用于治疗肺动脉高血压的材料和方法

用于治疗肺动脉高血压的材料和方法
【专利摘要】本发明涉及微小RNA 96及其前体和模拟物用于抑制血管细胞增殖和/或血管重塑，以及用于治疗相关医学病况，如肺动脉高血压(PAH)的用途。
【专利说明】用于治疗肺动脉高血压的材料和方法 发明领域
[0001 ]本发明涉及微小RNA 96及其前体和模拟物用于抑制血管细胞增殖和/或血管重 塑，以及用于治疗相关医学病况，如肺动脉高血压(PAH)的用途。
[0002] 发明背景
[0003] 肺动脉高血压(PAH)是一种以重度肺动脉重塑和闭塞性肺血管损伤，从而导致右 心室衰竭为特征的破坏性疾病。最近的流行病学研究报告了疾病的发生在女性中较大;根 据疾病分类，女性与男性比率可以大到4:1、
[0004] PAH具有每年影响2-3/百万的不良预后；PAH患者分别具有68%、48%和34%的1 年、3年和5年存活率。依靠目前的疗法不能显著增加存活，并且对新的治疗方法有迫切的需 要。
[0005] 遗传性PAH与BMPR2的基因中的突变有关，所述BMPR2经由smadl/ID途径进行信号 传导 2。5_羟色胺也通过促进PASMC增殖和收缩在PAH的形成中发挥关键作用。这可以藉由其 通过色氨酸羟化酶1 (TPH1)合成34，通过经由5-羟色胺转运蛋白（SERT)进入细胞中和/或通 过活化5HT1B受体 3'6一13。
[0006] 我们已证明了，在仅雌性形成肺性高血压(PH)的PH的三种动物模型（SERT+小鼠1Q、 mtsl过表达小鼠 14和经右芬氟拉明（dexfenf luramine)处理的小鼠15)中，PH的形成可以是 5-羟色胺依赖性的，并且依赖于内源雌激素和/或雌激素代谢15~。这提示了性别、雌激素和 5-羟色胺是PH中的相互作用风险因素。
[0007] 微小RNA(miR)是小的非编码RNA，其经由阻抑翻译（经由抑制翻译或诱导mRNA降 解)而对细胞功能具有实质性影响。微小RNA源自由RNA pol II合成的初级RNA转录物(pri-miRNA)，其长度可以是几千个核苷酸。单一 pri-miRNA转录物可以引起超过一种活性miRNA。
[0008] 在核中，酶III类RNA酶Drosha将pri-miRNA转录物加工成由茎-环或发夹结构组成 的前体miRNA(pre-miRNA)，长度通常为70至100个左右的核苷酸。然后，将pre-miRNA转运到 胞质，在那里它被RNA酶Dicer进一步加工，除去环，并且产生成熟双链miRNA分子，其具有与 完全或部分互补的"过客"链杂交的活性"引导"链(长度通常为15至25个核苷酸）。
[0009] 然后，成熟的双链miRNA被掺入RNA诱导的沉默复合物中，在那里指导链与祀mRNA 中的结合位点杂交。
[0010] 指导链可以不与靶结合位点完全互补。然而，称作"种子"序列的指导链的区域通 常与靶结合位点的相应序列完全互补。种子序列通常是2至8个核苷酸的长度，并且位于指 导链的5 '端处或附近(在5 '端的1或2个核苷酸内）。
[0011] 认为单一未配对的指导链也可以能够被掺入RISC中。还认为阻碍过客链对RISC的 掺入的对过客链(例如对糖、碱基或主链结构）的修饰也可以提高通过双链miRNA进行的靶 物抑制的效率。
[0012] 先前已经显示了某些miR调节影响PAH的基因18-2Q。
[0013] 发明概述
[0014]在其最广泛的形式中，本发明涉及微小RNA 96(miR-96)及其前体、模拟物和激动 剂用于抑制血管细胞增殖和/或血管重塑，以及用于治疗相关医学病况，如PAH的用途。 [0015] 不希望被理论束缚，认为在表达5-HT1B受体的细胞中提高miR-96表达或活性可以 是特别有效的。祀细胞包括血管细胞和与血管系统有关的细胞。
[0016] 本发明提供了用于抑制血管细胞增殖和/或血管重塑的方法，包括对靶细胞递送， 或对受试者施用：
[0017] (a)miR-96、其模拟物、或任一者的前体;或
[0018] (b)编码miR-96、其模拟物、或任一者的前体的核酸。
[0019] 本发明还提供了用于预防或治疗肺性高血压的方法，包括对靶细胞递送，或对受 试者施用：
[0020] (a)miR-96、其模拟物、或任一者的前体;或
[0021 ] (b)编码miR-96、其模拟物、或任一者的前体的核酸。
[0022] 本发明还提供了 miR-96、其模拟物、或任一者的前体，其用于抑制血管细胞增殖 和/或血管重塑的方法中。
[0023] 本发明还提供了 miR-96、其模拟物、或任一者的前体，其用于预防或治疗肺性高血 压，尤其是肺动脉高血压的方法中。
[0024] 本发明还提供了 miR-96、其模拟物、或任一者的前体在制备用于抑制血管细胞增 殖和/或血管重塑的药物中的用途。
[0025] 本发明还提供了 miR-96、其模拟物、或任一者的前体在制备用于预防或治疗肺性 高血压，尤其是肺动脉高血压的药物中的用途。
[0026] 本发明还提供了编码miR-96、其模拟物、或任一者的前体的核酸，其用于抑制血管 细胞增殖和/或血管重塑的方法中。
[0027] 本发明还提供了编码miR-96、其模拟物、或任一者的前体的核酸，其用于预防或治 疗肺性高血压，尤其是肺动脉高血压的方法中。
[0028] 本发明还提供了编码miR-96、其模拟物、或任一者的前体的核酸在制备用于抑制 血管细胞增殖和/或血管重塑的药物中的用途。
[0029] 本发明还提供了编码miR-96、其模拟物、或任一者的前体的核酸在制备用于预防 或治疗肺性高血压，尤其是肺动脉高血压的药物中的用途。
[0030] 在所有方面中，本发明本质上牵涉提高靶细胞中的miR-96活性。
[0031 ] 这可以通过对革E细胞直接递送miR-96，通过递送miR-96模拟物，或者通过递送在 靶细胞内加工成活性miR-96或miR-96模拟物的前体分子而实现。
[0032]或者，它可通过对靶细胞递送编码miR-96、其模拟物、或任一者的前体的核酸，使 得在靶细胞内表达活性miR-96或miR-96模拟物、或任一者的前体而实现。
[0033] 靶细胞通常表达5-HT1B受体。靶细胞可以是血管细胞，如血管平滑肌细胞(VSMC) 或血管内皮细胞。具体地，它可以是肺动脉平滑肌细胞(PASMC)或肺动脉内皮细胞。或者，它 可以是与血管系统有关的细胞。与血管系统有关的细胞是位于血管内，或管壁中的细胞，包 括内皮、平滑肌或外膜。血管系统可以是肺血管系统。血管系统可以是动脉，如肺动脉。因 此，与血管系统有关的细胞包括外膜成纤维细胞和免疫细胞，例如淋巴细胞(尤其是T淋巴 细胞）、单核细胞、巨噬细胞和肥大细胞。
[0034]可以在体外、在体内或离体进行牵涉递送到靶细胞的方法。
[0035] 可以与合适的载体分子，如药学可接受脂质或聚合物结合(例如与所述合适的载 体分子复合或由合适的载体分子包囊)递送miR-96、模拟物或前体。
[0036] 可以以裸核酸递送编码miR-96、模拟物或前体的核酸。或者，它可以与合适的载体 分子，如药学可接受脂质或聚合物结合(例如与所述合适的载体分子复合或由合适的载体 分子包囊)而递送。在任一种情况中，核酸通常是DNA。
[0037] 载体分子可以进一步包含能够结合于靶细胞表面的靶向剂。
[0038] 或者，可以经由病毒载体递送编码miR-96、模拟物或前体的核酸。
[0039] 可以采用任何合适类型的病毒载体，包括腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒 (尤其是慢病毒)和疱疹病毒载体。腺病毒和慢病毒可以是特别优选的，因为它们具有在不 活跃分裂的细胞中实现递送的基因的表达的能力。
[0040] miR-96及其前体
[0041 ]术语"miR-96"在本说明书中用于指由以下序列组成的RNA寡核苷酸：
[0042] UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU〇
[0043] 这是大多数哺乳动物中的成熟miR-96的序列，包括人、大猩猩(gorilla)、黑猩猩 (chimpanzee)、猩猩（orang-utan)、猕猴(macaque)、狨猴(marmoset)、小鼠、大鼠、兔、牛、 猪、马和犬。
[0044] 成熟序列的核苷酸2至7称作"种子"区，其结合祀mRNA，并且具有序列：
[0045] UUGGCA。
[0046] 活性miR-96寡核苷酸(或"指导链"）可以是单链的，或者它可以与第二个RNA寡核 苷酸(称为"过客链"）杂交。指导链和过客链在杂交的复合物中彼此反平行运行，所述杂交 的复合物可以称为"双链miR-96"。指导链在以分离形式存在时可以称为"单链miR-96"。
[0047] 过客链和指导链可以含有许多错配，因此并非一条或两条链中的所有核苷酸与另 一条链中的互补核苷酸杂交。因此，双链miR-96可以含有一个或多个凸起(凸起是仅一条链 中的未配对的核苷酸，或多个连续的未配对的核苷酸)或内部环(两条链中的对向的未配对 的核苷酸）。末端的一个或多个核苷酸也可以是未配对的。
[0048]过客链可以与指导链的种子序列是100%互补的。
[0049] 双链miR-96的一条链或两条链可以包含3'突出端，例如1、2或3个核苷酸的3'突出 端。也就是说，在链的3'端的核苷酸延伸出互补链的最5'的核苷酸(包括未配对的末端核苷 酸），并且因此在互补链中没有相应的核苷酸。例如，两条链都包含1、2或3个核苷酸的3'突 出端。或者，复合物在一个或两个末端可以是平端的。在一些实施方案中，过客链与指导链 是相同的长度，或者长度上相差例如多达5个核苷酸或甚至更多，这取决于两条链之间的错 配程度和任何3'突出端的长度。
[0050] 成熟的天然miR-96过客链具有序列：
[0051 ] 5' -AAUCAUGUGCAGUGCCAAUAUG-3'，并且认为如下与指导链配对：
指导?：
[0052] 过客：
[0053]因此，过客链具有3'未配对的核苷酸和3个核苷酸的3'突出端。指导链具有3个核 苷酸的3'突出端。杂交的复合物具有以指导链中的一个凸起和内部环分开的三个互补性区 域(它们之一包含整个种子序列）。
[0054] miR-96的前体包括pre-mir-96和pri-mir-96，以及其可以被加工为成熟miR-96 (无论单链还是双链)的片段和变体。
[0055] 术语"pre-mir-96"用于指由任何全长哺乳动物pre-mir-96序列组成的RNA寡核苷 酸，或其包含通过环序列与相应的过客序列连接的成熟miR-96指导序列的片段或变体，所 述过客序列与指导序列完全或部分互补，并且其中寡核苷酸能够形成其中指导序列和过客 序列彼此杂交的茎-环结构(或"发夹"）。
