 2，4，6-三羟基苯基)-6，6 二鹅 掌菜酚的培养基组合物培养干细胞时，观察基于2-0-( 2，4，6-三羟基苯基)-6，6 二鹅掌菜 酚的浓度的多能干细胞诱导。以达尔伯克改良伊格尔培养基/F-12培养基作为对照组，并将 包含2-0-( 2，4，6-三羟基苯基)-6，6 二鹅掌菜酚的达尔伯克改良伊格尔培养基/F-12培养 基作为实验组，并按浓度进行处理，由此培养源自人体脐带的间充质干细胞。
[0091] 结果，当利用本发明的培养基组合物进行培养基时，可确认如多能干细胞的集落 的形成。源自人体脐带的间充质干细胞在本发明的培养基中的第10至14日时，形成了干细 胞集落。即，可确认本发明的培养基组合物在源自人体脐带的间充质干细胞中形成多能干 细胞集落(图17至图19)。
[0092]根据本发明的另一实施方式，本发明提供通过上述制备方法制备的诱导多能干细 胞。
[0093]本发明的诱导多能干细胞具有与胚胎干细胞相同的分化能，而且，诱导多能干细 胞的细胞模样也几乎与胚胎干细胞相同。根据本发明的一实施例，调查在在胚胎干细胞中 是否存在特异性基因（似11吨、0(^4、5(?2、1(1〇及蛋白质（阶段特异性胚胎表面抗原-4)的表 达的结果，在通过本发明诱导的多能干细胞中，与胚胎干细胞相同，确认了上述基因及蛋白 质的表达(图19)。
[0094]根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含通过上述方法制备的诱导多能干细 胞的细胞治疗用组合物。
[0095] 本发明的诱导多能干细胞具有与胚胎干细胞相同的多能分化能，根据本发明的一 实施例，可确认具有能够分化成外胚层、中胚层及内胚层的多能性。
[0096] 因此，本发明的诱导多能干细胞可用作有效的细胞治疗剂。
[0097] 本发明的组合物可通过任意的给药路径，具体地，可通过腹腔或胸腔给药、皮下给 药、静脉或动脉血管内给药、肌肉内给药、基于注射的局部给药等的方法给药。
[0098] 在本发明中，上述组合物可基于通常的方法，以注射剂、悬浮剂、乳化剂等的形式 给药，根据需要，上述组合物悬浮在弗氏完全佐剂等的佐剂，或者与具有如BCG的佐剂活性 的物质一同给药。上述组合物可被灭菌，或者可包含稳定剂、可湿性粉剂或乳化促进剂、用 于调节渗透压的盐或缓冲剂等的佐剂及其他治疗性有效物质，并且，可通过通常的混合、颗 粒化或涂敷方法制备。
[0099] 基于本发明的细胞治疗用组合物可包含药剂学可接受的载体或添加剂，除有效成 分之外，上述细胞治疗用组合物可包括稀释剂(例如，葡萄糖、山梨醇、纤维素、甘氨酸、乳 糖、蔗糖、甘露醇）、结合剂(例如，硅酸镁铝、淀粉糊、黄芪胶、羧甲基纤维素钠）、崩解剂(例 如，淀粉、琼脂、褐藻酸或其的钠盐)或沸腾混合物和/或吸水剂、甜味剂、香味剂及着色剂。
[0100] 本发明的细胞治疗用组合物可适用于关节炎、神经系统疾病、内分泌疾病、肝病 等，之后，根据对于人的临床实验结果，也可用作对于人的同种细胞治疗剂。
[0101]以下，通过实施例，更加详细说明本发明。上述实施例仅用于更加详细说明本发 明，本发明所属技术领域的普通技术人员知道，根据本发明的主旨，本发明的范围并不局限 于上述实施例。
[0102] 实施例1
[0103] 实施例1:褐藻多酚分馏物及化学式1~5化合物的制备
[0104] 实施例1-1:从腔昆布提取物制备褐藻多酚分馏物
[0105] 实验中使用的生药试样从济州岛购买并经过专家的准确鉴定之后用于实验。将 l〇〇g的干燥的生药试样放入11的70%甲醇中回流提取16小时，并利用过滤纸进行了过滤。 在旋转式汽化器中，对滤液进行浓缩，并即时进行冻结干燥来制备腔昆布提取物。
[0106] 在500μ1的甲醇溶解中5g的上述腔昆布提取物之后，将溶液吸附在C4树脂（Sepia tech)，并利用旋转真空蒸发器(Rotary Vacuum Evaporator)，在30°C下，进行减压干燥之 后，为了进行分馏而利用D iaion HP-20来按溶剂进行分馏。给予梯度(Gradient)之后，准 备具有〇 %、25 %、50 %、75 %及100 %的浓度的甲醇溶剂进行分馏。在分成5个小分馏之后， 确认了高效液相色谱图（HPLC prof i 1 e)(参照图1)。在5个小分馏中，选择了高效液相色谱 峰最大的分馏物。
