新型抗胎盘生长因子抗体的制作方法

专利名称：：新型抗胎盘生长因子抗体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及特别适用于抑制病理状态中的血管发生的新型抗体及其片段和衍生物。本发明还涉及产生这种特异性抗体的细胞系。本发明提供了包含本发明抗体、片段和/或衍生物的药物组合物，还提供了预防和治疗例如肿瘤形成、眼科疾病、肺动脉高血压和炎性疾病中的不良血管发生和/或血管渗漏的方法，以及预防和治疗骨疾病如骨质疏松的方法。
背景技术：
：异常血管形成是许多发病率高和死亡率高疾病的发病原因。阐明血管发生的机制可能有助于开发刺激缺血组织血管发生或抑制肿瘤血管形成的治疗策略，近年在胚胎中的基因靶向研究鉴定到参与内皮通道(血管发生)初步形成及其后继成熟覆盖平滑肌细胞的(动脉生成)几种机制。证明有不同的分子机制可能介导了病理条件下的血管发生，但参与的主要分子仍有待确定。已确定血管内皮生长因子(VEGF)参与脉管系统的发生和病理性生长(FrraraN.等，1999，CurrTopMicrobiolImmunol237，1-30)，此外，也已证明胎盘生长因子(PLGF)，VEGF的一种同系物，是多种疾病例如缺血性视网膜病、肿瘤、炎性疾病和浮肿时VEGF的特异性调节剂。已证明PLGF;小鼠具有病理性的血管发生和动脉生成(CarmelietP.等2000，J.Pathol.190，387-405),而正常健康小鼠的生理性血管发生不受影响。因此，抑制PLGF可能对治疗血管发生或动脉生成导致的疾病有巨大潜能。PLGF的抑制剂是本领域熟知的，例如抗人PLGF的山羊多克隆抗体(R&D，pharmaceuticals,Abingdon，UK)禾口鸡多克隆抗体(Gassmann等，1990，FasebJ.4，2528)。这些抗体可用于Western印迹、组织化学和免疫沉淀研究。WO01/85796描述了PIGE抑制剂的应用，包括采用抗-PLGF单克隆抗体治疗和预防诸如肿瘤形成之类的疾病。更具体说描述了制备能完全抑制小鼠PLGF-2与其受体Flt-l结合的鼠单克隆抗体，从而筛选出具有最有效抑制活性的抗体Mab-PL5D11。描述了该抗体在病理性血管发生动物模型中的应用。有动物体内产生的抗体所具有的特征使其在人类治疗中的应用受到严重的限制。如Jaffers等，1986(Transplantation198641:572)中所述，作为外源蛋白，它们可能诱导抗免疫球蛋白应答(对于小鼠抗体指产生人抗小鼠抗体或HAMA)，从而降低或损害它们的治疗效率和/或诱发病人产生变态或超敏反应。虽然采用人单克隆抗体可克服这种限制，但证明常规杂交瘤技术很难产生大量的人抗人抗体。因此本领域已采用重组技术构建了既能保持动物抗体(例如鼠单克隆抗体)的高结合亲和力又显示在人体内免疫原性降低的"人源化"抗体。具体说，已提出的嵌合抗体中非人抗体的可变区(V)与人抗体的保守区(C)结合。在美国专利5,770，198中详细描述了获得这种嵌合免疫球蛋白的方法。在另一种降低鼠抗体免疫原性的尝试中，只将(鼠抗体的)互补决定区(CDR)，即V区中的超变区而不是整个V区域移植到人抗体中。这种人源化抗体称为CDR-嫁接抗体(graftedantibody)。构建能识别更复杂抗原的CDR-嫁接抗体导致抗体的结合活性显著低于天然非人源化抗体。许多情况中证明只将非人CDR导入人抗体骨架中不足以保持完整的结合活性。为了鉴定人源化抗体设计中必须考虑的关键性氨基酸，需要感兴趣的鼠抗体的精确计算机模型，并已提出这种设计的总体理论指南，在所有情况下，必须定制和优化感兴趣的特定非人抗体的制备方法。因此，仍然需要能理想地抑制人PLGF与其受体结合的(单克隆)抗体。此外，还需要这种抗体没有免疫性，即不会诱导HAMA(或诱导倾向很低)。发明概述本发明涉新型抗PLGF单克隆抗体及其衍生物，该单克隆抗体及其衍生物能抑制PLGF与其受体结合。首次证明本发明的这种配体能够在体内病理状态中抑制人PLGF。更具体说，本发明的抗体及其衍生物能够减少人体内肿瘤组织的体积和血管化。本发明抗体提供了当前所用的靶向VEGF的抗血管发生的一种替代治疗方法，其重要优点是可显著减少这些治疗所伴随的对生理性血管发生抑制所导致的副作用。本发明涉及抗原结合分子，具体指单克隆抗体及其片段或衍生物，包括与本文称为16D3的抗体结合相同PLGF表位的人源化抗体和抗体片段。本发明的第一方面是提供能结合PLGF并能抑制PLGF功能的新型单克隆抗体，更具体说该抗体的特征是，它们的重链可变区包含序列SEQIDNO:2或与在其CDR区与其有至少80%、更具体至少90%、最具体至少95%序列相同性的序列，和/或它们的轻链可变区包含序列SEQIDNO:4或在其CDR区与其有至少80。/。、更具体至少90%、最具体至少95%序列相同性的序列，例如抗体16D3或及衍生物。在其它或可选的进一步的实施方式中，本发明的抗原结合分子在CDR区之外的重链和/或轻链可变区中与序列SEQIDNO:2和SEQIDNO:4分别有至少70%、具体至少80%、更具体至少90%、最具体至少95%的相同性。根据本发明的一具体实施方式，所述抗体为人源化抗体，更具体为杂交抗体，最具体为小鼠/人杂交抗体，更具体为小鼠16D3/人IgGlK或IgG4K杂交抗体。或者该人源化抗体是一种包含嫁接到人抗体骨架上的本发明能结合PLGF的小鼠16D3抗体的CDR区的抗体。本发明的另一实施方式涉及小鼠16D3抗体的抗原结合片段或其衍生物，例如其人源化抗体，例如但不限于Fab，Fab'，F(ab')2，至少两个互补决定区(CDR)的组合，可溶性或膜-锚定单链可变区，或单链可变区。这种抗原结合片段的具体实施方式所包括的片段包含16D3或及衍生物的至少两个CDR，或更具体说包含选自以下的至少两个CDR:SEQIDNO:17(GYTFTDYY)，SEQIDNO:18(IYPGSGNT)，SEQIDNO:19(VRDSPFFDY)，SEQIDNO:20(QSLLNSGMRKSF)，SEQIDNO:21(WAS)和SEQIDNO:22(KQSYHLFT)，或包含与其有至少80%、具体至少85%、更具体至少90%、最具体至少95%序列相同性的至少两个序列。本发明的具体实施方式涉及提供能抑制PLGF活性的小鼠16D3抗体的单链可变区片段(scFv)和人源化scFv。更具体说，本发明提供的scFv包含氨基酸序列SEQIDNO:24或SEQIDNO:26或是在能够结合PLGF的CDR内与其有至少80。/。、具体至少85%、更具体至少卯。/。、最具体至少95。/。序列相同性的序列。本发明还有另一方面是提供能产生本发明单克隆抗体的细胞系，更具体说不仅包括能产生16D3抗体的细胞系16D3，而且包括例如重组技术产生的能够产生衍生自16D3或其片段的抗原结合分子的细胞系。本发明还有另一方面是提供一种用于预防和治疗哺乳动物病理状态或病症中的(不良)血管发生、或者用于预防或治疗骨质重吸收疾病的药物组合物，该组合物包含抗PLGF抗体与药物学上可接受的运载体的混合物，所述抗体为16D3或其片段或衍生物，更具体是人源化形式的16D3或其抗原结合片段。本发明的一具体实施方式是包含选自以下的16D3抗原结合片段或其衍生物的药物组合物Fab、Fab，或F(ab')2、可溶性或膜-锚定单链可变部分、或单链可变域。本发明的最具体实施方式涉及包含抗原结合片段的药物组合物，所述片段包含至少两个选自下组的CDR:SEQIDNO:17(GYTFTDYY)、SEQIDNO:18(IYPGSGNT)、SEQIDNO:19(VRDSPFFDY)、SEQIDNO:20(QSLLNSGMRKSF)、SEQIDNO:21(WAS)和SEQIDNO:22(KQSYHLFT)，或包含至少两个与选自SEQIDNO:17-22的两个不同序列有至少80。/。、具体至少85%、更具体至少90%、最具体至少95%序列相同性的序列。本发明的一具体实施方式涉及包含本发明16D3抗体的scFv的药物组合物，更具体指所包含的scFv含有选自SEQIDNO:17(GYTF丁DYY)、SEQIDNO:18(IYPGSGNT)、SEQIDNO:19(VRDSPFFDY)、SEQIDNO:20(QSLLNSGMRKSF)、SEQIDNO:21(WAS)和SEQIDNO:22(KQSYHLFT)的至少两个CDR，或含有至少两个与选自SEQIDNO:17-22的至少两个不同序列有至少80%、具体至少85%、更具体至少90%、最具体至少95%相同性的序列，例如包含SEQIDNO:24的scFv。最具体的说，该药物组合物包含16D3的人源化scFv，例如但不限于其CDR中含SEQIDNO:26或含有与其至有少80。/。、具体至少85%、更具体至少90。/。、最具体至少95%序列相同性能结合PLGF的人源化scFv。在本发明药物组合物的另一具体实施方式中，除了本发明能结合PLGF的抗原结合分子以外，还包括治疗有效量的另一种抗血管发生药。