[0056] pre-mir-96能够充当双链RNA特异性核糖核酸酶(RNA酶III型酶)Dicer的底物，由 此它被加工为成熟的双链miR-96。
[0057] 全长哺乳动物pre-mir-96序列包含人序列(hsa-pre-mir-96):
[0061 ]在这两种情况中，（指导链的)成熟序列加下划线。
[0062] 与显示的序列相比，pre-mir-96可以拥有成熟序列外部的一个或多个修饰。
[0063] 例如，成熟序列上游(5'）的序列可以与相应的人或鼠序列具有至少50%同一性、 至少55%同一性、至少60%同一性、至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至 少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少92 %同一,性、至少 93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95%同一,性、至少96 %同一,性、至少97 %同一,性、至少 98%同一性、或至少99%同一性。例如，上游序列在与5'人序列最佳比对时可以与其相差1、 2、3或4个核苷酸，或者在与5'鼠序列最佳比对时可以与其相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11 个核苷酸。
[0064] 例如，成熟序列下游(3'）的序列可以与相应的人或鼠序列具有至少50%同一性、 至少55%同一性、至少60%同一性、至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至 少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少92 %同一,性、至少 93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95%同一,性、至少96 %同一,性、至少97 %同一,性、至少 98%同一性、或至少99%同一性。例如，下游序列在与3'人序列最佳比对时可以与其相差多 达5、多达10、多达15或多达20个核苷酸，或者在与3'鼠序列最佳比对时可以与其相差多达 5、多达10、多达15、多达20、多达25或多达30个核苷酸。
[0065] 术语"pri-mir-96"用于指由任何长度的哺乳动物pri-mir-96序列组成的RNA寡核 苷酸，或者其包含pre-mir-96序列并且能够被双链RNA特异性核糖核酸酶(RNA酶III型酶） Drosha加工成pre-mir-96序列的片段或变体。
[0066] 全长哺乳动物pri-mir-96序列包括人序列(hsa-pri-mir-96):
[0070] 再一次，成熟序列加下划线。
[0071] 与显示的序列相比，pri-mir-96可以拥有成熟序列外部或天然pre-mir-96序列外 部的一个或多个修饰。
[0072] 例如，成熟序列上游(5'）的序列可以与相应的人或鼠序列具有至少50%同一性、 至少55%同一性、至少60%同一性、至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至 少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少92 %同一,性、至少 93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95%同一,性、至少96 %同一,性、至少97 %同一,性、至少 98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0073] 例如，pre-mir-96序列上游(5'）的序列可以与相应的人或鼠序列具有至少50%同 一*性、至少55 %同一,性、至少60%同一,性、至少65 %同一,性、至少70%同一,性、至少75 %同一 性、至少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少92%同一 性、至少93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95 %同一,性、至少96 %同一,性、至少97 %同一 性、至少98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0074] 例如，成熟序列下游(3'）的序列可以与相应的人或鼠序列具有至少50%同一性、 至少55%同一性、至少60%同一性、至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至 少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少92 %同一,性、至少 93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95%同一,性、至少96 %同一,性、至少97 %同一,性、至少 98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0075] 例如，天然pre-mir-96序列下游（3'）的序列可以与相应的人或鼠序列具有至少 50 %同一1性、至少55 %同一1性、至少60%同一1性、至少65 %同一1性、至少70 %同一1性、至少 75 %同一,性、至少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少 92 %同一,性、至少93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95 %同一,性、至少96 %同一,性、至少 97 %同一性、至少98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0076] miR-96前体可以是任何合适的长度，只要它可以被加工为成熟的miR-96(无论是 单链还是双链）。因此，前体的长度是至少23个核苷酸，并且长度可以是至少25、至少30、至 少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至 少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少200、至少250、 至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少1000、至少1500或至少2000个核苷酸。
[0077] 或者，前体的长度可以是25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、 100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400、450、500、1000、1500、2000 或 2500个核 苷酸的最大值。
[0078] 应当注意到，术语"寡核苷酸"并不意图暗示任何具体的长度，并且仅仅用于指连 接的核苷酸的任何单一连续链。
[0079] miR-96模拟物及其前体
[0080] miR-96模拟物是与天然存在的miR-96相比具有结构或序列中的一个或多个修饰， 但是保留与由miR-96调节的mRNA中的miR-96结合位点杂交，并且抑制5-HT1B受体表达的能 力的寡核苷酸。由miR-96调节的mRNA包括通过miR-96的结合抑制其翻译或加速其降解的那 些mRNA(如5-HT1B mRNA)。
[0081 ] miR-96结合位点的一个例子是存在于Htrlb mRNA(即编码5HT1B受体的基因）中的 序列 TGTGCTAGTGCCAAA。
[0082] miR-96模拟物寡核苷酸的长度通常是15-25个核苷酸，例如长度为18至25、20至 25，例如20至23、例如20、21、22或23个核苷酸。
[0083]与miR-96相比，miR-96模拟物可以在碱基序列、核苷酸结构、和/或主链连接上有 所不同。
[0084] miR-96模拟物通常包含与天然种子序列相同的种子序列:UUGGCA。
[0085] miR-96模拟物可以包含具有成熟天然序列的寡核苷酸或者由具有成熟天然序列 的寡核苷酸组成：
[0086] UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU [0087](其中种子序列加下划线）。
[0088] miR-96模拟物可以与种子序列外部的成熟天然序列不同。例如，它可以在1、2、3、 4、5、6、7、8、9或10个位置(它们都必须位于种子序列外部)处与成熟的天然序列不同。
[0089] miR-96模拟物可以与第二寡核苷酸杂交。与天然的miR-96-样，活性寡核苷酸可 以称为"指导链"，并且结合的寡核苷酸称为"过客链"。杂交的复合物可以称为双链miR-96 模拟物。
[0090]模拟物过客链的序列可以与天然过客链的序列相同或者可以在一个或多个位置 处与天然过客链不同。例如，模拟物过客链的序列可以在不超过10个位置、不超过9个位置、 不超过8个位置、不超过7个位置、不超过6个位置、不超过5个位置、不超过4个位置、不超过3 个位置、不超过2个位置或不超过1个位置处与天然过客链的序列不同。优选地，过客链与指 导链的种子序列是100%互补的，并且模拟物序列和天然序列之间的任何序列差异在与种 子序列互补的区域外部发生。
[0091 ]双链miR-96模拟物的一条或两条链可以含有3 '突出端，例如1、2或3个核苷酸的3 ' 突出端。例如，两条链都可以包含3个核苷酸的3'突出端。或者，复合物可以在一个或两个末 端是平端的。过客链和指导链可以含有一个或多个错配。在一些实施方案中，过客链与指导 链是相同长度，或者在长度上相差多达5个核苷酸。
[0092] miR-96模拟物的前体是可以通常通过酶Dicer的作用或者通过酶Drosha和Dicer 的序贯作用在靶细胞内被加工成miR-96模拟物的任何分子。
[0093] 因此，前体可以具有模拟物序列上游(5'）和/或下游(3'）的额外寡核苷酸序列。