[0107] 实施例1-2:分离、纯化褐藻多酚分馏物
[0108] 在使用C18色谱柱（Phenomenex Luna C18仪器，ΙΟμπι，21 · 2 X 250mm)并在 10ml/min 的流速，243nm的UV中，利用包含0.02 %的三氟乙酸（TFA)的乙腈（acetonitrile)及水 (water)的溶剂，将在实施例1-1中获得的分馏物适用于具有20%的乙腈10分钟、20~55% 的乙腈40分钟、55~100%的乙腈10分钟，即，总共60分钟的溶剂梯度条件的C-18反相高效 液相色谱，来分离了色谱峰C(RT 25min)、色谱峰E(RT 33min)、色谱峰G(RT 37.5min)、色谱 峰H(RT 38min)、色谱峰I(RT 38.5min)，并将从保留时间0分至色谱峰C之间命名为B，将色 谱峰C和色谱峰E之间命名为D，将色谱峰E和色谱峰G之间命名为F，在色谱峰I之后，将分馏 物(fraction)命名为J。
[0109] 使用C18色谱柱（Phenomenex Luna C18仪器，10μηι，21 · 2 X 250mm)，并在4ml/min的 流速，230nm的UV中，使用包含0.02 %的三氟乙酸的乙腈或甲醇及水的溶剂，且分别以等度 (isocratic)条件对各个色谱峰进行纯化。在28%的乙腈等度条件下，分别在色谱峰E(R T 1〇111丨11)、色谱峰6(1^22111丨11)、色谱峰!1(1^23111丨11)、色谱峰1(1^27111丨11)，进行了纯化。
[0110] 但是，对色谱峰C纯化后进行分析结果，确认到色谱峰C包含2个物质，从而利用 26%的甲醇并以等度条件，再次对两种物质C-1(R T 10min)、C-2(RT 13.5min)进行分离。
[0111]实施例1-3:分析多酚类化合物的结构
[0112]使用高效液相色谱-质谱分析仪（High-performance liquid chromat ography mass chromatography)确定了在实施例1-2中纯化的化合物的分子量及分子式，通过核磁 共振谱分析(NMR，nuclear magnetic reso nance)分析核磁共振氢谱、核磁共振碳谱来鉴 定了化合物的结构。
[0113] 结果，鉴定为化学式1为2-0-(2，4,6_三羟基苯基)_6,6'_二鹅掌菜酚，化学式2为 二鹅掌菜酚，化学式3为呋喃昆布醇-A，化学式4为974-A，化学式5为974-B。分离的多酚类化 合物的结构如下述表1，各个化合物的结构特性如下。
[0114] 表1
[0115]
[0116] 化学式 1:2-〇_( 2，4，6-trihydroxypheny 1 )_6，6 ' -bieckol
[0117] 1)分子量:866.65
[0118] 2)分子式：C42H26〇21
[0119] 3)咕匪1?(4001泡，0150)39.28、9.25、9.14、9.09、9.06、9.04、8.95、8.66、8.61、 6.09、 6.07、6.05、5.91(d，J = 2.0Hz，lH)，5.84、5.80』、5.75(d，J = 2.0Hz，lH)。
[0120] 4)13CM1R(100MHz，DMS0)S160.6、160.5、158.9、158.9、154.8、151.5、151.4、 151.2、147.4、146.5、144.6、144.6、141.7、141.6、141.5、141.5、137.4、137.4、125.0、 123.9、 123.0、123.0、122.8、122.3、122.3、99.9、99.8、98.1、98.1、98.0、96.2、96.2、96.1、 95·0、94·3、94·1〇
[0121] 图2示出上述2-0-(2,4,6-三羟基苯基)-6,6'_二鹅掌菜酚的质谱，并且，图3和图4 分别示出上述2-0-(2,4,6_三羟基苯基)-6,6'_二鹅掌菜酚的核磁共振氢谱和核磁共振碳 谱，在各个色谱峰所记载的数字与图3及图4的化学式所记载的数字相对应。
[0122] 化学式 2:Dieckol
[0123] 1)分子量:742.08
[0124] 2)分子式：C36H22〇18