该方面涉及的最具体抗血管发生药例如有VEGF-和bFGF-抑制剂，最具体是抗-VEGF抗体。本发明另一目的是提供编码本文公开的能结合PLGF的抗体的抗原结合片段的核苷酸序列，更具体指编码细胞系16D3产生的16D3(抗体)重链和轻链可变区的核苷酸序列。最具体涉及编码SEQIDNO:2和SEQIDNO:4可变区的核苷酸序列。另外还包括包含16D3至少两个CDR的抗原结合片段的编码多核苷酸序列，更具体说是编码选自下组的至少两个CDR的多核苷酸SEQIDNO:17(GYTFTDYY)、SEQIDNO:18(IYPGSGNT)、SEQIDNO:19(VRDSPFFDY)、SEQIDNO:20(QSLLNSGMRKSF)、SEQIDNO:21(WAS)和SEQIDNO:22(KQSYHLFT)，或包含与SEQIDNO:17-22有至少80%、具体至少850/。、更具体至少卯％、最具体至少95%序列相同性的至少两个CDR的编码序列。本发明核苷酸序列的具体实施方式提供于SEQIDNO1、3、5和6。其它具体实施方式包括编码16D3的scFv和其人源化形式的核苷酸序列，更具体是SEQIDNO:23和SEQIDNO:25的序列和与其有至少80%、具体至少85%、更具体至少90%、最具体至少95%序列相同性的序列，最具体是编码scFv的CDR区序列。然而应理解由于遗传密码子的冗余性而存在的许多核苷酸序列都种属于本发明范围之内本发明的另一个目的是提供治疗和/预防哺乳动物病理状态中的不良(或病理性)血管发生的方法，该方法包括给予需要这种治疗和预防的哺乳动物治疗有效量的活性成分，这种活性成份是本发明的16D3抗体或其抗原结合片段或衍生物，最具体是本文所述的scFv。特别适合于本发明方法的是人源化抗体和抗体片段，如16D3的scFv或其衍生物。本发明方法的具体实施方式可治疗和/或预防的疾病例如iS不限于癌症，炎症，眼部疾病，肺高压和脉管渗漏。本发明的具体目标是为哺乳动物更具体是人的病理性血管发生，更具体是肿瘤生长、炎症、眼部疾病或脉管渗漏提供有效和安全的治疗(即无副作用)。最具体说，本发明的方法适合治疗和/或予页防实体肿瘤，更具体说适合治疗和/或预防结肠癌、乳腺癌、胰腺癌和黑素瘤。本发明的抗体和抗原结合片段的进一步应用涉及免疫学检测人样品中的PLGF，例如在诊断方法中用作标记的靶向分子和在癌症治疗中用于筛选对PLGF具有额外抑制作用的化合物。本发明的依据是令人惊奇地确定了能非常有效抑制PLGF的新型配体，即称为新型的小鼠和人源化单克隆抗体及其片段、衍生物和同系物。最具体说，本发明证明了这种配体能减少肿瘤生长，最具体说能减少肿瘤体积20%和50%。附图简述以下描述不意味着将本发明的范围限于本文所述实施例，而是结合纳入本文作为参考的来理解本发明。图1:按照本发明的实施方式用ELISA检测抗体16D3(A)或人源化抗体16D3(hul6D3)(B)与人PLGF2(毕赤酵母菌生产)的结合。图2:按照本发明的实施方式用ELISA检测抗体16D3(方形)或人源化抗体16D3(三角形)抑制PLGF与人Flt-l的结合。图3:按照本发明的实施方式将rhuPLGF-2固定在CM5芯片上检测以研究抗体16D3和其片段抑制潜力的Biacore实验结果。图4:单克隆抗体16D3抑制皮下人胰腺DanG异种移植肿瘤模型中的肿瘤生长。按照本发明实施方式用抗-tPA('对照IgG，)(lC8:50mg/kg体重；n=10)、抗-hPLGF16D3('抗-hPLGF，)(50mg/kg体重；『10)、抗-mPLGF(PL5DllD4(按照专利WO01/85796所述获得；50mg/kg体重；n=10)、抗-mPLGFPL5D11D4('抗-hPLGF/抗-mPLGF，)(各25mg/kg体重；n-10)和'运载体，(n-10)治疗长有约60mmS肿瘤的nu/nu小鼠。肿瘤接种18天后测定(A)月中瘤大小(B)月中瘤重量。图5:单克隆抗体16D3以剂量依赖方式抑制皮下人胰腺DanG异种移植肿瘤模型中的肿瘤生长。按照本发明实施方式用抗-hPLGF16D3(50mg/kg-'1000吗，/'C，，37.5mg/kg='750(igV'D，，25mg/kg='500(igV'E，，12.5mg/kg='250ug，/'F，;各浓度n:10)、对照IgG('lC8，/'B，；50mg/kg)和'运载体，/'A，(i^lO)治疗长有约60mm3肿瘤的nu/nu小鼠。A:肿瘤细胞接种后评价的肿瘤平均大小；B:20天后的肿瘤平均大小。图6:单克隆抗体16D3抑制皮下人乳腺MDA-AB异种移植肿瘤模型中的肿瘤生长。按照本发明实施方式用抗-hPLGF16D3(50mg/kg体重；n-10)或运载体每周三次治疗长有约60mm^中瘤的nu/nu小鼠。肿瘤接种32天后测定(A)月中瘤重量(B)月中瘤体积。图7:单克隆抗体16D3抑制皮下人结肠LOVO异种移植肿瘤模型中的肿瘤生长。按照本发明实施方式用抗-hPLGF16D3(50mg/kg体重；11=10)或运载体每周三次治疗长有约60mmS肿瘤的nu/nu小鼠。肿瘤接种30天后测定(A)肿瘤重量(B)肿瘤体积。图8:单克隆抗体16D3抑制皮下人黑素瘤Mel2a异种移植肿瘤模型中的肿瘤生长。按照本发明实施方式用抗-hPLGF16D3(50mg/kg体重；n-10)或运载体每周三次治疗长有约60mm、中瘤的nu/nu小鼠。肿瘤接种53天后测定肿瘤重量。图9:单克隆抗体16D3预防皮下人胰腺DanG异种移植肿瘤模型的体重减轻。按照本发明实施方式用抗-hPLGF16D3(50mg/kg体重；n=10)、对照IgG、抗-hPLGF16D3和抗-mPLGF联用(各25mg/kg体重；11=10)和运体体(n-10)治疗长有约60mr^肿瘤的nu/nu小鼠。将肿瘤重量从体重中扣除然后计算体重减轻百分比。空心柱治疗第一天的体重；实心柱治疗最后一天的体重。图10:单克隆抗体16D3和Avastin对皮下人胰腺DanG的肿瘤生长抑制有叠加作用。按照本发明实施方式用抗-hPLGF16D3(浓度分别为37.5mg/kg'，25mg/kg，12.5mg/kg体重;n=10)、对照IgG(lC8;50mg/kg)、Avastin(15mg/kg和5mg/kg体重，每周两次，各n-10)和联用抗-hPLGF(12.5mg/kg体重)与Avastin(5mg/kg体重；n^O)治疗长有约60mi^肿瘤的nu/nu小鼠。肿瘤接种20天后处死小鼠检测肿瘤体积。图ll:本发明实施方式的小鼠抗体16D3的可变区核苷酸和氨基酸序列。A.编码重链可变区的核苷酸序列；B.编码轻链可变区的核苷酸序列；C.重链可变区的氨基酸序列；D.轻链可变区的氨基酸序列。下划线为根据本发明一实施方式人源化修饰的核苷酸或氨基酸部分。图12:本发明实施方式的16D3的人源化可变区的核苷酸和氨基酸序列。A.编码人源化重链可变区的核苷酸序列；B.编码人源化轻链可变区的核苷酸序列；C.人源化的重链可变区氨基酸序列；D.人源化的轻链可变区氨基酸序列。下划线为人源化修饰的核苷酸或氨基酸部分。图13:说明用于在293T细胞中表达人源化16D3的载体。图14:A:scFvl6D3和人源化scFvl6D3与PLGF结合；B:scFvl6D3和人源化scFv16D3(B)抑制huPLGF-2与其受体huFlt-1结合。图15:A:小鼠抗体16D3的scFv的氨基酸序列；B:抗体16D3的人源化scFv的氨基酸序列；下划线部分为重链和轻链可变区以外的区域。图16:说明按本发明一实施方式用于在293细胞中表达人源化16D3Fab的载体。图17:A:按本发明实施方式用ELISA检测人源化Fabl6D3与huPLGF的结合；B:人源化Fabl6D3抑制huPLGF-2与huFlt-l的结合定义本文所用术语"16D3"指以保藏号LMBP6399CB保藏于BCCM/LMBP的细胞系产生的抗PLGF单克隆抗体。术语"抗体片段"指抗体分子亚部分的单独形式，或与其它片段的结合形式，能够结合原相应抗体所结合的抗原。典型的抗体片段为Fab'Fab'，F(ab')2，Fv或scF，它们通常保留了与完整抗体相当的抗原亲和力。更小的片段包括互补决定区或CDR，例如重链或轻链的CDR1、CDR2、CDR3禾n/或它们的两个或多个CDR的组合。本文所用术语"衍生物"指对原始抗体(例如由杂交瘤细胞系产生)及其片段的修饰不明显影响其与抗原结合的抗原结合分子。典型的修饰包括对原始抗体氨基酸序列的修饰或氨基酸序列功能基团的修饰，例如在人源化叙述中，使该抗体或其片段与其它分子例如标记或小珠结合，或糖基化修饰。因此，衍生物包括但不限于人源化抗体，杂交抗体，通过将原始抗体的一个或多个可变区和/或CDR嫁接或导入到同种或异种抗体或片段的骨架上而获得的抗体或其它抗原结合分子。抗体衍生物包括交替构建的一个或多个抗体的CDR所产生的抗原结合分子例如合成多肽。本文所使用术语"人源化抗体或抗体片段"指其原始抗体相比，为了更加接近类似于人抗体而含有取代氨基酸的抗体分子或其片段。这些取代主要发生在抗体或抗体片段的骨架中，即发生在非抗原结合区。