新型整合子In1288的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新的整合子In1288，其序列如SEQ ID NO.1所示。该整合子是在一种耐药阴沟肠杆菌ECL2236的基因组中发现的。因此本发明的上述整合子的发现一方面对从基因水平上探讨细菌耐药性转移的分子机制具有重要的理论和实践意义；另一方面为临床用药提供了一定的指导作用，有利于临床上减少某些抗菌药物的使用，降低该类耐药基因盒水平转移的选择压力，防止耐药细菌的爆发性流行。
【专利说明】
新型整合子I n1288
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学技术及耐药细菌监测领域，设及一种新发现的与阴沟肠杆 菌耐药性密切相关的整合子。
【背景技术】
[0002] 阴沟肠杆菌广泛存在于自然界中，在人和动物的粪便、水、泥±、植物中均可检出， 是肠道正常菌种之一的条件致病菌。阴沟肠杆菌已成为医院感染越来越重要的病原菌，其 引起的细菌感染性疾病，常累及多个器官系统，包括皮肤软组织感染、泌尿道感染、呼吸道 感染W及败血症等;随着抗菌药物的广泛应用，阴沟肠杆菌多药耐药的菌株不断出现，严重 影响人类健康。
[0003] 整合子（integron)是一个具有捕获外源基因并使之转变为功能性基因的表达单 位，起源于细菌的基因突变，是运动性的DNA分子。整合子依据整合酶序列的不同可分成多 种不同的类型。I类整合子至今发现在革兰阴性菌中广泛分布、检出率最多。I类整合子的基 本结构由3部分组成，两端是一段高度保守序列，分别称作5 ' -CS和3 ' -CS，左右分别被反向 重复末端序列Iri与编码溶解tniR的基因隔开，中间为可变区。5'-CS区有一个编码整合酶 的inti基因、一个基因重组位点atti及启动子。inti基因负责催化atti和attC上的基因盒 的整合及切除。整合子在5'-CS末端均保持高度的相似性。3'-CS端由于某些基因的插入或 删除，使3 ' -CS端长度不定，有的整合子没有3 ' -CS。在3 ' -CS区域常见的有3个0RF:季锭盐化 合物及漠化乙晚的耐药基因 （qacE A 1)、横胺耐药基因（sull)、功能不明的0RF5。每个基因 盒由一个结构基因（多为耐药基因）及与3'末端邮邻的一个反向重复序列attC组成。attC为 59bp片段，尽管attC位点的长度从57bp到141bp不等，但它们都有共同特点：attC位点的两 端分别有一个7个碱基对片段，运两个片段分别被称为核屯、位点和反向核屯、位点。59bp特殊 结构为基因盒插入及基因盒功能表达提供了重要的结构基础。整合子是一种可移动的基因 元件，位于细菌的质粒或染色体上，可携带多个抗菌药物耐药基因，并能引起耐药基因的高 效、快速转移，造成同种或不同菌种之间的扩散，从而表达对不同抗生素的多重耐药性。
[0004] 临床抗菌药物大量应用是细菌整合子分子进化和捕获更多耐药基因的重要原因， 故应加强抗菌药物的合理应用，W减少整合子发生、减少分子进化的外部诱导环境，延缓多 药耐药菌株的发生。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种含有耐药基因盒的整合子，将其命名为Inl288,其序列如SEQ ID NO. 1所示。该整合子含有arr-S基因盒、catB3基因盒和aacA4基因盒。上述整合子表达多 种耐药基因，从而导致含有该整合子的菌种对多种抗生素药物具有耐药性。运些抗生素包 括:氯霉素类抗生素、横胺类抗生素、氨基糖巧类抗生素。
[0006] 常见的氯霉素类抗生素包括:氯霉素、班巧酸氯霉素。
[0007] 常见的横胺类抗生素包括：横胺异恶挫（SIZ)、横胺二甲喀晚（SM2)、横胺喀晚 (SD)、横胺甲恶挫（SMZ)、横胺间甲氧喀晚（SMM)、柳氮横化晚（SASP)、横胺米隆（SML)、横胺 喀晚银、横胺醋酷(SA)、W及复方新诺明（甲氧节晚+横胺甲恶挫）。
[000引常见的氨基糖巧类抗生素包括:链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡 星。
[0009] 本发明的整合子是通过W下方法获得的：
[0010] (1)在台州市立医院ICU病人血液培养阳性的标本中分离出1株对阿米卡星耐药的 细菌。