[0125] 3)? NMR(400MHz，Me0D)S6.16(s，lH)、6.14(s，lH)、6.10(s，2H)、6.07(d，J = 2.9Hz，lH)、6.06(d，J = 2.9Hz，lH)、5.99(d，J = 2.8H，lH)、5.96(d，J = 2.8Hz，lH)。
[0126] 4)13C 匪R(125MHz，Me0D)Sl62.70、160.95、160.91、158.63、156.82、155.34、 153.22、 148.17、148.13、147.97、147.75、145.11、144.95、144.22、144.13、139.46、139.29、 127.22、 126.98、126.42、126.37、125.66、125.40、125.34、100.65、100.51、100.25、100.14、 98.44、96.99、96.63、96.55、96.15。
[0127] 图5示出上述二鹅掌菜酚的质谱。并且，图6和图7分别示出上述二鹅掌菜酚的核磁 共振氢谱和核磁共振碳谱，各个色谱峰所记载的数字与图6及图7的化学式所记载的数字相 对应。
[0128]化学式 3 :phlorofucofuroeckol-A
[0129] 1)分子量:602.07
[0130] 2)分子式：C3〇Hi8〇i4
[0131] 3)咕匪1?(4001泡，]\^00)36.63(8，1!1)、6.40(8，1!1)、6.26(8，1!1)，5.96((1，了 = 2.1Hz，2H))、5.955.93(t.like，lH)、5.92(t，J = 2.1Hz，lH)，5.88(d，J = 2.1Hz，2H)。
[0132] 4)13CM!R(125MHz，Me0D)Sl61.87、161.84、160.18、153.15、151.73、151.15、 148.31、148.21、145.97、143.92、138.37、135.29、128.04、124.94、124.64、122.27、105.29、 99.91、99.28、97.69、97.57、96.18、95.35、95.29。
[0133] 图8为上述呋喃昆布醇-A的质谱。并且，图9和图10分别示出上述呋喃昆布醇-A的 核磁共振氢谱和核磁共振碳谱，各个色谱峰所记载的数字与图9及图10的化学式所记载的 数字相对应。
[0134] 化学式4:974-A
[0135] 1)分子量:974.73
[0136] 2)分子式：C48H30〇23
[0137] 3)? NMR(400MHz，Me0D)S6.63(s，lH)、6.40(s，lH)、6.25(s，lH)、6.20(d，J = 2.3Hz，lH)、6.18(d，J = 2.3Hz，lH)、6.12(d，J = 2.3Hz，lH)、6.04(d，J = 2.8Hz，lH)、5.92(s， 2H)、5.925.91(m，lH)、5.90(d，J = 2.3Hz，lH)、5.87(d，J = 2.1Hz，2H)、5.74(d，J = 2.8Hz， 1Η)〇
[0138] 4)3C NMR(125MHz，Me0D)Sl63.16、162·88、161·83、160·16、159·64、159·54、 159.14、159.09、156.55、156.49、156.48、153.85、153.35、152.26、151.92、151.77、151.18、 148.21、147.78、145.82、144.31、138.15、135.16、127.62、124.93、124.90、124.25、124.22、 122·27、119·40、118·15、105·22、105·21、102·62、102·44、99·91、99·24、98·61、98·32、 97.68、97.57、96.34、96.11、95.28、95.20、94.37、94.18。
[0139] 图11示出上述974-Α的质谱。并且，图12和图13分别示出上述974-Α的核磁共振氢 谱和核磁共振碳谱，各个色谱峰所记载的数字与图12及图13的化学式所记载的数字相对 应。
[0140] 化学式 5:974-Β
[0141] 1)分子量:947.73
[0142] 2)分子式：C48H30〇23