但是，考虑也可以取代CDR中不参与或很少参与抗原结合的氨基酸。本文所用"重构"抗体或抗体片段或"杂交抗体"指包含至少两种不同抗体的一部分的抗体，所述不同抗体可以是任选的同种或异种抗体。通常，人杂交抗体可以是一种抗体的人恒区连接另一抗体的人源化可变区(针对感兴趣的抗原)，或一种抗体的人抗体骨架中的抗原结合区氨基酸序列已被另一抗体(例如针对感兴趣人抗原的非人抗体)的序列取代。更具体说，将对感兴趣抗原具有亲和力的一种抗体(通常为非人抗体)的抗原结合区，例如一个或多个CDR，或可变区或其一部分，导入另一种抗体(通常为人抗体)的骨架中(例如CDR嫁接抗体)。本文用于指本发明两种或多种抗原结合分子的术语"同源性"或"同源"是指抗原结合分子能结合相同的抗原，更具体说能结合相同的表位。评价两种抗原结合分子能否与相同表位结合可以通过检测两种抗原结合分子彼此能否竞争结合相同抗原，例如竞争结合试验。同源性抗原结合分子与抗原的结合应具有相似特异性。本文所用的两条序列的"序列相同性"涉及到当两条序列排列对比时，该二序列中更短序列的具有相同的核苷酸或氨基酸的位置数目除以核苷酸或氨基酸总数。所述序列相同性宜高于70-80%，优选81-85%，更优选86-90%，特别优选91-95%，最优选96-100%，更特别优选100%。鉴于可变区骨架对结合抗原的贡献有限，序列相同性最为常见的特定区域是互补决定区或CDR，例如构成CDR的氨基酸序列及其编码核苷酸序列。因此，当一特定序列与CDR内特定序列有例如80。/。的序列相同，这二条序列只在组成CDR的序列之间具有序列相同性。本文所用术语"PLGF"指胎盘生长因子。已发现PLGF主要存在两种剪接变体或同种型149个氨基酸的PLGF-l和170个氨基酸的PLGF-2，后者在其羧基末端含21个氨基酸插入，但也已发现了其它同种型。当指PLGF或其片段或衍生物的抗体时，术语"抑制"用于指能够抑制PLGF与其受体Flt-l结合的抗体、其片段或衍生物。发明详述本发明将通过参考特定实施方式和特定的附图行描述，但本发明的范围不限于此而只由权利要求书限定范围。本发明涉及能结合本文所述抗体16D3所结合的相同PLGF表位的抗原结合分子，具体是单克隆抗体、其片段或衍生物。由细胞系LMBP6399CB产生的"抗体16D3"是抗人源PLGF的抗体，能结合人PLGF(两种同种型PLGF-l和PLGF-2)。抗体16D3能抑制人PLGF与其受体Fit-l的结合，抑制PLGF-活性。因此，在治疗应用或动物模型中为了检测和筛选目的，抗体16D3本身及其片段或衍生物，编码该抗#:、片段或衍生物的核苷酸序列都可用来抑制PLGF。或者，可用该抗体来检测和/或定量体内、离体或体外(组织的)PLGF。因此，本发明提供了本发明抗原结合分子和编码它们的核苷酸的不同应用。本发明还涉及产生本发明抗原结合分子的方法和产生这些抗原结合分子的细胞系。本发明的第一方面涉及能产生本发明抗原结合分子的细胞系，更具体说产生能结合与16D3或其片段或衍生物所结合的相同抗原的单克隆抗体的细胞系。本发明该方面的一具体实施方式是也称为'细胞系16D3'的杂交瘤细胞系，该细胞系产生单克隆抗体16D3并保藏于BCCM/LMBP(BelgianCo-ordinatedCollectionsofMicroorganisms/PlasmidCollectionLaboratoriumvoorMoleculaireBiologie，UniversityofGhentK丄.Ledeganckstraat35，B-9000Ghent,BE，由Thromb-X于2005年3月29日保存，保藏号为LMBP6399CB)。本发明还提供产生衍生自单克隆抗体16D3的单克隆抗体的细胞系。这种细胞系可通过修饰编码单克隆抗体16D3的序列获得，最具体是16D3的非抗原结合区的编码序列。检测这种修饰的性质的方法有待建立，本文中描述了适当修饰的实例。本发明第二方面涉及能结合16D3所结合相同抗原的抗原结合分子。更具体说，本发明涉及以上所述的由细胞系16D3所产生的能结合PLGF和抑制PLGF活性的称为16D3的抗体和其同系物、其片段和衍生物。因此本发明一具体实施方式提供由细胞系LMBP6399CB产生的抗-人PLGF单克隆抗体16D3，和此抗体的片段。单克隆抗体16D3的特征是其重链和轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQIDNO:2和序列IDNO:4所示。按照具体实施方式，本发明涉及抗体16D3的片段，更具体是其抗原结合片段。这种片段包括但不受限于Fab'、Fab'、F(ab')2、CDR、具有该抗体一部分序列或其CDR的肽、单个可变区和它们的组合。可用本
技术领域：
熟知的单克隆抗体水解消化方法产生Fab，、Fab，、F(ab，)2片段，例如Stanworth等，(f^^邀扇i^学手J7f/朋必ooyt五x/erz'me她〃m膽w/og^，(1978)，第1巻，第瞎(BlackwellScientificPublications)。这些保留了结合抗原能力的片段，但丧失了母抗体的许多能质，如激活补体或结合Fcy受体的能力。更具体说，本发明提供的片段包含分别与SEQIDNO:2和SEQIDNO:4相应的16D3的重链和轻链可变区。本发明的另一具体实施方式涉及包含16D3的互补决定区(CDR)及其衍生物的片段。下文说明了两种最常用的鉴定CDR的方法IMGT和KABAT，和包含16D3的二种类型CDR之一的片段都视为属于本发明的内容，包含这些片段或CDR的16D3衍生物也属于本发明。根据对CDR的IMGT鉴定，16D3可变区内的CDR区与序列对应于SEQIDNO:17(GYTFTDYY)、SEQIDNO:18(IYPGSGNT)、SEQIDNO:19(VRDSPFFDY)、SEQIDNO:20(QSLLNSGMRKSF)、SEQIDNO:21(WAS)和SEQIDNO:22(KQSYHLFT)序列。因此，本发明提供包含SEQIDNO:17-NO:22中所提供的16D3的一个或多个CDR的16D3抗体片段。本发明的另一具体实施方式提供了可溶性或膜锚定的16D3单链可变区的16D3片段。单链可变区片段(scFv)—般为工程改造的抗体片段，通常由免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)可变区或其一部分通过可屈曲的肽接头连接在一起而构成。scFv可任选地包含感兴趣抗体的CDR区和另一抗体的框架区。可任选人源化scFv的框架和/或CDR区的氨基酸序列以减少其在人体中用作药物时的抗原性。本发明提供分别包含序列SEQIDNO:24和SEQIDNO:26的16D3的scFv及其人源化形式。获得抗体单链可变区的方法是技术人员所熟知的在本文实施例6中有所描述。例如该方法包括在不同反应中扩增和克隆人重链和轻链可变区的DNA序列，然后例如在VH和VL之间通过两步聚合酶链反应插入15个氨基酸的接头序列(Gly4Ser)3(例如参见DieffenbachandDvel(sler，《PCR引物，实验手册》(PCRPrimer,alaboratorymanual)(1995)，ColdSpringHarbourPress,Plainview，NY，USA)。然后将产生的片段插入到合适的载体中表达单链可变区片段成为可溶性或噬菌体展示的多肽。这些可用本领域技术人员熟知的方法实现，例如见Gilliand等，r^ywe^w咏era(1996)47:l-20所述。本发明还提供16D3的片段，这种片段为代表抗体16D3超变区或其组合的抗原结合多肽。可利用应用生物系统合成仪通过合成而获得这种多肽，所述多肽合成仪例如是可从Milligen(USA)获得的9050型合成仪，或相关的技术类型。本发明的另一实施方式涉及抗体16D3的衍生物或其片段。更具体说，本发明涉及分别包含如公开的序列SEQIDNO:2和SEQIDNO:4所示的重链可变区或轻链可变区，但其恒定区与16D3的不同的抗体。其其或者，本发明16D3抗体的衍生物包含16D3的如SEQIDNO:17(GYTFTDYY)、SEQIDNO:18(IYPGSGNT)、SEQIDNO:19(VRDSPFFDY)、SEQIDNO:20(QSLLNSGMRKSF)、SEQIDNO:21(WAS)和SEQIDNO:22(KQSYHLFT)序列中的至少两个CDR，而CDR禾B/或恒定区之间的框架区不同。根据本发明的一实施方式，抗体16D3的衍生物或其片段与SEQIDNO:2和SEQIDNO:4所提供的16D3的重链和轻链可变区序列有至少80。/。，具体至少85%，更具体至少90%，最具体至少95%的序列相同性。最具体说，本发明提供包含分别与CDR区内的SEQIDNO:2和SEQIDNO:4序列有至少80。/。，具体至少85%，更具体至少90%，最具体至少95。/。序列相同的重链和/或轻^l可变区的抗体16D3的衍生物或其片段。框架区内的序列相同性可以但不限于少于80%。