[0094] 前体可以含有通过环序列与同指导序列完全或部分互补的相应过客序列连接的 miR-96模拟物指导序列，并且其中寡核苷酸能够形成茎-环结构(或"发夹"），其中指导序列 和过客序列彼此杂交。此类寡核苷酸可以被认为pre-mir-96模拟物，并且能够充当用于双 链RNA特异性核糖核酸酶(RNA酶III型酶)Dicer的底物，由此它被加工成包含分开的指导链 和过客链的双链miR-96模拟物。
[0095] 例如，成熟序列上游(5'）的序列可以与相应的人或鼠序列具有至少50%同一性、 至少55%同一性、至少60%同一性、至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至 少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少92 %同一,性、至少 93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95%同一,性、至少96 %同一,性、至少97 %同一,性、至少 98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0096] 例如，成熟序列下游(3'）的序列可以与相应的人或鼠序列具有至少50%同一性、 至少55%同一性、至少60%同一性、至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至 少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少92 %同一,性、至少 93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95%同一,性、至少96 %同一,性、至少97 %同一,性、至少 98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0097]或者，前体可以是pri-mir-96模拟物（即，它具有pre-mir-96模拟物序列上游(5'） 和/或下游(3'）的额外的寡核苷酸序列），并且能够被双链RNA特异性核糖核酸酶(RNA酶III 型酶)Drosha加工成pre-mir-96模拟物序列。
[0098] 例如，成熟miR-96模拟物序列上游(5'）的序列可以与相应的天然的人或鼠序列具 有例如至少50 %同一,性、至少55 %同一,性、至少60 %同一,性、至少65 %同一,性、至少70 %同 一*性、至少75 %同一,性、至少80%同一,性、至少85 %同一,性、至少90%同一,性、至少91 %同一 性、至少92 %同一,性、至少93%同一,性、至少94%同一,性、至少95 %同一,性、至少96%同一 性、至少97 %同一1性、至少98 %同一1性、或至少99 %同一1性。
[0099] 例如，pre-mir-96模拟物序列上游(5'）的序列可以与相应的人或鼠序列具有至少 50 %同一1性、至少55 %同一1性、至少60%同一1性、至少65 %同一1性、至少70 %同一1性、至少 75 %同一,性、至少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少 92 %同一,性、至少93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95 %同一,性、至少96 %同一,性、至少 97 %同一性、至少98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0100] 例如，成熟miR-96模拟物序列下游(3'）的序列可以与相应的人或鼠序列具有至少 50 %同一1性、至少55 %同一1性、至少60%同一1性、至少65 %同一1性、至少70 %同一1性、至少 75 %同一,性、至少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少 92 %同一,性、至少93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95 %同一,性、至少96 %同一,性、至少 97 %同一性、至少98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0101] 例如，pre-mir-96模拟物序列下游(3'）的序列可以与相应的人或鼠序列具有至少 50 %同一1性、至少55 %同一1性、至少60%同一1性、至少65 %同一1性、至少70 %同一1性、至少 75 %同一,性、至少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少 92 %同一,性、至少93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95 %同一,性、至少96 %同一,性、至少 97 %同一性、至少98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0102] miR-96模拟物前体可以是任何合适的长度，只要它可以被加工为成熟的miR-96模 拟物(无论是单链还是双链）。因此，前体的长度是至少23个核苷酸，并且长度可以是至少 25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少 80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少 200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少1000、至少1500或至少 2000个核苷酸。
[0103]或者，前体的长度可以是25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、 100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400、450、500、1000、1500、2000 或 2500个核 苷酸的最大值。
[0104] 结构修饰
[0105] 在上文讨论的序列修饰外，或者作为上文讨论的序列修饰的备选，与RNA寡核苷酸 相比，miR-96模拟物或其前体可以包含一个或多个结构修饰。
[0106] miR-96模拟物或前体可以包含一个或多个包含经修饰的糖残基（即核糖残基之外 的糖残基)的核苷酸。
[0107] 经修饰的糖残基包括碳环糖或无环糖、在其2'、3'或4'位置的一处或多处具有取 代基基团的糖和具有替换糖的一个或多个氢原子的取代基的糖。
[0108]合适的经修饰的糖可以拥有糖取代基基团，其选自：〇H;F;〇-、S-、或N-烷基;0-、 S-、或N-烯基;0-、S-或N-炔基;或0-烷基-0-烷基。烷基、烯基和炔基可以是经取代的或未取 代的C1至C10烷基或C 2至C10烯基和炔基。在一些实施方案中，这些基团可选自：0(CH2) x〇ch3、0 (( ch2 ) x0) yCH3、0 ( ch2 ) xNH2、0 ( ch2 ) xCH3、0 ( ch2 ) x〇nh2、和0 ( ch2 ) x〇n (( ch2 ) xCH3 ) 2，其中 X 和y是1至10。
[0109] 糖取代基基团可以包括&至&〇低级烷基、经取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、 芳烷基、0-烷芳基或 0-芳烷基、SH、SCH3、Cl、Br、CN、OCN、CF3、0CF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、N〇2、 N 3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基和经取代的甲硅烷基。
[0110] 其它取代基基团包括2'-甲氧基乙氧基和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基、烯丙基(_ CH2 _CH=CH2)、_0_稀丙基(_0_CH2 _CH=CH2)、甲氧基_0_CH3)、氛基丙氧基(-OCH2CH2CH2NH2)、 和氟(F)。
[0111] 2'位置(2'_)上的糖取代基基团可以在阿拉伯糖（上)位置或核糖（下）位置中。一 种2'-阿拉伯糖修饰是2'-F。也可以在寡聚体化合物上的其它位置处，特别是3'端核苷上的 糖的3'位置处或者在2'-5'连接的寡核苷酸和5'端核苷酸的5'位置中做出其它类似的修 饰。
[0112]经修饰的糖残基的例子包括2'-0_甲基核糖、2'-0_甲氧基乙基核糖、2'-氟-核糖 和4-硫代-核糖。
[0113]也可以使用二环糖，并且它通常包含具有将环约束成C3'内向构型的2'，4'桥(例 如亚甲基桥)的呋喃糖基环。含有二环糖的核苷酸经常称为锁核酸（"LNA"）残基。
[0114] miR-96模拟物或前体可以独立含有任何或所有这些类型的经修饰的糖残基的一 种或多种。
[0115] 另外/或者，miR-96模拟物或前体可以包含一个或多个主链修饰，例如经修饰的核 苷间连接。
[0116] 因此，可以经由备选的连接模块替换磷酸酯模块连接一个或多个相邻的核苷酸。
[0117] 可以特别期望经修饰的核苷间连接存在于miR-96模拟物的一个或两个末端，即在 5 '端核苷酸和相邻的核苷酸之间，和/或在3 '端核苷酸和相邻的核苷酸之间。
[0118] 适合于用作核苷间连接的模块包括硫代磷酸酯、吗啉代和膦酰羧酸酯 (phosphonocarboxylate )模块，以及硅氧烷、硫化物、亚砜、砜、乙酰基、甲酰乙酰基 (formacetyl )、硫代甲酰乙酰基（thioformacetyl )、亚甲基甲酰乙酰基（methylene formacety 1)、硫代甲酰乙酰基、烯基、氨基磺酸酯（sulphamate )、亚甲基亚胺基 (11161：11716116；[111；[110)、亚甲基餅基（11161：11716116117(^&2；[110)、横酸酯（811]^11011&七6)和横胺 (sulphonamide)模块。
[0119] 在硫代磷酸酯模块中，非桥接氧原子被硫原子替换。硫代磷酸酯基团可以促进血 清蛋白质结合，并且因此可以改善模拟物的体外分布和生物利用度。这在模拟物要对接受 者系统性施用时可以是期望的。