[0143] 3)? 匪R(400MHz，Me0D)S6.69(s，lH)、6.38(s，lH)、6.21(d，J = 2.3Hz，lH)、6.19 (d，J = 2.3Hz，lH))、6.17(s，lH)、6.14(d，J = 2.3Hz、lH)、6.05(d，J = 2.8Hz，lH)、6.00(s， 2H)、5.91(t，J = 2.1Hz，lH)、5.89(d，J = 2.3Hz，lH)、5.87(d，J = 2.1Hz，2H)、5.76(d，J = 2·8Ηζ，1Η)〇
[0144] 4)13CM!R(125MHz，Me0D)Sl61.85、160.16、159.64、159.53、159.19、158.97、 157.45、156.81、156.63、156.47、153.79、152.65、152.22、151.95、151.66、150.89、148.32、 147.03、143.86、142.83、138.07、137.95、127.35、125.23、124.65、124.01、123.93、122.11、 109.85、106.33、102.68、102.49、99.62、99.47、98.61、98.32、97.61、97.56、96.45、95.28、 95·13、94·23、92·83〇
[0145] 图14示出上述974-Β的质谱。并且，图15和图16分别示出上述974-Β的核磁共振氢 谱和核磁共振碳谱，各个色谱峰所记载的数字与图15及图16的化学式所记载的数字相对 应。
[0146] 实施例2:从人体脐带分离间充质干细胞及培养
[0147] 实施例2-1:提取人体脐带
[0148]在分娩之后直接收集脐带组织。向实验室移动试样之前，首先，将试样清洗之后， 直接向具有添加移送用培养基(50IU/ml的青霉素、50μg/ml链霉素(从Invitrogen购买））的 F-12培养基的500ml的灭菌玻璃瓶移动。在实验室，在灭菌状态下，在classlOO的流罩中提 取干细胞。首先，向灭菌不锈钢容器移动试样。利用磷酸缓冲盐溶液(PBS)数次清洗之后，脐 带组织试样被截断成2cm长度并向直径为10cm的细胞培养皿移动，其中，进行追加的清洗及 通过70 %的乙醇进行抗感染处理，通过添加抗生剂混合物(50IU/ml的青霉素、50μg/ml的链 霉素(从Invitrogen购买））的磷酸缓冲盐溶液清洗数次上述容易，直到上述溶液变干净。
[0149] 实施例2-2:从人体脐带分离干细胞及培养
[0150] 为了从脐带的血管及其他内部要素分离脐带胶质（脐带的基质），首先，切开脐带 组织。在去除血管之后，为了提取细胞，分离的脐带胶质被切成小块(0.5cmX0.5cm)。通过 向具有适合于上皮干细胞或间充质干细胞的提取的细胞培养条件的各个其他组织培养皿 放入脐带胶质的碎块来执行移植(explant)。
[0151] 为了进行间充质细胞的分离/培养，将上述移植的组织浸渍于添加1%的胎牛血清 085，取(：1〇116)的51111的达尔伯克改良伊格尔培养基？-12(6丨1^〇)、1〇%的胎牛血清、 100unit/ml的青霉素、50μg/ml的链霉素，由此在二氧化碳细胞培养基中以37°C的温度维 持。每3日或4日更换上述培养基。通过光学显微镜监视源自移植的组织的细胞的成长 (outgrowth)。为了追加的扩张及冷冻保管（利用达尔伯克改良伊格尔培养基/10%的胎牛 血清)成长的细胞而对成长的细胞进行了胰蛋白酶处理(〇. 125 %的胰蛋白酶/0.05 %的乙 二胺四乙酸(EDTA))。
[0152] 每3日或4日更换上述培养基。通过光学显微镜监视源自移植的组织的细胞的成长 (outgrowth)〇
[0153] 为了间充质干细胞的提取，细胞的颗粒再次悬浮及计数在达尔伯克改良伊格尔培 养基F-12(Gibco)、10%的胎牛血清、100unit/ml的青霉素、50μg/ml的链霉素，并按1X106细胞/皿的密度接种在l〇cm的组织培养皿。每3日或4日更换上述培养基。通过光学显微镜监 视源自移植的组织的细胞的成长及克隆形成。如上所述，约为90%的细胞数(confluence) 的细胞被亚培养(sub-culture)。
[0154] 实验例1:从间充质干细胞诱导多能干细胞
