一种土壤dna提取试剂盒及提取土壤dna的方法
【专利摘要】本发明公开了一种土壤DNA提取试剂盒及提取土壤DNA的方法，其中土壤DNA提取试剂盒由以下六种溶液组成：溶液A：为Tris、EDTA、SDS和NaCl的混合溶液，pH值6.4；溶液B：4M的KCl溶液；溶液C：为Tris和GuHCl的混合溶液，pH值6.7；溶液D1：为Tris、EDTA和GuHCl的混合溶液，pH值7.7；溶液D2：为Tris和乙醇的混合溶液，pH值6.7；溶液E：10mM的Tris?HCl缓冲液，pH值8.0?8.5。本发明试剂盒可以简单、快速地从土壤中提取适合现代分子生物学技术操作的高质量DNA，本方法具有简单、快速、经济、质量高等优势。
【专利说明】-种±壤DNA提取试剂盒及提取±壤DNA的方法 -、技术领域
[0001] 本发明设及一种上壤DM提取试剂盒及提取±壤DNA的方法。 二、【背景技术】
[0002] 现代分子生物学技术如宏基因组测序技术、限制性片段多态性(RFLP)技术、聚合 酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术等，为进一步认识和利用微生物为人类服 务提供了重要手段。但是DNA提取与纯化是应用运些技术的第一步，也是关键步骤。
[0003] 目前±壤DNA提取方法主要包括原位裂解和裂解前的细胞提取。由于±壤本身的 复杂性、非均质性，±壤中腐殖酸、黏±矿物W及其它离子等都会不同程度地影响±壤DNA 的提取和纯度。因而，W上两种提取方法常常设及繁多的有毒有害化学试剂或有机溶剂(如 苯酪、氯仿等)和冗繁的操作步骤，大大限制了样品的制备效率和质量。 Ξ、
【发明内容】
[0004] 本发明旨在提供一种±壤DNA提取试剂盒及提取±壤DNA的方法，本发明试剂盒可 W简单、快速地从上壤中提取适合现代分子生物学技术操作的高质量DNA，本方法具有简 单、快速、经济、质量高等优势。
[0005] 本发明±壤DNA提取试剂盒，由W下六种溶液组成：
[0006] 溶液A:为化i S、邸TA、SDS和化C1的混合溶液，混合溶液中Tr i S的浓度为50mM，EDTA 的浓度为1〇〇11^，505的质量浓度为2%，船(：1的浓度为2〇11^，用盐酸调溶液4的抑值为6.4;
[0007] 溶液B:4M的KC1溶液；
[000引溶液C:为化i S和加 HC1的混合溶液，混合溶液中化i S的浓度为1 OmM，G地C1的浓度 为6M，用盐酸调溶液C的抑值为6.7;
[0009] 溶液D1:为Tr i S、邸TA和GuHCl的混合溶液，混合溶液中Tr i S的浓度为50mM，抓TA的 浓度为lOmM，加肥1的浓度为3M，用盐酸调溶液D1的抑值为7.7;
[0010] 溶液D2:为化is和乙醇的混合溶液，混合溶液中化is的浓度为lOmM，乙醇的浓度为 70vt %，用盐酸调溶液D2的抑值为6.7;
[0011] 溶液E: lOmM的Tris-肥 1 缓冲液，pH值8.0-8.5。
[0012] 上述六种溶液的功效为：
[0013] 溶液A有效裂解细胞并且除去腐殖质、黏±矿物质等杂质；
[0014] 溶液B有效去除蛋白质、SDS等杂质；
[0015] 溶液C使DNA高效结合到DNA结合柱上；
[0016] 溶液D1和D2有效去除残余的盐类物质，如脈盐等；
[0017] 溶液E将结合在DNA结合柱上的DNA有效洗脱下来。
[001引本发明提取±壤DNA的方法，包括如下步骤：
[0019] 1、称取新鲜±壤0.25旨于6?管中，加入70化1^容液4，在縱满振荡器上振荡5111111;65 °C恒溫水浴15min，每5min摇匀一次；
[0020] 2、将EP管从水浴锅中取出，冷却至室溫，向收集管中加入70化溶液B，混合均匀后 在65°C下水浴Imin，混合均匀，W1200化pm的转速离屯、2min，留取上清液；
[0021] 3、将步骤2获得的上清液转移到新的EP管中，随后加入所述上清液1/2体积的溶液 C，混合均匀，W1200化pm的转速离屯、2min，留取上清液；
[0022] 4、将步骤3获得的上清液转入DNA吸附柱中，吸附柱置于收集管内，静置3min，随后 W1200化pm的转速离屯、2min，移除离屯、液并保留DNA吸附柱；