[0120] 另外/或者，miR-96模拟物或前体可以包含一个或多个经修饰的碱基作为天然存 在的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶的备选。此类经修饰的碱基包括5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷 基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和 2_硫代胞嘧啶（2-thiocytosine)、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶和嘧 啶碱基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶）、4_硫 尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代(包括5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶）、7_甲基鸟嘌呤和7-甲基腺 嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮 腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
[0121] 递送miR-96、模拟物和前体
[0122] 可以提供组合物，其中miR-96、模拟物和前体与合适的载体结合(例如与合适的载 体复合或由合适的载体包囊，或共价附接于合适的载体）。
[0123] 合适的载体包括药学可接受的脂质和聚合物及其组合。例如，组合物可以具有脂 质体、脂囊泡、脂质复合物或聚合物复合物的形式。
[0124] 例如，脂囊泡和脂质体是具有含有寡核苷酸负载(cargo)的水性核心的脂质双层 颗粒。
[0125] 脂质复合物（或"脂复合物（lipoplexes)"）和聚合物复合物（"聚复合物 (polyplexes)"）通常含有带正电荷的脂质或聚合物，其与带负电荷的寡核苷酸相互作用以 形成复合物。
[0126] 阳离子聚合物或脂质也可以与靶细胞表面上的带负电荷的分子相互作用。通过脂 质和端基(head group)的适当选择，可以剪裁(tailor)复合物以促进与祀细胞的质膜或与 选定的内膜(如内体膜或核膜)融合以促进递送寡核苷酸负载到合适的亚细胞区室。通过脂 复合物和聚复合物进行的基因递送例如由Tros de Ilarduya等在Eur.J.Pharm.Sci.40 (2〇10)159_1 7〇 中综述。
[0127] 也可使用中性脂质乳剂与具有纳米级的直径的miRNA形成颗粒复合物。
[0128] 根据应用、负载和靶细胞，技术人员可以选择合适的脂质。可以使用单一脂质或 者，更通常为，脂质的组合。
[0129] 合适的脂质记载于例如W02011/088309及其中引用的参考文献，且包括：
[0130]-中性脂质和磷脂，如鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰 肌醇、磷脂酸（phosphatidic acid)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱（palmitoyloleoy 1 phosphatdylchol ine)、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰 基磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二亚油酰磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱(PC)、1，2_二油酰 基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(D0PC)、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺(PE)、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇 胺、鞘磷脂（sphinogomyelin, SM)、心磷脂、磷脂酸(phosphosphatidic acid)、1，2-二硬脂 酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1-棕榈酰- 2- 油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(P0PC)、1，2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1，2-二豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1，2-二豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、 二棕榈油酰基^^((11。31111；[1:0106071-?￡)、二植烧酰-?￡((11。115^311071-?￡)、03?￡、二反油酰 基-?￡((116131(1071-?￡)、二亚油酰-3]\1、和二亚油酰-?￡;
[0131] -固醇，例如胆固醇，
[0132] -聚合物修饰的脂质，例如聚乙二醇(PEG)修饰的脂质，包括PEG修饰的磷脂酰乙醇 胺和磷脂酸、PEG-神经酰胺缀合物、PEG-修饰的二烷基胺和PEG-修饰的1，2_二酰基氧基丙- 3- 0安（PEG-modif ied 1，2-diacyloxypropan-3_amines)。特别合适的是PEG修饰的二酰甘油 和二烷基甘油，例如PEG-二豆蔻酰甘油（PEG-didimyristoyl glycerol)(PEG-DMG)PEG-二 苯乙烯基甘油(PEG-DSG)和PEG-氨甲酰基-1，2-二豆蔻酰氧基丙胺(PEG-cDMA);
[0133] -阳离子脂质，如N，N-二油酰基-N，N-二甲基氯化铵（"D0DAC"）； N-(2，3-二油酰基 氧基）丙基-N，N-N-三乙基氯化铵（"D0TMA"）；N，N-二硬脂酰-N，N-二甲基溴化铵（"DDAB"）； N-(2，3-二油酰基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化钠（"D0TAP"）； 1，2-二油酰基氧基-3-三甲 基氨基丙烷氯化物盐（"D0TAP.C1"）；3P-(N-(N'，N'_二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇 ("DC-Cho 1"），N-(1 -(2，3-二油酰基氧基)丙基)-N-2-(精胺甲酰胺基）乙基)-N，N-二甲基三 氣乙酸铵（"D0SPA"）、双十八烷基酰氨基甘氨酰駿基精胺（"DOGS"）、1，2-二油酰基-sn_3_磷 酸乙醇胺（"DOPE"）、1，2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷（"D0DAP"）、N，N-二甲基-2，3-二油酰基 氧基）丙胺（"D0DMA"）、N-(1，2_二肉豆蔻基氧基丙-3-基）-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵 ("DMRIE"）、1，2_二亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷（1，2-(111111〇16 71(^7-3-dimethylaminopropane) (DLinDMA) 1，2-二亚油酰基_3_二甲基氨基丙烷（DLinDAP)、1-亚油 酰基-2-亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1，2-二亚油基氨基甲酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、l，2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、和2， 2-二亚油基-4-10二甲基氨基甲基-[1，3]_二氧戊烷(DLin-K-DMA)。阳离子脂质的商业制剂 包括Lipofectin?(其包含D0TMA和DOPE，可获自Gibco/BRL)，和Lipofectamine?(其包含 DOSPA和DOPE，可获自 Gibco/BRL)。
[0134] -阴离子脂质，包括磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺和赖氨酰磷脂酰 甘油（lysylphosphatidylglycerol) 〇
[0135] W0/0071096描述了不同的配制剂，如D0TAP:胆固醇或胆固醇衍生物配制剂，其可 以有效用于寡核苷酸递送。
[0136] 能够对肺实现良好的miRNA递送的商业上可得到的组合物是中性脂质乳剂 MaxSuppressor in vivo RNALancerII(BI00 Scientific,Austin,TX)，其由1，2_二油酰 基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、藍稀油、Polysorbate 20和抗氧化剂组成。在与合成miRNA的复合 中，它形成纳米直径范围中的纳米颗粒。
[0137] 合适的聚合物包括组蛋白和鱼精蛋白（和其它DNA结合蛋白）、聚（乙烯亚胺） (PEI)、阳离子树枝状聚合物，如聚酰胺胺(polyamidoamine) (PAMAM)树枝状聚合物、2-二甲 基(氨基乙基）甲基丙烯酸酯(PDMAEM)、聚(L-赖氨酸）（PLL)、基于碳水化合物的聚合物，如 壳聚糖（。11；[1:08&11)等。关于综述，参见1'1'08(16 11&1(1115^等于￡111'.]\?11&1'111.3。;[.40(2010) 159-17。可以使用蛋白质和肽，如端胶原(atellocollagen)。端胶原是一种由蛋白酶处理产 生的水溶形式的胶原，特别是经胃蛋白酶处理的来自小牛真皮的I型胶原。
[0138] 环糊精也可以用于递送。