[0155] 实验例1-1:制备基于褐藻多酚分馏物浓度的源自人体的间充质干细胞的多能干 细胞
[0156] 实施从基于在实施例1-1中制备的褐藻多酚分馏物的浓度的源自人体的脐带干细 胞用于测定多能干细胞诱导能力的实验。在对照组中将达尔伯克改良伊格尔培养基F-12 (Gibco)、10%的胎牛血清、100unit/ml的青霉素、50μg/ml的链霉素作为间充质干细胞的专 用培养基来使用(Normal)，在实验组中使用进行了三次继代培养的源自人体脐带的间充质 干细胞并向培养基添加了 lμg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、ΙΟΟΟμ g/ml浓度的褐藻多酚分馏物和0.1v/v%的能量水(含有Si02、Al203、Ti0 3、Fe203、Ca0、Na20、 K2O、LiO的纯化脱离子水，STCnara)。在6孔板(di sh)接种1 X 104个分离源自人体脐带的间充 质干细胞并清洗的单核细胞，并以维持37 °C和5 %的C02的方式培养了上述单核细胞。
[0157] 对通过本发明的方法诱导的多能干细胞，通过免疫化学染色法，使用对于作为胚 胎干细胞的特异性蛋白质的阶段特异性胚胎表面抗原-4 (SSEA-4，stage-specific embryonic antigen4)、喊性磷酸酶(AP，Alkaline phosphatase)、0CT4、S0X2的抗体来分析 上述蛋白质是否进行了表达。首先，在染色过程中，利用4%的多聚甲醛（Paraformal dehyde)固定细胞之后，利用磷酸缓冲盐溶液进行清洗，并以1 %的牛血清白蛋白（BSA)溶液 进行了密封(blocking)。处理对于0CT4、S 0X2、阶段特异性胚胎表面抗原-4的第一个抗体 并在4°C下，反应18小时之后，利用磷酸缓冲盐溶液进行清洗，且处理对于第一个抗体的附 着有异硫氰酸焚光素(FITC，fluorescein isothiocyanate)的第二个抗体并在室温条件下 反应了的1小时。在利用磷酸缓冲盐溶液进行清洗之后，使用共聚焦显微镜（confocal microscope)分析了是否表达。BF意味着明视场(bright field)。第二张图意味着对于各个 蛋白质表达的染色结果，第三张图表示上述两张图的结合（图19A、图19B、图20A及图20B)。 碱性磷酸酶染色通过细胞透过性碱性磷酸酶荧光基质染料(Dye)实施了染色，在达尔伯克 改良伊格尔培养基F-12培养液中稀释碱性磷酸酶荧光基质染料来处理集落之后，反应20~ 30分钟，并通过达尔伯克改良伊格尔培养基F-12培养液清洗两次，且使用共焦距显微镜来 分析是否表达，其结果如图17所示。
[0158] 结果，在实验组中，仅当褐藻多酚分馏物的浓度为10至500yg/m 1时，才能在10日 之后，观察到形成集落（图17)。作为多能干细胞特异性标记的0CT4、S0X2、阶段特异性胚胎 表面抗原-4、碱性磷酸酶仅在集落中被染色，从而确认为多能干细胞(图18及图19)。
[0159] 实验例1-2:制备基于褐藻多酚分馏物中化合物浓度的源自人体的间充质干细胞 的多能干细胞
[0160] 实施在实施例1-2中分离的化合物中，从基于化合物1的浓度的源自人体脐带的干 细胞用于测定多能干细胞诱导能力的实验。在对照组中将达尔伯克改良伊格尔培养基F-12 (Gibco)、10%的胎牛血清、100unit/ml的青霉素、50μg/ml的链霉素作为间充质干细胞的专 用培养基使用(Normal)，在实验组中使用进行了继代传代培养的源自人体脐带的间充质干 细胞并向培养基添加了 lμg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1000yg/ ml浓度的由化学式1表示的二鹅掌菜酚化合物和O.lv/v%的能量水(含有Si02、Al20 3、Ti03、 ?62〇3、0&0、他20、1(20、1^0的纯化脱离子水，31'0^ &)。在6孔板接种1\104个分离源自人体脐 带的间充质干细胞并清洗的单核细胞，并以维持37 °C和5 %的C02的方式培养了上述单核细 胞。