也考虑包含至少两个分别与序列SEQIDNO:17-22有至少80%，具体至少85%，更具体至少90%，最具体至少95%序列相同的CDR的衍生物。根据另一实施方式，本发明提供16D3的scFv的衍生物，这种衍生物包含的序列与SEQIDNO:24序列有至少80%，具体至少85%，更具体至少90%，最具体至少95%的序列相同性，和与SEQIDNO:26序歹U(最具体为CDR区内)有至少80。/。，具体至少85%，更具体至少90%，最具体至少95%的序列相同性。本发明的另一实施方式提供人源化的16D3衍生物或其片段。这种人源化的16D3衍生物为同系物在于它们保留对PLGF的结合亲和力。按照一具体实施方式，人源化的16D3衍生物也保留了抑制PLGF活性的能力。非人抗体的人源化可通过取代抗体骨架上的一个或多个氨基酸，即那些不参与抗体与抗原结合的氨基酸使其与人抗体骨架更相似而实现。考虑人源化有不同的类型或水平。本发明的具体实施方式涉及含非人抗体或其片段的全部区域，更具体是其恒定区用人抗体的恒定区取代的抗体或片段，从而产生嵌合性(如人/鼠)抗体或片段。另一具体实施方式是将抗PLGF的非人抗体的抗原结合氨基酸序列(例如两个或多个CDR)导入人抗体骨架中的抗体(例如，CDR嫁接抗体)。将非人单克隆抗体的结合互补决定区("CDR")与人框架区一具本是人基因的恒定C区联合的方法是技术人员熟知的，例如见Jones等，Nature(1986)321:522或Riechmann，Nature(1988)332:323中所述。或者也可考虑取代本发明的非人抗PLGF抗体的更多个有限数目的氨基酸。本发明的具体实施方式涉及含有图9人源化重链和/或轻链可变区或其一部分的抗体，和含有SEQIDNO:17-22的至少两个，更具体3-5个，最具体所有6个CDR的抗体。本发明其它实施方式涉及的人源化抗体包含的重链和/或轻链可变区分别与SEQIDNO:6和SEQIDNO:8的序列有至少80%，具体至少85%，更具体至少90%，最具体至少95%的序列相同。或者，本发明提供的人源化抗体所含的至少两个，更具体3-4个，最具体6个CDR分别与SEQIDNO:17-22的序列有至少80%，具体至少85%,更具体至少90%，最具体至少95。/。的序列相同。因此，本发明涉及衍生自鼠抗体16D3的人源化抗体和/或嵌合抗体或杂交抗体。在一具体实施方式中，突变鼠抗体16D3的特定氨基酸以消除免疫原性氨基酸。因此，在一具体实施方式中，本发明涉及包含SEQIDNO:2序列的重链可变区部分氨基酸序列的抗原结合分子，该分子中含有以下一个或多个氨基酸改变I2V、P9A、K40A和/或TlllL。另外或或者，衍生自16D3抗体的人源化抗体是含有SEQIDNO:4序列的轻链可变区部分氨基酸序列的抗原结合分子，该分子中含有以下一个或多个氨基酸改变S5T、S9D、，A15L、K18R、R22N禾口/或L89V。因此根据一具体实施方式，本发明提供的抗原结合分子含SEQIDNO:2序列的重链可变区部分氨基酸序列，其中有以下一个或多个氨基酸改变I2V、P9A、K40A禾卩/或T111L。还含SEQIDNO:4序列的轻链可变区部分氨基酸序列，其中有以下一个或多个氨基酸改变S5T、S9D、A15L、K18R、R22N禾口/或L89V。在另一实施方式中，通过将鼠抗体16D3的轻链和/或重链可变区嫁接到人免疫球蛋白框架中或偶联于人抗体恒定区，更具体说人IgG的恒定区(人源化)进一步人源化所述抗体。在该方面尤其适合的是能体内激活自然杀伤细胞的IgGlK。因此在一具体实施方式中，本发明涉及杂交的Hul6D3-IgGlK。本发明的另一实施方式是杂交的Hul6D3-IgG4K杂交体。人lgG抗体(和因此也利用人IgG骨架禾卩/或恒定区获得的杂交抗体)显示半衰期延长，因此能提供非常稳定的血液水平从而可大幅减少给药的频率。此外，采用人源化抗体或衍生物最大程度减少了诱导免疫应答反应的风险。本发明其它实施方式涉及作为抗体16D3或其片段同系物的抗原结合分子，即能结合16D3所结合的相同表位的抗原结合分子。在一实施方式中，所述同系物抗原结合分子通过免疫动物(更具体为小鼠)产生，例如通过给小鼠注射PLGF，随后将其脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合，然后鉴定产生抗PLGF抗体的培养细胞(例如通过筛选与PLGF的结合)并克隆它们。任选根据与16D3表位的反应，或与16D3或其片段的竞争对鉴定的抗体作进一步选择。因此本发明还有一方面涉及产生本发明抗原结合分子的方法。这些方法包括但不限于本文实施例章节中所提供的人源化抗体16D3的方法。本发明还有一方面涉及提供编码本发明的抗原结合分子，更具体说编码其抗原结合区的核苷酸序列。本发明的具体实施方式涉及编码分别由SEQIDNO:2和SEQIDNO:4序列所确定的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列，例如但不限于SEQIDNO:1和SEQIDNO:3的核苷酸序歹ij，此二序列对应于细胞系16D3中编码16D3抗体重链和轻链区的序列。在本发明上下文中还提供编码如序列SEQIDNO:17-22所鉴定的单克隆抗体16D3的一个或多个CDR区的核苷酸序列。本发明的具体实施方式包括编码16D3的scFv和人源化scFv的(核苷酸)序列，例如但不限于分别为SEQIDNO:23和SEQIDNO:25的序列。本发明还提供编码本文所述的16D3的衍生物及其片段的核苷酸。本发明还提供能特异性与上述核苷酸杂交的探针和引物，但不限于实施例章节中所述的引物。本发明还包括与编码本文所述单克隆抗体，其衍生物或片段的序列互补的核苷酸序列。本发明还有一方面涉及本发明抗原结合分子的治疗应用。因此本发明提供本发明抗原结合分子作为药物的应用。在这方面，本发明提供包含至少一种或多种本发明抗原结合分子的药物组合物，以预防或治疗血管发生所导致的疾病或障碍。本发明治疗和/预防血管发生所致疾病或障碍的方法，包括给予需要这种治疗或预防的哺乳动物治疗有效量的含有本文所述至少一种或多种抗原结合分子的组合物。在这些疾病中，所述血管发生也称为"病理性血管发生"。这种病理性血管发生的例子包括在以下器官组织中观察到的血管发生血管(动脉粥样硬化、血管瘤、血管内皮瘤)；骨和关节(类风湿性关节炎、滑膜炎、骨和软骨损伤、骨髓炎、血管翳生长、骨赘形成、赘生物和转移性肿瘤)；皮肤(疣、化脓性肉芽肿、毛发生长、卡波齐氏肉瘤、伤疤瘢痕、过敏性水肿，赘生物)；肝；肾；肺；耳和其它上皮(这些器官的炎症和感染，包括肝炎、肾小球肾炎、肺炎、哮喘、鼻息肉、中耳炎、移植、再生、赘生物和转移性肿瘤灶)；某些子宫、卵巢和胎盘疾病(功能障碍性子宫出血，例如由于子宫内避孕器具，毛囊囊肿形成、卵巢过度刺激综合征、子宫内膜异位、赘生物)；脑和神经疾病(赘生物和转移性肿瘤)；某些心肌和骨骼肌疼痛(例如由于劳累过度)；脂肪组织疾病(肥胖症)和内分泌器官疾病(甲状腺炎、甲状腺肿大、胰腺移植)。病理性血管发生还可导致血细胞生成疾病(AIDS、卡波齐氏肉瘤)，血液恶性肿瘤(白血病等)。许多眼科疾病中，认为病理性血管发生是重要因素，因此可考虑用本发明的抗原结合分子治疗。在视网膜缺血疾病中视网膜供血和供氧减少，视网膜外围部分丧失了营养来源而停止了正常功能。视网膜疾病的共同原因是中央视网膜静脉阻塞、颈动脉狭窄、糖尿病(糖尿病性视网膜疾病)和贫血(镰状红细胞视网膜病)。视网膜疾病也见于早产婴儿(早产网膜疾病)。糖尿病性视网膜疾病是糖尿病病人失去视力的主要原因。在缺血的视网膜中，会长出新的血管(新生血管发生)。这些血管常生长在视网膜表面、视神经、或眼睛的前部虹膜上。这种新血管不能提供所需的营养，反而可导致许多问题，例如玻璃体出血、视网膜剥离和失控性青光眼。这些问题的发生是由于新血管脆弱容易出血。假如在疾病早期阶段，有时可用全视网膜光照凝固法阻止增殖性糖尿病视网膜疾病。但是，在一些病例中，玻璃体切除手术是唯一的选择。认为血管发生起关键作用的其它眼科疾病有脉络膜和其它眼内疾病、白软化(leukomalacia)，和赘生物与转移性肿瘤。脉络膜新血管发生源自脉络膜的新血管生长穿过布鲁赫膜(脉络膜基底膜)中的裂孔进入视网膜下色素上皮或视网膜下空隙。CNV的位置、生长模式和类型(1或2)取决于患者年龄和所患疾病。随着进一步的生长导致的出血和渗出是视觉症状的原因。脉络膜新血管发生(CNV)是视力丧失的主要原因。估计CNV可导致康复期5-10。/。的人发生近视和事实上所有的脉络膜破裂；但15-30%患者中大多数发生自发性复发，CNV可能重新发生并导致出血或严重的黄斑剥离伴视力丧失。术语"肺动脉高压"指肺动脉血压异常升高的疾病。在没有其它心肺疾病时，称为原发性肺动脉高压。由于病理性血管发生产生肺动脉弥散狭窄，随后发生的肺动脉高压是对血流阻力升高的一种反应。其发生率为大于8/10万人。然而，肺动脉高压也可以是慢性阻塞性肺病，例如肺气肿、慢性支气管炎、弥漫性间质纤维化和哮喘样COPD病人的并发症。