[0139] 另外/或者，miR-96模拟物或前体可以包含膜转运模块，以促进运送穿过靶细胞的 质膜。此模块可以是合适的脂质或其它脂肪模块，包括但不限于胆固醇和硬脂酰模块。其它 膜转运模块包括细胞穿透肽（"CPP"，如来自HIV-1的TAT和MPG、穿透蛋白（penetratin)、聚 精氨酸）和融合肽(fusogenic peptide)(例如流感融合肽(diINF-7)或HIV-1包膜(HGP)的 内域衍生物）。可将膜运送模块与载体分子缀合，所述载体分子与miR-96模拟物或前体自身 非共价结合。或者，可以将膜运送模块与miR-96模拟物或前体自身缀合。可以将模块与指导 链或过客链缀合，尽管过客链是优选的，从而不损害指导链功能。在5'或3'端的缀合可以是 优选的，尽管与内部残基的缀合也是可能的。
[0140] 为了避免疑义，当与膜运送模块连接时可以认为miR-96分子(即，非以其它方式具 有与天然分子的任何结构或序列差异)是miR-96模拟物或前体。
[0141] 靶细胞
[0142] 要提高miR-96活性的祀细胞通常是血管细胞，或与血管系统有关的细胞。
[0143] 与血管系统有关的细胞是位于血管内，或者在血管壁，包括内皮、平滑肌或外膜 (adventitia)中的细胞。
[0144] 通常，血管系统是肺血管系统，尤其是肺动脉。
[0145] 因此，血管平滑肌细胞和血管内皮细胞是靶细胞，尤其是肺血管平滑肌细胞和肺 血管内皮细胞，特别是肺动脉平滑肌细胞和肺动脉内皮细胞。
[0146] 尽管可以在高血压条件下，或者在有助于高血压形成的条件下调控，例如提高表 达，但靶细胞通常组成性表达5-HT1B受体。
[0147] 5HT1B受体在许多在免疫应答和炎症中发挥作用的细胞，包括T-淋巴细胞和单个 核细胞(monoclear cells)，如单核细胞和巨噬细胞上表达(22-24)。牵涉T淋巴细胞和炎性 细胞的功能障碍性免疫系统促成PAH发病机制（25,26)。另外，5-羟色胺经由5-111'18受体刺 激成纤维细胞中的DNA合成，并且这与PAH模型中的成纤维细胞的增殖有关(27，28)。
[0148] 因此，表达5-HT1B受体的外膜成纤维细胞和免疫细胞也代表靶细胞，包括T淋巴细 胞、单核细胞、巨噬细胞和肥大细胞。
[0149] 靶向剂
[0150] 载体分子也可携带能够结合靶细胞表面的靶向剂。例如，靶向剂可为特异性结合 配偶体，其能够特异性结合在靶细胞，例如血管平滑肌细胞(例如肺动脉平滑肌细胞）、血管 内皮细胞(例如肺动脉内皮细胞）、外膜成纤维细胞或免疫细胞(例如T淋巴细胞、单核细胞、 巨噬细胞或肥大细胞）的表面上表达的分子。合适的结合配偶体包括针对细胞表面分子的 抗体等，或者对于这些细胞类型上的此类细胞表面分子的配体或受体。细胞表面分子可为 相关细胞类型的特异性标志物。或者，靶向剂可具体为5-HT1B受体自身的结合配偶体。
[0151] 术语"特异性结合对"用于描述包含彼此具有特定的特异性并且在正常条件中优 先于结合其它分子而彼此结合的特异性结合成员（sbm)和其结合配偶体(bp)的分子对。特 异性结合对的例子是抗体及其关联表位/抗原、配体(如激素等)和受体、亲合素/链霉亲合 素和生物素、凝集素和碳水化合物、和互补的核苷酸序列。
[0152] 公知的是，全抗体的片段可以执行结合抗原的功能。功能性结合片段的例子是（i) 由VL、VH、CL和CH1域组成的Fab片段；（ii)由VH和CH1域组成的Fd片段；（iii)由单一抗体的 VL和VH域组成的Fv片段；（iv)由VH域组成的dAb片段(Ward，E ? S ?等，Nature 341，544-546 (1989)); (v)分离的CDR区；（vi)F(ab'）2片段，一种包含两个连接的Fab片段的二价片段， (vii)单链Fv分子(scFv)，其中通过肽接头连接VH域和VL域，所述肽接头容许两个域结合以 形成抗原结合位点（Bird等，Science，242，423-426，1988;Huston等，？嫩3 1^4,85,5879-5883，1988);(￥丨^)双特异性单链?￥二聚体(？(^/1^92/09965)和（11)"双抗体"，通过基因 融合构建的多价或多特异性片段(W094/13804;P. Ho 11 iger等Proc. Nat 1. Acad. Sci . USA 90 6444-6448,1993)〇
[0153] 由于可以以多种方式修饰抗体，因此术语"抗体"应当解释为涵盖具有有需要的特 异性的结合域的任何特异性结合物质。因此，此术语涵盖上文描述的抗体片段，及抗体的衍 生物、功能等同物和同源物，包括包含免疫球蛋白结合域的任何多肽，无论是天然的还是合 成的。因此，包括嵌合分子，该嵌合分子包含与另一种多肽融合的免疫球蛋白结合域或等同 物。嵌合抗体的克隆和表达描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023。
[0154] 抗体的备选是越来越可用的。可为了针对特定靶物的亲和力而常规剪裁所谓的 "亲和性蛋白"或"工程化蛋白质支架"。它们通常基于具有构象上稳定或刚性核心的非免疫 球蛋白支架蛋白，其已经被修饰而对靶物具有亲和力。修饰可包括在支架蛋白的表面替换 一个或多个表面残基，和/或插入一个或多个残基。例如，可将对靶物具有亲和力的肽插入 支架蛋白的表面环中或可替换支架蛋白的部分或整个表面环。合适的支架及其工程化等同 物包括：
[0155] -BPTI、LAC-DI、ITI-D2(Kunitz 域支架）；
[0156] -ETI-IKAGRP(Knottin)；
[0157] -硫氧还蛋白（肽适体）；
[0158] -Fn3(AdNectin)；
[0159] -脂笼蛋白（BBP)(Anticalin);
[0160] -锚蛋白重复(DARPin);
[0161] -蛋白A的Z域(Affibody);
[0162] - 晶体蛋白/泛素(Affilin);
[0163] -LDLR-A-域（Avimer)。
[0164] 参见例如Gebauer，M和Skerra，A，Current Op ? Chem. Biol ? 2009，13 : 245-255及 Friedman,M和Stahl，S，Biotechnol .Appl .Biochem. (2009)53:1-29及其中引用的参考文 献。
[0165] 编码miR-96、模拟物和前体的核酸
[0166] 作为将miR-96寡核苷酸、模拟物和前体直接递送到靶细胞的备选，有可能将编码 miR-96寡核苷酸、其模拟物、或任一者的前体的核酸递送到靶细胞，使得在靶细胞内表达 miR-96寡核苷酸、模拟物或前体。此类方法可视为"基因疗法"。
[0167] 对于技术人员会容易显而易见的是，可以仅使用核酸以编码由RNA构成（即，由RNA 的4种天然存在的核苷酸组分构成，而没有经修饰的碱基、糖或核苷间连接)的miR-96、其模 拟物和前体。
[0168] 核酸通常包含表达构建体，其包含与适当的调节序列可操作连接以促进表达的编 码miR-96寡核苷酸、模拟物或前体的核酸序列。调节序列可以根据靶细胞选择，但是通常会 包含合适的启动子和任选的指导通过RNA聚合物II的转录的增强子，以及转录终止子(通常 包含多聚腺苷酸化信号）。
[0169] 启动子可以是组织特异性启动子，其与其它细胞或组织类型相比优先或专门驱动 在靶细胞或组织中转录。
[0170] 例如，启动子可以是优先或专门驱动在血管细胞中或在如本说明书中的别处定义 的与血管系统有关的细胞中转录的启动子。因此，启动子可以优先或专门在肺血管细胞中， 例如在血管平滑肌细胞中和/或在血管上皮细胞(包括肺动脉平滑肌细胞和上皮细胞）、外 膜成纤维细胞、或免疫细胞，如T淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞和巨噬细胞中有活性。
[0171] 将核酸递送到靶细胞
[0172]可以通过任何方便的路径递送编码miR-96、模拟物和前体的核酸。
[0173]用于在体外将核酸递送到细胞的方法包括磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖酐、电穿孔、 显微注射、加载有DNA的脂质体、超声处理和使用经核酸涂覆的微粒(例如金或钨微珠)的轰 击。已经成功使这些技术中的多种适于在体内或离体使用。
[0174]因此，核酸可以以裸露形式施用，与合适的载体如聚合物或脂质（如本说明书中别 处描述)结合(例如与合适的载体复合或由合适的载体包囊)施用，或涂覆到颗粒表面上施 用。在此类实施方案中，核酸通常是DNA。也可以适当地使这些方法之任一种适于递送 miR96、前体和模拟物自身。
[0175]核酸通常采取表达载体的形式。技术人员会能够设计适合于治疗用途(及本说明 书中描述的其它用途)的核酸表达载体。载体通常会含有表达构建体，所述表达构建体包含 与合适的调节序列(包括启动子序列和转录终止序列)可操作连接，根据具体的应用任选地 与增强子序列、标志物基因和其它序列组合的编码miR-96、模拟物或前体的核酸序列。载体 可意图整合入宿主细胞染色体，或者可独立于宿主染色体作为附加体(例如质粒)存在并复 制。
[0176] 或者，可以使用病毒载体递送核酸。
[0177] 可以采用任何合适的病毒载体类型作为基因递送媒介物。这些包括腺病毒、腺伴 随病毒(AAV)、逆转录病毒(尤其是慢病毒)和疱疹病毒载体。腺病毒和慢病毒可以是特别优 选的，因为它们具有实现在不活跃分裂的细胞中递送的基因的表达的能力。
[0178] 病毒载体通常包含病毒结构蛋白和核酸有效负载，其包含对于在靶细胞或组织中 表达基因功能性的形式的期望的表达构建体。因此，基因通常与启动子和其它合适的转录 调节信号可操作连接。
[0179]在腺病毒载体中，核酸有效负载通常是双链DNA(dsDNA)分子。在逆转录病毒载体 中，它通常是单链RNA。
[0180] 核酸有效负载通常含有对于它被包装到基因递送媒介物中并且在靶细胞或组织 中适当加工需要的其它元件。
[0181] 对于腺病毒载体，这些可以包括腺病毒反向末端重复（ITR)序列和合适的包装信 号。
[0182] 对于逆转录病毒载体，这些包括特征性末端序列(所谓的"R-U5"和"U3-R"序列)和 包装信号。末端序列使得能够在源自逆转录的原病毒的任一端产生直接重复序列（"长末端 重复"或"LTR"），其然后促进原病毒整合到宿主细胞基因组中并且指导随后的表达。
[0183] 核酸有效负载也可以含有选择标志物，即编码容许经转导的细胞的迅速检测的产 物的基因。例子包括荧光蛋白（例如GFP)、产生可见反应产物的酶(例如半乳糖苷酶，萤光 素酶)的基因和抗生素抗性基因。