[0023] 5、将步骤4获得的DNA吸附柱重新放入收集管中，向DNA吸附柱中加入500化溶液 D1，W12000巧m的转速离屯、2min，移除离屯、液并保留DNA吸附柱；
[0024] 6、将步骤5获得的DNA吸附柱放入收集管中，向DNA吸附柱中加入70化L溶液D2, W 1200化pm的转速离屯、2min;将收集管中的离屯、液移除并保留DNA吸附柱，15000巧m转速下空 管离屯、2min;
[0025] 7、将步骤6获得的DM吸附柱于室溫至50°C下静置直至酒精全部挥发；
[0026] 8、将步骤7获得的DNA吸附柱放入新的EP管内，向DNA吸附柱中加入60-100化溶液 E，静置2min，15000巧m转速下离屯、2min，重复离屯、一次，离屯、液即为±壤0臟溶液。
[0027] 本发明试剂盒由不含有害有机溶剂的6种溶液组成。使用该试剂盒可W简单、快 速、经济地从±壤中提取适合现代分子生物学技术操作的高质量DNA，如PCR、酶切、巧光定 量PCR等。 四、
【附图说明】
[002引图1是用本试剂盒提取的±壤0歴电泳图。其中1 :样品1 ; 2 :样品2 ; Marker : Marker2000。从图1中可W看出，用本试剂盒提取的±壤0魁较明亮，无蛋白质，RNA等杂带， 表明该±壤DNA浓度较高，杂质较少。
[00巧]图2是±壤0麻165-诚麻基因 PCR扩增电泳图。其中16S:16s rRNA基因；Marker: Marker 2000; CK:空白对照。从图2中可W看出，用该±壤0魁可W扩增出明亮的，预期大小 的专一目的条带，表明该上壤DNA满足普通PCR扩增要求。
[0030] 图3是±壤0臟BamHI限制性内切酶酶切电泳图。其中未酶切:±壤0臟;酶切1: luL 化11(1111酶切±壤0魁;酶切2:化1化11(1111酶切±壤0魁;111日'1?5。]\&1'1?5' 2000。从图3中可 W看出，±壤DNA经BamHI酶切后，形成弥散条带，说明BamHI等限制性内切酶可W有效切断 ±壤DNA分子，同时表明该±壤DNA满足限制性内切酶酶切要求。
[0031] 图4是±壤0魁巧光定量PCR(qPCR)溶解曲线图。其中1、2、3、4分别表示原±壤0魁 的稀释倍数分别为10l、103、105、107。从图4中可W看出，该溶解曲线形成单一峰，峰值随DNA 浓度降低而降低，表明该DNA满足巧光定量PCR的要求。 五、
【具体实施方式】
[0032] 1、本实施例中±壤DNA提取试剂盒，由W下不含有害有机溶剂的六种溶液组成：
[0033] 溶液A:为化i S、邸TA、SDS和化C1的混合溶液，混合溶液中Tr i S的浓度为50mM，EDTA 的浓度为1〇〇11^，505的质量浓度为2%，船(：1的浓度为2〇11^，用盐酸调溶液4的抑值为6.4;
[0034] 溶液B:4M的KC1溶液；
[0035] 溶液C:为化is和加 HC1的混合溶液，混合溶液中化is的浓度为10mM，G地C1的浓度 为6M，用盐酸调溶液C的抑值为6.7;
[0036] 溶液D1:为Tr i S、邸TA和GuHCl的混合溶液，混合溶液中Tr i S的浓度为50mM，抓TA的 浓度为lOmM，加肥1的浓度为3M，用盐酸调溶液D1的抑值为7.7;
[0037] 溶液D2:为Tris和乙醇的混合溶液，混合溶液中化is的浓度为lOmM，乙醇的浓度为 70vt %，用盐酸调溶液D2的抑值为6.7;
[003引溶液E: lOmM的Tris-肥1缓冲液，pH值8.0-8.5。
[0039] 2、本实施例中±壤DNA的提取方法，包括如下步骤：
[0040] (1)称取新鲜上壤0.25g于EP管中，加入70化L溶液A，在縱满振荡器上振荡5min; 65 °C恒溫水浴15min，每5min摇匀一次；
[0041 ] (2)将EP管从水浴锅中取出，冷却至室溫，向收集管中加入70化溶液B，混合均匀后 在65°C下水浴Imin，混合均匀，W1200化pm的转速离屯、2min，留取上清液；
[0042] (3)将步骤(2)获得的上清液转移到新的EP管中，随后加入所述上清液1/2体积的 溶液C，混合均匀，W1200化pm的转速离屯、2min，留取上清液；
[0043] (4)将步骤(3)获得的上清液转入DNA吸附柱中，吸附柱置于收集管内，静置3min， 随后W1200化pm的转速离屯、2min，移除离屯、液并保留DM吸附柱；