COPD的发生率约为大于5/l万人。由于血管发生而导致的疾病考虑可用本发明抗原结合分子治疗的例子是炎性疾病群。本文所用的"炎症"指对活组织损伤(即物理、化学或由于感染)的局部不可控反应，尤其是小血管、它们的内含物和它们的相关结构的局部反应。血液成分通过血管壁进入组织是炎症标志，形成的组织聚集定义为分泌物和水肿。任何伤害活组织的有害过程例如有但不限于细菌感染、过热、过冷、机械损伤如挤压、酸、碱、辐射或病毒感染都可导致炎症，不论涉及到器官或组织。这种"炎性疾病"包括的反应范围从烧伤到肺炎、麻风病、结核病和类风湿性关节炎。术后粘连形成(POA)是妇科、骨盆、心脏病外科手术常见的外科并发症。组织的外科创伤常导致创伤组织与其相连器官的永久性瘢痕形成。因此在这种创伤部位，正常情况下保持分离的内部组织常粘连在一起。粘连形成(adhesionformation)产生的并发症有肠梗阻、小肠梗阻、慢性盆腔疼痛和妇女不育。术语"粘连形成"的医学含义指共凝结、两表面或两部分的粘连或合并过程。例如，伤口的相对表面或腹膜的相对表面结合在一起。粘连的复数词还指连接相对浆膜表面的炎症带。本文所用术语"粘连"还包括纤维性粘连，这种粘连是由血浆或淋巴渗出，或血液外渗而产生的纤维蛋白细丝组成。瘢痕瘤，创伤区域偶然自发性生长过度的光滑纤维组织也是一种粘连形式。已证明抑制胎盘生长因子(PLGF)可导致明显抑制手术后的粘连形成(W003063904)。此外，己证明以骨吸收为特征的疾病，例如但不限于骨质疏松也可受益于抑制PLGF(W02004002524)。因此，根据具体实施方式本发明的抗原结合分子特别适合于治疗和/或预防肿瘤生长和转移、眼科疾病、炎症、粘连形成和肺动脉高压。本发明另一具体实施方式涉及用本发明的抗原结合分子预防和/或治疗癌症，例如但不限于乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、肾癌、子宫癌和骨髓癌。更具体说，本发明涉及用本发明的抗原结合分子预防和/或治疗实体肿瘤，例如但不限于结肠癌、乳腺癌、胰腺癌和黑色素瘤。本文中还提供了更具体的数据证明本发明的抗体特别适合于消退人胰腺肿瘤。本发明的抗体还已证明能显著地减少体内肿瘤的大小，证明能减少肿瘤体积达50%。因此本发明提供了减少肿瘤至少20%，更具体至少30%，最具体至少50%的方法和药物组合物。本发明另一具体实施还涉及用本发明的抗原结合分子治疗或预防骨疾病，更具体说治疗骨吸收增强疾病，例如骨质疏松或骨软化症。因此，本发明涉及本发明的抗原结合分子在制备治疗上述疾病的药物中的应用。本发明一个重要方面是用所述抗体、其片段和衍生物允许治疗和/或预防上述疾病而不产生其它抗血管发生治疗，更具体说，其它靶向血管发生因子的治疗，例如VEGF所导致的或预期可导致的副作用。早在1999年用重组人抗VEGF抗体的临床前安全试验已证明抑制VEGF可导致抑制生理性血管发生，更具体说纵向骨生长中的新血管发生和黄体形成(Ryan等，1999，Toxicologicpathology27(1):78-86)。近年研究报导VEGF抑制剂导致健康气管和甲状腺中的血管消退，这将导致器官功能障碍(Baffert等，2004，CircRes94:984-992;Inai等，2004AmJPathol165:35-52)。然而贝伐单抗(bevacizumab)，一种近年投放市场的作为血管发生抑制剂的抗人VEGF抗体，由于这种抗血管发生方法对肿瘤消退具有总体疗效，尽管观察到其对创伤愈合、血压和血栓形成有危险影响。本发明的抗PLGF抗体及其衍生物能抑制不良血管发生而对血压、创伤愈合、血栓形成危险和健康器官的血管消退没有可见的副作用。本发明一具体实施方式涉及包含活性成分单克隆抗体16D3或其片段或衍生物，与药物学上可接受的运载体混合的药物组合物。本发明的药物组合物包括治疗有效量的一种或多种抗原结合分子。类似地，本发明提供的治疗和预防方法包括给予治疗有效量的一种或多种本发明的抗原结合分子。本文所用的治疗有效量指治疗哺乳动物的用量范围为约每千克体重0.5mg(mg/kg)到约50mg/kg，更具体为约l-10mg/kg。应知道，鉴于大多数人IgG抗体的半衰期较长，本发明的抗原结合分子是这种类型的单克隆抗体，这将使患者享受舒服的定期治疗。本发明另一个方面提供的药物组合物包含本发明的抗原结合分子和其它抗血管发生药，提供的治疗方法是同时或依次给予本发明的抗原结合分子和其它抗血管发生药。实际上，本发明证明了本发明的抗原结合分子和其它抗血管发生药，例如抗VEGF抗体联用对抑制肿瘤生长具有叠加效果。更具体说，证明了联用本发明的16D3抗体和Avasth^能够减少肿瘤体积约达70。/a，而不论增加单用的Avastir^还是增加单用的抗PLGF抗体剂量都不能在相同条件下达到肿瘤体积减少高于55。/。。本领域技术人员熟知适当的其它抗血管发生产品，它们的使用剂量也取决于它们所属的种类。抗血管发生药的例子包括直接作用于VEGF的VEGF抑制剂，例如商品名为AvastinTM的抗VEGF抗体或作用于VEGF受体的抗体。本发明的抗体使已知会诱导许多上述副作用的VEGF抑制性抗血管发生药的用量减少成为可能。本发明的药物组合物还包含治疗有效量的其它抗所治疗疾病的活性化合物/药物，更具体说包含治疗肿瘤生长、炎症、眼科疾病和肺动脉高压的其它化合物和药物。本发明药物组合物中使用的适当药物运载体在《雷明顿药物科学》(Remington'sPharmaceuticalSciences)第16版(1980)中有所描述，它们的配制是本领域技术人员所熟知的。它们包括任何和所有的溶剂、分散剂、包衣、抗菌剂和抗真菌剂(例如酚，山梨酸，三氯叔丁醇)、等渗剂(例如糖或氯化钠)等。也可包括其它成分以控制该组合物中单克隆抗体活性成分的持续作用时间。因此，通过选择合适的聚合物载体，例如聚脂、聚氨基酸、聚乙烯吡咯垸酮、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白等而获得控释组合物。也可以通过将单克隆抗体活性成分掺入颗粒中，例如聚合物基质，如水凝胶、聚乳酸、羟甲基纤维素、聚甲基丙烯酸甲酯和其它上述聚合物的微胶囊中来控制药物释放速率和作用持续时间。这些方法包括胶体药物递送系统，例如脂质体、微球、微乳剂、毫米微球、毫米微乳液、纳米颗粒、纳米胶囊等等。根据给药途径，包含活性成分的该药物组合物可能需要保护性包衣。适合注射用的药物包括可即时制备制剂的无菌水溶液或分散剂和无菌粉剂。因此通常的运载体包括生物相容的缓冲水溶液、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇和它们的混合物。本发明的抗原结合分子可以本领域熟知的任何方法提供给病人，即口服、鼻内、皮下、肌肉内、皮内、静脉内、动脉内、肠胃道外或插入导管方法。根据本发明的一具体方面，本发明的抗原结合分子通过基因治疗给予。基于基因治疗的抗体可克服与给予抗体相关的许多可能的限制，例如大规模生产、生物学干扰、单价抗体的快速血液清除和低保留。体内生产的抗体免疫原性弱更易耐受，能产生有效和持久水平的抗原结合分子或其片段。此外遗传学方法有可能提供具有新功能的抗原结合分子。已证明用病毒载体体内转移基因体内不同的细胞或组织产生和全身性递送单克隆抗体具有可行性(Pelegrin等，2004，GeneTher4:347-356)。还已证明经用含有抗血管发生活性的抗层粘连蛋白抗体基因修饰纤维肉瘤细胞可以减少体外和体内的肿瘤生长(Sanz等，2001，CancerImmunolImmunother50:557-565)。因此，根据这种实施方式，本发明提供治疗以本文所述病理性血管发生为特征疾病的基因治疗所用的抗原结合分子的编码核苷酸。具体说，本发明提供了用于基因治疗的包含编码SEQIDNO:2序列所确定的重链可变区核苷酸序列和/或SEQIDNO:4序列所确定的轻链可变区核苷酸序列的组合物。更具体说，本发明提供的组合物包含细胞系16D3中与编码抗体16D3重链和轻链区的序列相对应的SEQIDNO:l和/或SEQIDNO:3的核苷酸序列。包含编码SEQIDNO:17-22所确定的单克隆抗体16D3的一个或多个CDR区的核苷酸序列的本发明组合物也属于本发明的内容。本发明的具体实施方式包括编码16D3的scFv和人源化scFv的序列，例如但不限于分别为SEQIDNO:23和SEQIDNO:25的序列。本发明的治疗和/或预防方法可包括以药物组合物名称给予，优选顺序给予病人治疗有效量的上述抗血管发生或抗肿瘤药物以进一步治疗和或预防相同的病理性血管发生疾病。本文所用的顺序给药指将本发明的配体和已知的抗血管发生药依次而不是同时给予患者。本发明还有一方面涉及用本发明的抗原结合分子免疫学检测人样品中的PLGF和作为适合于这种检测的试剂盒成分。抗原的免疫学检测方法是本领域所熟知的，包括但不限于ELA，ELISA和RIA和免疫组织化学方法。可以间接检测本发明的鼠抗体与PLGF抗原的结合，例如通过标记的抗鼠抗体检测。或者，可以直接标记抗体或其片段。