[0184] 病毒载体通常没有复制能力。也就是说，核酸有效负载不含病毒复制必需的所有 病毒基因（和其它遗传元件）。不过，病毒载体会含有对于将有效负载导入宿主细胞中及对 于适当加工有效负载，使得可以表达编码的miR-96、模拟物或前体需要的所有结构蛋白和 酶活性。在这些不由核酸有效负载编码的情况下，它们通常会由包装细胞系供应。技术人员 会完全知道可以用于产生合适的病毒递送媒介物的合适的细胞系。
[0185] 因此，对于腺病毒载体，核酸有效负载通常缺乏一个或多个来自El、E2、E3或E4区 的功能性腺病毒基因。可以将这些基因缺失或以其它方式失活，例如通过插入包含异源基 因或选择标志物的转录单元进行。
[0186] 在一些实施方案中，核酸不含功能性病毒基因。因此，对于腺病毒载体，存在的唯 一病毒组分可以是ITR和包装信号。
[0187] 没有功能性病毒基因的核酸可以是优选的，因为它们降低由于病毒蛋白合成针对 经转导的靶细胞或组织产生的宿主免疫应答的风险。
[0_ 治疗的受试者
[0189] 本发明的方法可以用于治疗或预防肺动脉高血压(PAH)。预防性使用不必暗示完 全预防疾病，但是涵盖延迟疾病的发作和/或降低症状的严重性，无论在发作时还是后来。 因此，受试者可以患有PAH，或可处于产生PAH风险。
[0190] 肺动脉高血压牵涉血管到肺的血管收缩和肺内的血管的血管收缩。它以重度肺动 脉重塑和闭塞性肺血管损伤，导致右心室衰竭为特征。它是患有系统性红斑狼疮(SLE)的患 者中的死亡率的重大原因。因此，本发明涵盖在SLE患者中以及在不受SLE影响的患者中预 防或治疗PAH的方法。
[0191] PAH包括特发性PAH和遗传性PAH(又称为家族性PAH)。因此，受试者可以具有使他 们有形成PAH的素因的突变。例如，这可以是BMPR2基因（用于骨形态发生蛋白途径的II型受 体）中的突变。此类突变包括引入提前终止密码子的R899X和N903S。其它素因性突变包括 KCNK3基因（钾通道亚家族K，成员3)中的功能丧失突变。
[0192] 先前可以已经对受试者测试了 PAH的遗传素因。本发明还提供了预防或治疗PAH的 方法，其包括测定受试者的基因组中PAH的遗传素因的存在或缺乏，并且若鉴定出此类素 因，则对受试者规定或施用：
[0193] (a)miR_96、其模拟物、或任一者的前体;或
[0194] (b)编码miR-96、其模拟物、或任一者的前体的核酸。
[0195] 受试者可以患有或有风险形成特发性PAH。已知的风险因素包括女性性别，和厌食 药物，如芬氟拉明（fenfluramine)/芬特明（phentermine)( "fen-phen"）的服用史。
[0196] 本发明可以特别适用于治疗女性受试者，但是治疗男性受试者也可以是有益的， 并且是本发明的范围内涵盖的。
[0197] 虽然用于治疗的最常见的受试者会是人，但是本发明的方法可以延伸到任何其它 哺乳动物，包括其它灵长类（尤其是大型猿（great apes)，如大猩猩（gorilla)、黑猩猩 (chimpanzee)和猩猩(orang utan)，而且还有旧世界和新世界猴）以及嗤齿类(包括小鼠和 大鼠），和其它常见的实验室、家养和农业动物(包括但不限于兔、犬、猫、马、牛、绵羊、山羊 等)。
[0198] 药物组合物和治疗方法
[0199] 可以将本文中描述的分子配制为药物组合物。除了上述物质之一外，这些组合物 可以包含药学可接受赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员公知的其它材料。此 类材料应当是无毒的，并且不应干扰活性成分的效力。载体或其它材料的精确性质可以取 决于施用路径，例如口服、静脉内、皮肤或皮下、鼻、肌肉内和腹膜内路径。Esseku和Adeyeye (2011)及Van den Mooter G. (2006)中提供了合适的组合物和施用方法的例子。
[0200] 用于口服施用的药物组合物可以为片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可以包含固 体载体，如明胶或佐剂。液体药物组合物一般包含液体载体，如水、石油、动物油或植物油、 矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、右旋糖或其它糖溶液或二醇（glycols)，如乙二 醇、丙二醇或聚乙二醇。
[0201] 对于静脉内、皮肤或皮下注射，或痛苦部位处的注射，活性成分可以为胃肠外可接 受的水溶液形式，其是无热原的，并且具有合适的PH、等张性和稳定性。本领域相关技术人 员完全能够使用例如等张媒介物，如氯化钠注射液、林格(Ringer)氏注射液、乳酸林格氏注 射液制备合适的溶液。根据需要可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加 剂。
[0202] 无论要对个体给予的活性剂(例如根据本发明的细胞、多肽、核酸分子、其它药学 有用的药剂）的性质如何，优选以"预防有效量"或"治疗有效量"（根据具体情况而定，尽管 可以认为预防是疗法)施用，这足以显示对个体的益处。施用的实际量，和施用的速率和时 间过程会取决于所治疗(情况）的性质和严重性。治疗的处方，例如对剂量的决定等在一般 从业者和其他医学医生的职责内，并且通常考虑要治疗的病症、个体患者的状况、递送的部 位、施用方法和从业者已知的其它因素。上文提及的技术和方案的例子可以参见 Remington's Pharmaceutical Sciences,^2〇Hix,2000,pub.Lippincott,ffil 1 iams& Wilkins。
[0203] 现在将参考附图和实施例，通过实例而非限制更为详细地描述本发明。
[0204] 附图简述
[0205] 图1 :PASMC中的性别间的微小RNA的差异表达
[0206] 在雌性和雄性WT和BMPR2R899X+aPASMC中通过定量PCR对微小RNA表达的分析显示性 别可以影响表达概貌。结果标准化至U6,并且表示为雌性WT值的倍数变化。数据表示为均值 土 5已]?。？〈0.05*，口〈0.01**(雌性对雄性）和口〈0.05+印〈0.01++，口〈0.001 +++(耵对810^2[?8995( +/-)。
[0207] 图2:miR-96的表达在肺中最高
[0208] 在小鼠组织中通过定量-PCR对miR-96表达的全局分析显示了水平在肺中显著较 高。（RV，右心室）。结果标准化至U6,并且表示为肺数值的倍数变化。数据表示为均值土SEM。 卩〈0.01**和卩〈0.001***。
[0209] 图3:5-HT1B受体作为miR-96靶物的确认
[0210] (A)和(B)25nM浓度的Pre-miR-96降低萤光素酶活性，但是对假(mock)对照载体没 有影响。（C)与对照和混杂miR相比，Pre-miR-96转染提高成熟的miR-96水平。结果标准化至 U6，并且表示为对照数值的倍数变化。数据表示为均值土 SEMK0.05*和P〈0.01**。
[0211]图 4:雌性 BMPR2R899X+/-PASMC 中增加的靶 5-HT1B 表达
[0212 ] 来自WT和BMPR2R899X+/-小鼠的雌性和雄性PASMC中的5-HT1B (A)蛋白和(B )mRNA表达 的分析。与雌性WT相比，雌性BMPR2R899X+/TASMC展现出增加的5-HT1B蛋白和mRNA表达。小鼠 PASMC中的5-HT1B蛋白表达的代表性免疫印迹（C)。将结果分别标准化至a-微管蛋白和 GATOH，并且表示为倍数变化。数据表示为均值土 SEMK0.05*，p〈0.01**(雌性对雄性)和口〈 0.05+，p〈0.〇r+，p〈0.0〇r ++(FD^+/-)。
[0213] 图5: BMP4刺激挽救缺陷雌性BMPR2R899X+/-PASMC中的miR-96表达
[0214] 来自雌性BMPR2R899X+/1、鼠的小鼠PASMC在用InM BMP4刺激时展现出miR-96水平的 试验性升高。结果标准化至U6，并且表示为倍数变化。数据表示为均值± SEM。
[0215] 图6:SMAD1的缺陷展现出与BMPR2R899X+/-类似的miR-96表达概貌。
[0216] 来自具有受损的SMAD1表达(+/-)的雌性小鼠的小鼠PASMC显示了与雌性WT相比 miR-96表达的降低(A)。在整个肺组织中，相对于雌性WT在雌性SMAD1+/-小鼠中有miR-96水 平下降的趋势，而雄性之间没有变化(B)。结果标准化至U6,并且表示为倍数变化。数据表示 为均值土SEMKO.Ol**。
[0217] 图7:人PAH对miR-96和5-HT1B表达的影响
[0218] 与非PAH对照相比，女性患者PASMC具有mir-96表达的降低(A)。与非PAH对照相比， 5-HT1B受体表达在女性患者PASMC中增加(B)，在具有BMPR2突变的HPAH患者内发现miR-96 的低表达和5-HT1B的高表达。结果标准化至RNU48,并且表示为女性对照值的倍数变化。数 据表示为均值。R899X，N903S: BMPR2突变。HPAH:遗传性PAH。IPAH:特发性PAH。
[0219] 图8:雌激素的耗尽(depletion)仅在雌性小鼠中提高miR-96表达并且减少靶物5-HT1B。
[0220] 与媒介物对照相比，用芳香酶抑制剂阿那曲挫(anas traz〇 1 e)处理的雌性小鼠具 有增加的miR-96表达(A)和减少的5-HT1B表达(B)，而雄性小鼠在miR-96(C)或5_HT1B(D)的 表达上没有展现出变化。结果标准化至U6,并且表示为对照值的倍数变化。数据表示为均值 土 SEMKO ? 05*和 P〈0 ? 01**。
[0221] 图9:雌激素在调节miR-96中的作用
[0222] 用InM雌激素(E2)刺激72小时的人PASMC显示miR-96表达的降低(p = 0.0512)(A) 和5-HT1B受体表达增加的相应趋势(B)。结果标准化至RNU48,并且表示为对照值的倍数变 化。数据表示为均值土SEM。
[0223] 图10:mir-96模拟物预防小鼠中的缺氧诱导的肺性高血压(PH)。一周一次静脉注 射（i . v.)施用1.5mg/kg的mir-96模拟物达2周，在此期间将小鼠暴露于缺氧(hypoxia)。 miR-96模拟物防止右心室收缩压的上升(A)、右心室肥大(B)和肺血管重塑(〇。*?〈0.05，** ?〈0.01，*朴〈0.001，*#朴〈0.0001 ;1-因素厶从^厶，接着是图基(1\11?^)事后检验。