[0044] (5)将步骤(4)获得的DNA吸附柱重新放入收集管中，向DNA吸附柱中加入5(Κ)化溶 液D1，W1200化pm的转速离屯、2min，移除离屯、液并保留DNA吸附柱；
[0045] (6)将步骤(5)获得的DNA吸附柱放入收集管中，向DNA吸附柱中加入7(Κ)化溶液D2， W 120(K)rpm的转速离屯、2min;将收集管中的离屯、液移除并保留DNA吸附柱，15000巧m转速下 空管离屯、2min;
[0046] (7)将步骤(6)获得的DM吸附柱于室溫至50°C下静置直至酒精全部挥发；
[0047] (8)将步骤(7)获得的DNA吸附柱放入新的EP管内，向DNA吸附柱中加入60-100化溶 液E，静置2min，15000巧m转速下离屯、2min，重复离屯、一次，离屯、液即为±壤0臟溶液。
[0048] 本试剂盒的提取方法与现有方法的比较如下：
[0049] 表 1
[(K)加 ]
[0051 ] 从表1中可W看出，在时间上，本试剂盒提取±壤DNA的整个过程约需50min，比传 统方法提取±壤〇魁节省将近2Λ时间，比进口试剂盒(PowerSoil DNA Isolation Kit)时 间稍长，但在成本上，本试剂盒提取单个样本的成本远低于进口试剂盒。在质量上，本试剂 盒提取的±壤DNA在纯度上与进口试剂盒相当，明显高于传统方法提取的±壤DNA。
【主权项】
1. 一种土壤DNA提取试剂盒，其特征在于：由以下六种溶液组成： 溶液A:为Tr i s、EDTA、SDS和NaCl的混合溶液，混合溶液中Tr i s的浓度为50mM，EDTA的浓 度为10〇11^，505的质量浓度为2%，他(：1的浓度为2〇11^，用盐酸调溶液4的?!1值为6.4; 溶液B:4M的KC1溶液； 溶液C:为Tr i s和GuHCl的混合溶液，混合溶液中Tr i s的浓度为10mM，GuHCl的浓度为6M， 用盐酸调溶液C的pH值为6.7; 溶液D1:为Tr i s、EDTA和GuHCl的混合溶液，混合溶液中Tr i s的浓度为50mM，EDTA的浓度 为10mM，GuHCl的浓度为3M，用盐酸调溶液D1的pH值为7.7; 溶液D 2 :为T r i s和乙醇的混合溶液，混合溶液中T r i s的浓度为10 m Μ，乙醇的浓度为 70vt %，用盐酸调溶液D2的pH值为6.7; 溶液E: 10mM 的 Tr i s-HCl 缓冲液，pH值 8 · 0-8 · 5。2. -种通过权利要求1所述的土壤DNA提取试剂盒提取土壤DNA的方法，其特征在于包 括如下步骤： (1) 称取新鲜土壤〇.25g于EP管中，加入700yL溶液A，在漩涡振荡器上振荡5min;65°C恒 温水浴15min，每5min摇匀一次； (2) 将EP管从水浴锅中取出，冷却至室温，向收集管中加入70yL溶液B，混合均匀后在65 °C下水浴lmin，混合均匀，以12000rpm的转速离心2min，留取上清液； (3) 将步骤(2)获得的上清液转移到新的EP管中，随后加入所述上清液1 /2体积的溶液 C，混合均匀，以12000rpm的转速离心2min，留取上清液； (4) 将步骤(3)获得的上清液转入DNA吸附柱中，吸附柱置于收集管内，静置3min，随后 以12000rpm的转速离心2min，移除离心液并保留DNA吸附柱； (5) 将步骤(4)获得的DNA吸附柱重新放入收集管中，向DNA吸附柱中加入500yL溶液D1， 以12000rpm的转速离心2min，移除离心液并保留DNA吸附柱； (6) 将步骤（5)获得的DNA吸附柱放入收集管中，向DNA吸附柱中加入700yL溶液D2，以 12000rpm的转速离心2min;将收集管中的离心液移除并保留DNA吸附柱，15000rpm转速下空 管离心2min; (7) 将步骤(6)获得的DNA吸附柱于室温至50°C下静置直至酒精全部挥发； (8) 将步骤(7)获得的DNA吸附柱放入新的EP管内，向DNA吸附柱中加入60-1 OOyL溶液E， 静置2min，15000rpm转速下离心2min，重复离心一次，离心液即为土壤DNA溶液。
【文档编号】C12N15/10GK106011130SQ201610616453
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月29日
【发明人】熊明华, 李文波, 朱继荣, 王光利
【申请人】淮北师范大学