本发明这方面的具体实施方式涉及在鉴定对用抗PLGF治疗敏感的病人中采用抗PLGF的抗体和其抗原结合片段。这在癌症治疗中特别有意义。本发明还有一方面涉及用本发明的抗原结合分子作为诊断工具。本领域已证明在许多疾病中PLGF表达上调。更具体说，已证明许多肿瘤过量表达PLGF。可用本发明的人源化抗体或抗体片段来诊断这些疾病，例如通过标记本发明的抗体或抗原结合片段使其在体内可被观察的成像技术。用于本发明抗原结合分子体内结合成像的各种标记是本领域熟知的，包括但不局于光(荧光)、金属和磁性标记，各需要专门的(辐射和)检测仪器。本发明此方面的具体实施方式涉及用本发明的抗体来预测疾病发展和决定治疗方案。本发明还有一方面涉及在动物模型中用本发明的抗原结合分子筛选与抗PLGF治疗联用的化合物。考虑这种模型包括但不限于人肿瘤细胞在nu/nu小鼠中的生长和发育的肿瘤模型。将待测化合物和本发明的抗体或片段联合给药可以鉴定所述化合物是否对本发明的抗体或片段单独给药时所观察到的效果有加成作用。其它方面例如也可用这种方法检测化合物与抗PLGF抗体联用有无反作用或毒性。除上述治疗应用外，可用本发明的上述核苷酸序列来产生抗体和其它抗原结合分子，例如通过重组技术。因此，本发明还提供了产生重组抗体和抗体片段的方法，包括克隆和操作抗体基因，用上述核苷酸序列产生scFv和其它抗原结合分子。这些方法的程序本领域已有。另外，可采用能特异性与本发明核苷酸序列杂交的探针来筛检本发明抗体和抗体片段的表达。本发明将通过以下实施例作进一步描述，提供这些实施例的唯一目的是说明本发明。实施例实施例l-鼠抗人PLGF抗体(16D3)的产生和鉴定1.小鼠免疫和融合抗人PLGF单克隆抗体的产生基本上如Galfre和Milstein所述(Galfr6F，MilsteinC.《单克隆抗体的制备策略和程序》(Preparationofmonoclonalantibodies:strategiesandprocedures).MethodEnzymol1981;73:3-46)。简单说，给PLGF基因敲除小鼠(Lu加n等，2002，BiochemBiophysResComm295(2):428-34，Ca腦liet等，(2001)，NatMed7:575-593或WO01/85796)皮下注射50pg用弗氏完全佐剂配制的重组人PLGF-2(毕赤酵母菌生产)进行免疫，两周后皮下注射50叫用弗氏不完全佐剂配制的重组人PLGF。10天后从老鼠尾部收集血样品(约lOOfil)。用ELISA检测血清中的抗PLGF抗体，用包被人PLGF抗原的的微量滴定板捕捉该抗体，采用稀释血清(l/500-l/80000)和偶联辣根过氧化物酶(HRP)的羊抗小鼠IgG检测。在至少间隔6周之后，用盐水配的50吗重组人PLGF腹腔加强免疫小鼠(高阳性反应)，4-2天后进行细胞融合。分离脾细胞与Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞融合。用含次黄嘌吟、氨四呓呤、胸腺嘧啶脱氧核苷的培养基选择后，如上所述将阳性克隆的培养上清加入ELISA进行筛选。2.在ProSepvAUltra上纯化抗体按照制造商提供的程序在ProSepvAUltra(Milipore)上进行亲和层析纯化细胞培养上清液中的抗体。简单地说，将150mMNaCl加入上清中上样到已用PBS预平衡的ProSepvAUltra柱上。用PBS洗涤层析柱和用0.1M甘氨酸pH2.8洗脱结合蛋白。用PBS透析洗脱蛋白。分别用还原和非还原条件的SDS-PAGE检査纯化的洗脱蛋白。3.16D3/hul6D3(如实施例2所述获得)与PLGF的结合(参见图1)4。C用PBS配的l吗/mlhuPLGF-2(Pichia)包被ELISA板，100fil/孔。室温用1%的BSA封闭1小时后，加入16D3/hul6D3的系列稀释液，100^/孔，室温使抗体结合1小时。室温用羊抗人或羊抗鼠IgG-HRP(Sigma)，脚l/孔，1小时检测结合的16D3。该试验用OPD显色。4.抑制PLGF与huFlt-l受体的结合(参见图2)4。C用l吗/mlhuPLGF-l(R&DSystems)包被ELISA板，2(K)(il/孔。室温用1%的BSA封闭1小时后，加入16D3/hul6D3的系列稀释液，10(^1/孔，并加入100^1/孔的huPLGF-2。室温孵育2小时后，室温用羊抗人huPLGF，180|_11/孔，1小时，随后与RAG-HRP(DAKO)孵育1小时检测结合的PLGF。该试验用OPD显色。5.用Biacore试验进一步鉴定16D3和Fab16D3*抑制:利用EDC/NHS化学试剂将rhuPLGF-2(Pichia，TX)固定于CM5芯片上，给予412RU。注入16D3后注入rhuFlt-l/Fc嵌合体(R&DSystems)。也用缓冲液替代鼠抗体实施此试验。在阴性对照流体通道中也注入此二种物质并已扣除其值。此试验用pH9.6磷酸盐缓冲液进行。将rhuFlt-l和rhuPLGF-2的最大结合进行比较，如果先注射16D3或16D3Fab则rhuFlt-I的信号减弱(图3)。6.鼠16D3可变区的克隆和测序mRNA分离:用QuickPrep微小mRNA纯化试剂盒(AmershamBiosciences)分离16D3杂交瘤细胞的mRNA。用第一链cDNA合成试剂盒(AmershamBiosciences)中的pd(N)6引物来制备该mRNA的cDNA。皿重链和轻链可变区的序列通过用以下引物的组合进行PCR获得8个引物开始于前导序列，2个引物开始于重链恒定区，ll个引物开始于前导序列，l个引物开始于轻链恒定区。用不同的引物组合进行8次和11次PCR反应。扩增抗体16D3重链所用引物MHVR35'-ATGGRATGCJAGCTGKATCWTTHTC-3，(SEQIDNO:9)MHCR15，-CASACAGGGGCCAGTGGATAGAC-3，(SEQIDNO:10)扩增抗体16D3轻链所用引物MKVR35'-ATGRAGTCACAKACYCAGGTCTTYRTA'3'(SEQIDNO:11)5'-GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGG-3'(SEQIDNO:12)PCR设定94。C变性10分钟，94"变性30秒，55。C退火30秒，72。C延伸1分钟，72。C延伸5分钟，30轮循环。SEQIDNO:9-11的序列中的丰余度用常规縮写R=A或G，K=G或T，W=A或T，H^A或C或T，S^C或G，YK:或T，M-A或C表示。克隆和测序:将PCR产物加到琼脂糖凝胶上，选择亮带，纯化(QIAquicl,凝胶抽提试剂盒，QiagenGmbH)并克隆入ZeroBluntTOPOPCR克隆试剂盒提供的PCR⑧4Blunt-TOPO⑧载体中用于测序(InvitrogenTMlifetechnologies)。用高纯度质粒分离试剂盒(RocheDiagnosticsGmbH)制备质粒DNA，插入序列用T7和M13反向引物在ABIPRISM310(PEAppliedBiosystems)上测序。抗体16D3重链和轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列在SEQIDNos1，2，3和4中列出(参见图11)实施例2-人源化抗人PLGF抗体的产生和鉴定1.人源化16D3的构建可变区的人源化制作以下突变以人源化鼠抗体16D3的可变区部分:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>用QuickChange⑧多点定向诱变试剂盒(Stratagene,制作突变。在1PCR中采用含突变的l-5个引物。挑出转化的菌落测定其DNA序列确定含最多点突变的克隆。取此克隆重复此程序直至其序列中存在所有的突变。连接可变区与人IgG恒定区进行PCR以获得加入了适当限制性位点的人源化重链和轻链可变区轻链可变区的引物ji,.、J、，(SEQIDNO:14)重链可变区的引物引物3:5'-CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTG-3,(SEQIDNO:15)弓I物4:5'-GATGGGCCCT丁GGTCGACGCTGAGGAGACTGTGAGCAGG((SEQIDNO:16)PCR设定94t:变性5分钟，94。C变性30秒，6(TC退火30秒，72。C延伸30秒，72"C延伸5分钟，25轮循环。将PCR产物加到琼脂糖凝胶上，选择条带并纯化(QIAquid^凝胶抽提试剂盒，QiagenGmbH)。用Sail消化16D3重链可变区的PCR产物，用Eco47IH和Sail酶切含人抗体(IgG4)重链完整恒定区的载体pKANEO-MCS50-Hleu-vartt24并连接。先将轻链可变区的PCR产物克隆入由ZeroBluntTOPOPCR克隆试剂盒提供的PCR4Blunt-TOPO⑧载体中进行测序(InvitrogenTMlifetechnologies)。