[0224] 图ll:mir-96模拟物反转具有BMPR2突变(BMPR2R899X+/-)的小鼠中的肺性高血压 (PH)。一周一次静脉注射施用1.5mg/kg的mir-96模拟物达两周，此后对小鼠评估PH的形成。 miR-96模拟物防止右心室收缩压的上升（A)、右心室肥大（B)和肺血管重塑（〇。扑〈 0 ? 05，*#P〈0 ? 001，##P〈0 ? 0001; 1-因素AN0VA，接着是图基事后检验。
[0225] 发明详述
[0226] 研究提示了微小RNA(miR)在肺动脉高血压(PAH)的病理生物学中发挥至关重要的 作用。
[0227] 遗传性PAH(hPAH)与骨形态发生蛋白受体2(BMPR2)的基因中的突变有关。发明人 已经研究了携带也在PAH患者中找到的突变的PAH的BMPR2小鼠模型，BMPR2 R899X+/1、鼠。
[0228] 在此模型中，性别作为肺动脉平滑肌细胞(PASMC)内的miR的基础表达的关键根本 调节因素出现。与雌性野生型(WT)相比，MiR-96在来自雌性BMPR2 R899X+A小鼠的PASMC中下 调，而雄性转基因物与其WT对照之间的表达不变。全局表达分析显示了肺内的最高miR-96 表达。在mRNA和蛋白质水平两者上，5-HT1B受体的靶基因与雌性BMPR2 R899X+/TASMC内的miR-96表达反相关。通过萤光素酶报告蛋白测定法确认5HT1B基因为miR-96的靶物。
[0229] 发明人还确认来自具有BMPR2突变的女性PAH患者的PASMC展现出低miR-96和高 5HT1B表达。
[0230] 这些结果提示了性激素如雌激素可在调节miR-96中发挥作用。与这一致，我们已 经显示了抑制内源雌激素的体内合成仅在雌性小鼠内增加肺miR-96并且降低5-HT1B表达。 在人PASMC中用雌激素的直接刺激引起miR-96的减少和5-HT1B表达的增加。
[0231] 总之，miR-96的减少与增加的5HT1B表达有关。这提示了 miR-96模拟物/pre-miR-96策略可以是一种对于PAH的新的治疗方法。支持此假设，临床前研究确认mir-96模拟物有 效预防或反转肺性高血压的小鼠模型中的肺性高血压。 实施例
[0232] 材料和方法
[0233] 细胞培养
[0234] 鼠肺动脉平滑肌细胞
[0235] 源自BMPR2+AR899X小鼠和相应的野生型对照小鼠的雌性和雄性肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)由N. W. Morre 11教授(剑桥大学，剑桥，UK)提供。BMPR2v-R899X小鼠具有BMPR2基因的 杂合的敲入突变。小鼠类似于由West等（Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 295: L744-L755,2008)描述的那些小鼠。简言之，在存在生长因子(上皮生长因子，碱性成纤维细 胞生长因子和胰岛素）和抗生素（青霉素链霉素）的情况下在20 %FBS(胎牛血清）DMEM (Dulbecco氏改良的Eagle培养基）中培养PAMSC。利用传代4-8的PASMC，并且细胞活力基于 独特的平滑肌细胞形态学。
[0236] 人肺动脉平滑肌细胞
[0237] 男性人PASMC由N ? W ? Morre 11教授(剑桥大学，剑桥，UK)提供。简言之，从来自三名 PAH患者(两名具有HPAH和一名具有IPAH)的肺血管组织的小远端肺动脉外植人PASMC。利用 源自非PAH受试者的PASMC作为对照。在存在抗生素抗真菌溶液(其含有青霉素、链霉素和两 性霉素）的情况下在10 %FBS DMEM中培养人PASMC，并且在传代4-8使用。经由平滑肌细胞形 态学确认PASMC表型。
[0238] RNA和蛋白质分析
[0239] miRNA 和 mRNA 的 Taqman 定量 PCR 分析
[0240] 使用miRNeasy试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明提取总RNA，并且使用NanoDrop- 1000分光光度计量化RNA纯度。通过Taqman定量-PCR评估miR和mRNA的表达，如先前描述 [17 ]。为了获得倍数变化，将miR表达数据标准化至U6 (对于小鼠）和RNU48 (对于人）。将mRNA 表达数据标准化至GAPDH。所有PASMC miRNA和mRNA表达数据是n = 6，一式三份。
[0241 ] 蛋白质的We stern印迹分析
[0242]使用RIPA裂解方法提取蛋白质。给RIPA缓冲液补充蛋白酶抑制剂PMSF、大豆胰蛋 白酶抑制剂和过苄脒(benzamidine)。简言之，将补充的RIPA缓冲液添加到PASMC，然后在冰 上搅拌10分钟。经由刮擦收集细胞裂解物。将蛋白质表达数据标准化至a-微管蛋白，并且使 用密度测定(dens i tometry)量化。所有蛋白质表达数据是n = 4，一式两份。
[0243]微小RNA-96模拟物的体内有效性
[0244] 为了评估miR-96是否参与肺性高血压的病理学，使用MaxSuppressor?体内RNA- LANCEr II递送方法一周一次经由尾静脉静脉内施用微小RNA-96模拟物（Applied Biosystems，撕 C10422,具有碱基序列UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU，与成熟小鼠和人 miR-96 相同）达2周。按照制造说明以每次注射1.5mg/kg的剂量，即每次注射每只小鼠约30ug在递 送试剂中制备模拟物。使用经阴性微小RNA模拟物(Applied Biosystems)和PBS给药的动物 作为对照。
[0245] 慢性缺氧
[0246] 将2个月龄的雌性野生型(WT)C57/B1 (Charles River)小鼠暴露于14天低压缺氧 (10%02,55011^〇，如先前描述（18)。研究在含氧量正常条件(21%0 2，100011^〇中维持的 小鼠作为对照。
[0247] PH的体内评估
[0248] 进行右心室收缩压（RVSP)、右心室肥大（RVH)和肺血管重塑的测量，如先前描述 (3,4,10)〇
[0249] 靶物确认
[0250] 萤光素酶报告物测定法
[0251] 利用psi-CHECK-2双重萤光素酶报告物载体(Promega)进行报告物测定法。简言 之，通过聚合酶链式反应(PCR)从基因组小鼠 DNA产生5-HT1B报告物基因的3'UTR(非翻译 区）的片段，并且经由in-fusion克隆方法克隆入psi-CHECK-2载体的多克隆位点于Xhol和 Notl限制性位点处。然后，测序psi-CHECK-2 5-HT1B载体以确认5-HT1B的3'UTR区内没有不 想要的突变。使用Lipofectamine 2000( Invitrogen)和0ptimem( Invitrogen)将lug psi-CHECK-2对照载体或psi-CHECK-2 5HT1B载体以及pre-miR-96(Ambion)或混杂miR(Ambion) 共转染到HeLa细胞中，总共6小时，之后用10%FBS DMEM替换。将HeLa细胞保持48小时，并且 使用Dual-Glo萤光素酶测定系统(Promega)测量萤光素酶活性，并且通过发光计检测。将花 虫(renilla)萤光素酶活性标准化至内部萤火虫萤光素酶活性，并且数据表示为内部对照 的百分比。
[0252] 数据的分析
[0253] 数值表示为均值土均值的标准差。在适当的情况下，进行t-检验或2-因素AN0VA及 接着是Bonferroni事后检验以评估所有组间的统计学显著性。p〈0.05的概率水平定义为统 计学显著的。
[0254] 莖里
[0255] 图1证明了许多miR受性别差别影响，并且miR-96相对于野生型对照在雌性 BMPR2 R899X+/-小鼠而非雄性中严重下调；相对于雄性BMPR2R899X+/-小鼠，miR-96水平在雌性 BMPR2 R899X+/1、鼠中更低。
[0256] 与其它组织水平相比，miR-96的肺表达极高，这会促进肺的选择性靶向（图2)。我 们确认了 5HT1B受体是使用萤光素酶报告物测定法的miR96的靶物（图3)。
[0257] 降低的miR96表达与雌性BMPR2R899X+A小鼠中的5HT1B受体的靶基因的升高有关（图 4)。通过BMP4刺激挽救降低的miR96表达(图5)。在来自Smadl +/-小鼠的PASMC中观察到相同 的表型（图6)。
[0258] 已经在人PASMC中确认了结果（图7)。特别感兴趣的是在具有R899X突变的女性患 者中，5HT1B水平高，并且miR96表达极低（图7)。
[0259] 我们还检查了用芳香酶抑制剂阿那曲唑的雌激素耗尽对miR96和5HT1B受体两者 的表达的影响。先前，我们已经显示了阿那曲唑反转雌性小鼠和大鼠中、但非雄性中的PAH (未发表）。这里，我们显示了用阿那曲唑在体内耗尽雌激素在雌性小鼠肺而非雄性中提高 miR96表达，并且降低5HT1B表达(图8)。
[0260] 与这一致，miR-96基因具有雌激素响应区，并且雌激素自身降低miR-96的表达并 且提高5HT1B受体的表达(图9)。
[0261] 图10和11确认miR-96模拟物可以在体内在小鼠模型中既防止又反转的实验性PH。 [0262] 讨论
[0263] 我们的结果提示了增加的雌激素和BMPR2单倍剂量不足(haploinsufficiency)与 降低的miR-96表达有关。
[0264] miR-96通常阻抑5HT1B的基因的翻译，并且因此miR-96的减少诱导5HT1B表达的增 加。这促进通过5-羟色胺的PASMC增殖和肺血管重塑，并且有助于PAH的形成。
[0265] 虽然已结合上文描述的例示性实施方案描述了本发明，但是当给予本公开时，许 多等同修饰和变型对于本领域技术人员会是显而易见的。因而，认为列出的本发明的例示 性实施方案是例示性的而非限制性的。可以对描述的实施方案做出多种改变而不背离本发 明的精神和范围。本申请中引用的所有文件通过提述明确并入。
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[0294] (28)Seuwen K,Magnaldo I,Pouyssegur J.Serotonin stimulates DNA synthesis in fibroblasts acting through 5-HT1B receptors coupled to a Gi_ protein.Nature 1988September 15；335(6187):254~6.