[0161 ] 对通过上述方法诱导的多能干细胞，通过免疫化学染色法，使用对于作为胚胎干 细胞的特异性蛋白质的阶段特异性胚胎表面抗原-4、碱性磷酸酶、0CT4、S0X2的抗体来分析 上述蛋白质是否进行了表达。首先，在染色过程中，利用4%的多聚甲醛固定细胞之后，利用 磷酸缓冲盐溶液进行清洗，并以1 %的牛血清白蛋白溶液进行了密封。处理对于0CT4、S0X2、 阶段特异性胚胎表面抗原-4的第一个抗体并在4°C下，反应18小时之后，利用磷酸缓冲盐溶 液进行清洗，且处理对于第一个抗体的附着有异硫氰酸荧光素的第二个抗体并在室温条件 下反应了的1小时。在利用磷酸缓冲盐溶液进行清洗之后，使用共聚焦显微镜分析了是否表 达，其结果如图20所示。BF意味着明视场。第二张图意味着对于各个蛋白质表达的染色结 果，第三张图表示上述两张图的结合(图21A、图21B、图22A及22B)。
[0162] 碱性磷酸酶染色通过细胞透过性碱性磷酸酶荧光基质染料实施了染色，在达尔伯 克改良伊格尔培养基F-12培养液中稀释碱性磷酸酶荧光基质染料来处理集落之后，反应20 ~30分钟，并通过达尔伯克改良伊格尔培养基F-12培养液清洗两次，且使用共焦距显微镜 来分析是否表达，其结果如图22B所示。
[0163] 结果，在实验组中，仅当由化学式1表示的二鹅掌菜酚化合物浓度为50μg/ml及100 yg/m时，才能在14日之后，观察集落的形成（图20)。作为多能干细胞特性标记的0CT4、S0X2、 阶段特异性胚胎表面抗原-4、碱性磷酸酶仅在集落中被染色，从而确认为多能干细胞（图21 及图22)。
【主权项】
1. 一种用于将间充质干细胞重编程为诱导多能干细胞的培养基组合物，其特征在于， 包含褐藻多酸分馏物。2. 根据权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于，上述褐藻多酚分馏物为由以下化 学式1表示的二鹅掌菜酚化合物或其盐类物质： 化学式13. 根据权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于，上述褐藻多酚分馏物从选自由腔 昆布、育叶网翼藻、网地藻、铜藻、展枝马尾藻及铁钉菜组成的褐藻类组中的一种褐藻类提 取及分离或人工合成。4. 根据权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于，上述褐藻多酚分馏物包含在选自 由达尔伯克改良伊格尔培养基、最小必需培养基、伊格尔基本培养基、RPMI 1640、F-10、F- 12、达尔伯克改良伊格尔培养基-F12、a-最小必需培养基、G-最小必需培养基、依斯考夫改 良达尔伯克培养基、MacCoy's 5A培养基、新型二代羊水培养基及间充质干细胞无血清培养 基组成的组中的培养基。5. 根据权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于，以培养基组合物为基准，包含10 至500μg/ml的上述褐藻多酸分馏物。6. 根据权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于，上述培养基组合物还包含1至 10v/v%的能量水。7. -种诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，包括： 向细胞培养基添加褐藻多酚分馏物的步骤；以及 在上述培养基，将间充质干细胞重编程为诱导多能干细胞的步骤。8. 根据权利要求7所述的诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，上述褐藻多酚分馏 物为由以下化学式1表示的二鹅掌菜酚化合物或其盐类物质： 化学式19. 根据权利要求7所述的诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，上述褐藻多酚分馏 物从选自由腔昆布、育叶网翼藻、网地藻、铜藻、展枝马尾藻及铁钉菜组成的褐藻类组中的 一种褐藻类提取及分离或人工合成。
【文档编号】C12N5/0775GK105960452SQ201580007099
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2015年5月22日
【发明人】李尚燃, 郑元珠, 金浩彬, 吴珉善, 李桂浩
【申请人】株式会社美合康生