用Agel和BsiWI酶切轻链可变区将其克隆入已含人k轻链恒定区的载体pKANEO-CM30-L-var井7中。用Pmel和Pacl酶切从该载体中取出轻链表达盒将其加入到含重链的载体从而将两个载体装配成一个载体人源化抗体16D3的重链和轻链可变区核苷酸和氨基酸序列在SEQIDNo5，6，7和8中列出(参见图12)。2.Hul6D3的瞬时表达按制造商说明书用FreeStyle293表达系统(Invitrogen)在HEK293细胞内瞬时表达hul6D3IgG4K。在proSepvAUltra仪上用亲和层析纯化上清液中的hul6D3。纯化的hul6D3分别用还原和非还原条件的SDS-PAGE述核査纯度。用ELISA进一步检测hul6D3与huPLGF的结合和对HuFLT-l/huFLT-l结合的抑制。实施例3-体内研究抗PLGF抗体抑制肿瘤生长1.材料和方法概述细胞培养小鼠胰腺细胞系Panc02和人胰腺细胞系DanG为S.Rosewicz赠送(Char股-UniversitatsmedizinBerlin,德国)。人乳腺MDA-MB、结肠LOVO和黑色素瘤细胞系获自美国典型培养物保藏中心(ATCC;Manassas,VA，USA)。所有细胞都按推荐方法培养。在所有体内试验中采用鼠16D3抗PLGF抗体以避免产生对该抗体的免疫应答。动物试验所有动物试验程序完全获得动物保护和使用委员会的批准。雌性NMRInu/nu小鼠饲养在半无菌条件下，常规使用8-10周龄小鼠(大约体重25g)，为了制备肿瘤来源，用胰蛋白酶处理肿瘤细胞制备单细胞悬液，用PBS洗涤。将离心沉淀细胞重悬于200^1PBS并注射入小鼠右腹皮下。对于常位胰腺肿瘤模型，通过腹侧剖腹将含1X106个肿瘤细胞的30|ilPBS注射入9-10周龄雌性C57B16小鼠胰腺头部。在操作之前，用氯胺酮(卯mg/kg体重)和甲苯噻嗪(9mg/kg体重)麻醉小鼠。药物给药(例如抗体、运载体等)当肿瘤体积达到约60mm3时开始用抗体或对照运载体治疗。每隔一天按所示剂量腹膜内给予抗体P15D11D4(W001/85796)、16D3、1C8或运载体。每周两次按所示剂量腹膜内注射Avastin。肿瘤测量每隔一天用卡尺测量皮下生长的肿瘤，用公式p/6(wlXw2Xw3)计算肿瘤体积，此式中"wl"和"w2"分别代表肿瘤的最大和最小直径。当处死小鼠时，用相同方法测量腹膜剖腹后胰腺的常位生长肿瘤。统计学分析为了成对观测，利用GraphPad统计学软件(GraphPadSoftwareInc.，San-Diego，CA)以双尾斯氏t检验进行统计学分析。除非另有指明，所有数据表示为平均值士SEM。除非另有指明，*p<0.5，**p<0.01。2.鼠抗-hPLGF抗体16D3抑制人胰腺DanG皮下异种移植肿瘤模型的肿瘤生长将1乂106个肿瘤细胞注射入11周龄雌性NMRInu/nu小鼠的右腹皮下。当肿瘤体积达到约60mm3时，开始用抗-hPLGF(16D3，50mg/kg体重;n=10)、抗-mPLGF(PL5D11D4，按WO01/85796所述获得，50mg/kg体重；n=10)、对照IgG(lC8;50mg/kg体重；n=10)、抗-hPLGF和抗-mPLGF联用(各25mg/kg体重；11=10))和运载体(11=10)治疗。每隔一天腹膜内(i.p.)注射抗体。(A)每隔一天测量肿瘤和用公式W1XW2XW2Xp/2计算肿瘤体积，此式中"W1"和"W2"代表肿瘤的最大和最小直径。(B)肿瘤接种后18天处死小鼠，切下肿瘤并称重。平均肿瘤体积运载体915士卯mm3，IgG:士89mm3，PL5D11D4:832土118mm3，16D3:521士83mm3，PL5D11D4+16D3:497土86mm3。结果见图4，表明给予抗人PLGF抗体16D3对肿瘤重量和大小有明显的影响。3.抗-hPLGF以剂量依赖方式下抑制人胰腺DanG皮下异种移植肿瘤模型中的肿瘤生长将1乂106个肿瘤细胞注射入11周龄雌性NMRInu/nu小鼠的右腹皮下。当肿瘤体积达到约60mm3时，用抗-hPLGF、IgG(lC8;50mg/kg)、16D3(50mg/kg、37.5mg/kg、25mg/kg、12.5mg/kg体重，对于各种浓度11=10)和运载体(11=10)治疗。(B)肿瘤接种后18天处死小鼠。结果见图5，平均肿瘤体积值士SEM:16D3，50mg/kg体重450士37mm3;37.5mg/kg体重469±97mm3;25mg/kg体重493±107mm3;12.5mg/kg体重693±107mm3;IC8:865±109mm3;运载体889±100mm3。4.抗-huPLGF抑制皮下人乳腺MDA-MB异种移植肿瘤模型中的肿瘤生长将1乂107个肿瘤细胞注射入11周龄雌性NMRInu/nu小鼠的右腹皮下。当肿瘤大小达到约60mm3后，用抗-hPLGF、16D3(50mg/kg体重；11=10)和运载体(11=10)治疗。结果见图6(和下表1)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>5.抗-huPLGF抑制人结肠LOVO皮下异种移植肿瘤模型中的肿瘤生长将1乂107个肿瘤细胞注射入11周龄雌性NMRInu/nu小鼠的右腹皮下。当肿瘤大小达到约60mm3后，用抗-hPLGF、16D3(50mg/kg体重；11=10)和运载体(11=10)治疗。结果见图7和下表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>6.抗-huPLGF抑制人黑素瘤Mel2a皮下异种移植肿瘤模型中的肿瘤生长将2乂106个肿瘤细胞注射入11周龄雌性NMRInu/nu小鼠的右腹皮下。当肿瘤大小达到约60mm3后，用抗-hPLGF、16D3(50mg/kg体重；n-10)和运载体(^10)治疗。结果见图8和下表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>实施例4:体内研究用16D3抗体治疗对体重减轻的影响材料和方法如实施例3所述将1乂106个肿瘤细胞注射入11周龄雌性NMRInu/nu小鼠的右腹皮下。当肿瘤大小达到约60mm3时，用抗-hPLGF(16D3，50mg/kg体重；每种浓度n=10)、抗-mPLGF(PL5D11D4;50mg/kg体重；n=10)、对照IgG(lC8;50mg/kg体重;n=10)、抗-hPLGF和抗-mPLGF联用(每种25mg/kg体重；r^lO)和运载体(『10)治疗。每隔一天i.p.注射抗体。在抗体治疗的第一天和最后一天测量小鼠体重。从体重中扣除肿瘤重量后再计算体重减轻的百分比。结果见图9。表明抗-hPLGF能防止人胰腺DanG皮下异种移植肿瘤模型中的动物体重减轻。实施例5:联用抗-hPLGF和抗-VEGF抗体治疗肿瘤生长材料和方法如实施例3所述。将1乂106个肿瘤细胞注射入11周龄雌性NMRInu/nu小鼠的右腹皮下。当肿瘤大小达到约60mm3时，用抗-hPLGF(16D3，50mg/kg、37.5mg/kg、12.5mg/kg体重，每隔一天i.p.注射，各种浓度n40)、Avastin(各15mg/kg和5mg/kg体重，一周两次i.p.注射，n-10)以及联用抗-hPLGF(12.5mg/kg体重)与Avastin(5mg/kg体重，n-10)进行治疗。肿瘤接种后20天处死小鼠。结果见图10。平均肿瘤体积土SEM:1C8，37;37.5mg/kg体重954il64mm3;12.5mg/kg体重1398±236mm3;IgG:1789±231mm3;Avastin:15mg/kg体重828±186mm3;5mg/kg体重926±202mm3;Avastin+16D3:569±94mm3;观察到抗匿PLGF和Avastin对抑制人胰腺DanG皮下肿瘤的生长显示了叠加作用。实施例6:产生16D3的scFv用含合适限制性结合位点和接头的引物PCR扩增重链和轻链可变区序列(按实施例1所述，分别获得SEQIDNO:2和4)。在SOEPCR(通过重叠延伸进行基因剪切)后将scFv克隆入pEE14.4(HindlII-EcorRI克隆位点)(图12)。以BamHI线性化后用Fugene6(BoehringerMannheim)和两次稀释亚克隆将scFvhpl6D3/pEE14.4转染入CH-KI细胞。获得并产生了单克隆scFvhpl6D3，6C5D4。将此克隆也用Producell与scFvhpl6D3/pKANEO-MCS50-dhfrl(Nhel-Notl克隆位点)平行瞬时转染293细胞(图13)。16D3scFv的核苷酸和氨基酸序列分别在序列SEQIDNO:23和SEQIDNO:24中列出。图15还提供了重链和轻链可变区、接头序列、HA-标签和His尾的氨基酸序列。实施例7:scFvl6D3的人源化如实施例2所述进行scFv可变区的人源化。