【主权项】
1. 一种用于预防或治疗肺性高血压的方法，其包括对靶细胞递送，或对受试者施用： (a) miR-96、其模拟物、或任一者的前体;或 (b) 编码miR-96、其模拟物、或任一者的前体的核酸。2. -种用于抑制血管细胞增殖和/或血管重塑的方法，其包括对靶细胞递送，或对受试 者施用： (a) miR-96、其模拟物、或任一者的前体;或 (b) 编码miR-96、其模拟物、或任一者的前体的核酸。3. 根据权利要求1的方法，其中所述肺性高血压是肺动脉高血压。4. 根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述靶细胞表达5-HT1B受体。5. 根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述靶细胞是血管细胞。6. 根据权利要求5的方法，其中所述血管细胞是血管平滑肌细胞(VSMC)或血管内皮细 胞。7. 根据权利要求6的方法，其中所述血管细胞是肺动脉平滑肌细胞(PASMC)或肺动脉内 皮细胞。8. 根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述靶细胞是与血管系统有关的细胞。9. 根据权利要求8的方法，其中所述靶细胞是外膜成纤维细胞或免疫细胞。10. 根据权利要求9的方法，其中所述免疫细胞是T淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞或肥 大细胞。11. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中miR-96的所述前体是pre-mir96。12. 根据权利要求11的方法，其中所述pre-mir96具有序列： UGGCCGAUUUUGGCACUAGCACAUUUUUGCUUGU⑶CUCUCCGCUCUGAGCAAUCAUGUGCAGUGCCAAUAUG GGAAA(hsa-pre-mir-96)或 CCAGUACCAUCUGCUUGGCCGAUUUUGGCACUAGCACAUUUUUGCUUGU⑶CUCUCCGCUGUGAGCAAUCAUG UGUAGUGCCAAUAUGGGAAAAGCGGGCUGCUGC(mmu-pre-mir-96), 其中成熟的miR-96序列是加下划线的。13. 根据权利要求1至10中任一项的方法，其中所述mi R-96的前体是pr i -mi R96。14. 根据权利要求1至10中任一项的方法，其中所述miR-96模拟物包含指导链，所述指 导链具有序列： UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU (其中种子序列是加下划线的） 或者所述指导链在所述种子序列外部的一个或多个位置处与所述序列不同。15. 根据权利要求1至10或14中任一项的方法，其中所述miR-96模拟物包含一个或多个 经修饰的糖残基。16. 根据权利要求1至10、14或15中任一项的方法，其中所述miR-96模拟物包含一个或 多个经修饰的核苷间连接。17. 根据权利要求1至10或14至16中任一项的方法，其中所述miR-96模拟物包含一个或 多个经修饰的碱基。18. 根据权利要求1至10或14至17中任一项的方法，其中所述miR-96、其模拟物或前体 与载体相结合。19. 根据权利要求18的方法，其中所述载体是药学可接受脂质或聚合物、或其组合。20. 根据权利要求1至10中任一项的方法，其中以裸的DNA或与载体结合递送所述核酸。21. 根据权利要求1至10中任一项的方法，其中经由病毒载体递送所述核酸。22. 根据权利要求21的方法，其中所述病毒载体是腺病毒或逆转录病毒载体。23. 根据权利要求22的方法，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。 24. miR-96、其模拟物、或任一者的前体，其用于抑制血管细胞增殖和/或血管重塑的方 法。 25. miR-96、其模拟物、或任一者的前体，其用于预防或治疗肺性高血压的方法。26. 根据权利要求25使用的miR-96、其模拟物、或任一者的前体，其中所述肺性高血压 是肺动脉高血压。27. 根据权利要求24至26中任一项使用的miR-96的前体，其中所述miR-96的前体是 pre_mir96〇28. 根据权利要求27使用的miR-96的前体，其中所述pre-mir96具有序列： UGGCCGAUUUUGGCACUAGCACAUUUUUGCUUGU⑶CUCUCCGCUCUGAGCAAUCAUGUGCAGUGCCAAUAUG GGAAA(hsa-pre-mir-96)或 CCAGUACCAUCUGCUUGGCCGAUUUUGGCACUAGCACAUUUUUGCUUGU⑶CUCUCCGCUGUGAGCAAUCAUG UGUAGUGCCAAUAUGGGAAAAGCGGGCUGCUGC(mmu-pre-mir-96), 其中成熟的miR-96序列是加下划线的。29. 根据权利要求24至26中任一项使用的miR-96的前体，其中所述miR-96的前体是 pri-miR96〇30. 根据权利要求24至26中任一项使用的miR-96模拟物或其前体，其中所述miR-96模 拟物包含指导链，所述指导链具有序列： UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU 其中种子序列是加下划线的， 或者所述指导链在所述种子序列外部的一个或多个位置处与所述序列不同。31. 根据权利要求24至26或权利要求30中任一项使用的miR-96模拟物或其前体，其中 所述miR-96模拟物包含一个或多个经修饰的糖残基。32. 根据权利要求24至26、权利要求30或权利要求31中任一项使用的miR-96模拟物或 其前体，其中所述miR-96模拟物包含一个或多个经修饰的核苷间连接。33. 根据权利要求24至26或30至32中任一项使用的miR-96模拟物或其前体，其中所述 miR-96模拟物包含一个或多个经修饰的碱基。34. 根据权利要求24至33中任一项使用的miR-96、其模拟物、或任一者的前体，其中所 述miR-96、其模拟物或前体与载体相结合。35. 根据权利要求34使用的miR-96、其模拟物、或任一者的前体，其中所述载体是药学 可接受脂质或聚合物、或其组合。36. 编码miR-96、其模拟物、或任一者的前体的核酸，其用于抑制血管细胞增殖和/或血 管重塑的方法。37. 编码miR-96、其模拟物、或任一者的前体的核酸，其用于预防或治疗肺性高血压的 方法。38. 根据权利要求37使用的核酸，其中所述肺性高血压是肺动脉高血压。39. 根据权利要求36至38中任一项使用的核酸，其中将所述核酸经配制用于以裸的DNA 或与载体结合递送。40. 根据权利要求36至39中任一项使用的核酸，其中以病毒载体的一部分提供所述核 酸。41. 根据权利要求40使用的核酸，其中所述病毒载体是腺病毒或逆转录病毒载体。42. 根据权利要求41使用的核酸，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。
【文档编号】A61K31/713GK106029887SQ201480073780
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2014年12月1日
【发明人】M·R·麦克莱恩, E·华莱士, A·H·贝克
【申请人】格拉斯哥大学理事会