人源化16D3scFv的核苷酸和氨基酸序列分别在序列SEQIDNO:25和SEQIDNO:26中列出。图15还提供了人源化scFv的重链和轻链可变区、接头序列、HA-标签和His尾的氨基酸序列。实施例8:产生人源化的Fab16D31.扩增人源化16D3scFv的VH和VL片段用于扩增人源化16D3scFv的VH片段的引物—16.D3VhbackWunt5:-CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTG-3"(SEQIDNO:27)16D3VhforSal15，-GATGGGCCC丁TGGTCGACGCTGAGGAGAC丁G丁GAGCAGGG-3，(SEQIDNO:28)用于扩增人源化scFvl6D3的VL片段的引物___16D3VLBackAgd5'-CCACCGGTCACATTGTGCTCACCCAGTC:TCC-3，(SEQIDNO:29)歸3VLForBsiW!5'-CACCGTACGTTTTATTTCCAACTTTGTCCCCGAG-3，(SEQIDNO:30)2.构建重链和轻链载体先将轻链的PCR产物克隆入pCR4blunt-TOPO载体中，测序后用Agel和BsiWI消化取得轻链将其克隆入pKANEO-CM30-Lvar弁7载体中。将重链PCR产物消化后直接克隆入pKANEO-MCS50-Fabvar弁3载体中。3.连接重链与轻链构建物用酶Pmel和Pad通过取出含轻链区段的表达盒将其加入到含重链区段的载体中，将含轻链和重链区段的两个载体(上文所述)连接在一起获得最终构建物hpl6D3mutcmplFab/pKANEO-MCS50-Fabvar#3。(参见图16)实施例9:分析scFv16D3和人源化scFv16D3与PLGF/flt-1的抗结合和抑制反应(图14)1.抗原结合ELISA4。C用含lpg/mlhuPLGF-l的PBS包被ELISA板，200|_11/孔。室温用1。/。BSA封闭1小时后，加入scFv16D3/人源化scFv16D3的系列稀释液，200pl/L，室温让抗体片段结合l小时。室温与鼠抗HA然后与羊抗鼠IgG-HRP(Sigma)，170^1/孔培育1小时检测结合的scFv16D3。此试验用OPD显色。2.通过ELISA检测对PLGF/Flt-1相互反应的抑制4。C用l|ag/mlhuFlt-l(R&DSystems)包被ELISA板，200fil/孔，。室温用1%BSA封闭1小时后，加入scFvl6D3/人源化scFvl6D3的系列稀释液，100|11/孔，再另外加入100pl/孔的huPLGF-2。室温培育2小时后，室温用羊抗人PLGF(R&DSystems),180^1/孔，反应1小时，然后室温与RAG-HRP(DAKO)培育1小时，检测结合的PLGF。此试验用OPD显色。实施例10:分析人源化Fab16D3的抗原结合和对PLGF/flt-l相互反应的抑制1.抗原结合ELISA4。C用含l吗/mlhuPLGF-l的PBS包被ELISA板，脚l/孔。室温用1%BSA封闭1小时后，加入人源化Fab16D3的系列稀释液，100W/L，室温让抗体片段结合1小时。用抗-huIgG-HRP(Fab特异性)(100pl/孔，1小时，室温)检测结合的人源化Fab16D3。此试验用OPD显色。结果见图17A。2.通过ELISA检测对PLGF/Flt-1相互反应的抑制4。C用ljig/mlhuFlt誦l(R&DSystems)包被ELISA板，200^1/孔。室温用1%BSA封闭1小时后，加入人源化Fab16D3的系列稀释液，100lil/孔，再另外加入100^1/孔的huPLGF-2。室温培育2小时后，室温用羊抗人PLGF(R&DSystems),180^1/孔，反应1小时，然后室温与RAG-HRP(DAKO)培育1小时，检测结合的PLGF。此试验用OPD显色。结果见图17B。实施例ll.检测Kn值用Biacore检测16D3、人源化16D3IgG4、人源化scFvl6D3和人源化Fabl6D3的Kd僮。结果见下表4。表4:Kd信小結表<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>16D3、人源化16D3IgG4、人源化scFvl6D3和人源化Fabl6D3的Kd信权利要求1.一种能结合PLGF的抗原结合分子，其特征在于，所述分子包含选自SEQIDNO17-22的至少两个CDR或与其有至少90％序列相同性的至少两个序列。2.如权利要求1所述的抗原结合分子，其特征在于，所述分子包含的CDR区对应于序列SEQIDNO:17-SEQIDNO:22或与其有至少90%序列相同性的序列。3.如权利要求1或2所述的抗原结合分子，其特征在于，所述抗原结合分子选自Fab、Fab，或F(ab')2、至少两个互补决定区(CDR)的组合、可溶性或膜锚定单链可变区、或单链可变结构域。4.如权利要求1或2所述的抗原结合分子，其特征在于，所述分子包含的重链可变区包含序列SEQIDNO:2或在其CDR区与其有至少90%序列相同性的序列，且该分子包含的轻链可变区包含序列SEQIDNO:4或在其CDR区与其有至少80%序列相同性的序列。5.如权利要求l-4中任一项所述的抗原结合分子，其特征在于，所述分子是由保存号为LMBP6399CB的细胞系产生的抗体16D3或其片段。6.如权利要求l-4中任一项所述的抗原结合分子，其特征在于，所述分子是人源化抗体或抗体片段。7.如权利要求1-4中任一项所述的抗原结合分子，其特征在于，所述分子是人/小鼠杂交抗体或抗体片段。8.如权利要求1-4中任一项所述的抗原结合分子，其特征在于，所述的CDR区嫁接在人抗体骨架上。9.如权利要求8所述的抗原结合分子，其特征在于，所述人抗体是IgGlK或IgG4K。10.如权利要求1或2所述的抗原结合分子，其特征在于，所述分子是结合PLGF的单链可变区片段，其包含选自序列SEQIDNO:17-22的至少两个CDR或者与其有至少80。/。序列相同性的至少两个序列。11.如权利要求10所述的抗原结合分子，其特征在于，所述分子包含氨基酸序列SEQIDNO:24。12.如权利要求11所述的抗原结合分子，其特征在于，所述分子是人源化抗原结合分子。13.如权利要求12所述的抗原结合分子，其特征在于，所述分子包含氨基酸序列SEQIDNO:26。14.一种能产生权利要求1或2所述抗原结合分子的细胞系。15.如权利要求14所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系的保藏号为LMBP6399CB。16.—种用于预防或治疗哺乳动物病理状态中的不良血管发生的药物组合物，其特征在于，所述组合物包含作为活性成分的如权利要求1-13中任一项所述的PLGF结合分子与药学上可接受的载体的混合物。17.如权利要求16所述的药物组合物，其特征在于，还包含治疗有效量的另一种抗血管发生药。18.如权利要求17所述的药物组合物，其特征在于，所述其它抗血管发生药选自VEGF禾口bFGF抑帝'J齐U。19.如权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，所述VEGF抑制剂是抗VEGF抗体。20.—种编码权利要求1-13中任一项所述的抗原结合分子的多核苷酸。21.—种治疗和/或预防哺乳动物病理状态中的不良血管发生的方法，其特征在于，所述方法包括给予需要这种治疗或预防的哺乳动物治疗有效量的如权利要求1-13中任一项所述的一种或多种抗原结合分子作为活性成分。22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述病理状态选自癌症、炎症、粘连形成、眼科疾病、肺动脉高压和血管渗漏。23.如权利要求22的所述的方法，其特征在于，所述癌症选自结肠癌、乳腺癌、胰腺癌和黑色素瘤。24.如权利要求1-13中任一项所述的抗原结合分子在免疫学检测人样品PLGF中的应用。25.如权利要求1-13中任一项所述的抗原结合分子在筛选癌症治疗对PLGF抑制具有加强作用的化合物中的应用。26.如权利要求1-13中任一项所述的抗原结合分子作为体外诊断工具的应用。27.如权利要求1-13中任一项所述的抗原结合分子在制造用于治疗和/或预防哺乳动物病理状态中的不良血管发生的药物中的应用。28.如权利要求27所述的应用，其特征在于，所述疾病选自癌症、炎症、粘连形成、眼科疾病、肺动脉高压和血管渗漏。29.如权利要求28所述的应用，其特征在于，所述癌症选自结肠癌、乳腺癌、胰腺癌和黑色素瘤。全文摘要本发明提供新型抗PLGF单克隆抗体及其片段和衍生物，更具体说提供人源化抗体及其片段，用于治疗和/或预防病理性血管发生。文档编号C07K16/22GK101184776SQ200680009327公开日2008年5月21日申请日期2006年3月24日优先权日2005年3月24日发明者D·科伦,J·-M·斯塔森,P·卡姆雷特申请人:斯路姆基因公司;生命科学研究合伙有限公司;福拉姆斯大学生物技术研究所Vzw