[0011] (2)然后将分离的单克隆菌株按操作程序用VITEK 2和药敏平板琼脂扩散方法(补 充药敏纸片)进行细菌鉴定及药敏试验，经鉴定此菌株为阴沟肠杆菌，将其命名为ECL2236。 同时，试验证实此菌株对多种抗生素有显著耐药性。
[0012] (3)将ECL2236菌株培养扩增，提取所述耐药菌株的质粒。
[0013] (4)将步骤(3)提取纯化后的质粒使用BamHI酶切，琼脂糖凝胶电泳分离得到一段 最后长度为3,763bp的DNA片段，将该DNA片段W常规方法与PMD19-T载体连接，然后热激转 化法转入感受态细胞E. coli T0P10中，W蓝白斑实验挑选阳性转化子，测序；
[0014] (5)利用ContigE邱ress Program软件进行序列拼接，分析其结构，鉴定出序列如 沈Q ID NO. 1所示的序列。
[0015] 本发明还提供了一种含有整合子Inl288序列的重组质粒。所述质粒包含整合子 Inl288序列。在本发明的具体的实施方案中，所述重组质粒由整合子Inl288序列和pET32a 载体重组而成，整合子插入位点在祀T32a载体上BamHI酶切位点处。所述重组质粒使用的空 载体可W使用任何常见的质粒载体代替。所述重组质粒的方法也为本领域技术人员熟知的 常规方法。
[0016] 本发明还提供了一种含有整合子Inl288的接合菌株。为了研究整合子的耐药性， 本发明利用细菌质粒转导实验来检测鉴定整合子Inl288的功能，将ECL2236菌株与E.coli J53AzK (对叠氮化钢耐药)菌株共培养，通过含叠氮化钢(300mg/L)和阿米卡星(0.06mg/L) 平板筛选接合子，将接合子做药敏试验，受体菌拥有供体菌的耐药性。其中，所用阿米卡星 可用下列药物代替:妥布霉素、卡拉霉素、庆大霉素、复方新诺明、横胺异恶挫(SIZ)。
[0017] 本发明还提供了一种含有整合子Inl288的重组菌株。为进一步证实上述接合菌株 的抗性来源于ECL2236菌株中的整合子，本发明将该整合子Inl288克隆入祀T32a载体中，整 合子插入位点在祀T32a载体上BamHI酶切位点处。并将其转化入野生型E.coli JM109中，通 过含有阿米卡星的平板选阳性克隆(含有祀T32a-整合子的细菌）。将阳性克隆做药敏试验， 结果显示E化2236菌株中的整合子Inl288可W使重组E.coli JM109菌株对W下药物耐药阿 米卡星、妥布霉素、下胺卡拉、庆大霉素、复方新诺明、横胺异恶挫(SIZ)、氯霉素。
[001引本发明的优点和有益效果：
[0019] (1)本发明首次发现了序列为SEQ ID NO. 1的包括多种耐药基因盒的整合子 Inl288,该整合子的核巧酸序列在现有技术中未见报道。
[0020] (2)本发明整合子序列的发现，为临床用药提供了一定的指导作用。有利于临床上 减少某些抗菌药物的使用，降低该类耐药基因盒水平转移的选择压力，防止耐药细菌的爆 发性流行。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明的整合子Inl288的结构示意图。
[0022] 具体的实施方式
[0023] 下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明， 并不意味着限制本发明的保护范围。
[0024] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人， 分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring 化rbor Laboratory Press, 1989)中所描 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0025] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[00%] 实施例1整合子Inl288的鉴定
[0027] 1、E化2236菌株的分离和鉴定
[002引 1.1材料
[0029] 细菌药敏卡:法国bioMerieux的AST-GN13eAST-GN13药敏种类有：阿米卡星、氨节 西林、氨节西林/舒己坦、氨曲南、头抱挫嘟、头抱化朽、头抱替坦、头抱他定、头抱曲松、环丙 沙星、厄他培南、庆大霉素、亚胺培南、左氧氣沙星、巧喃妥因、赃拉西林/他挫己坦、妥布霉 素、淵Z。
[0030] 补充药敏纸片(药敏平板琼脂扩散实验）：纸片来源于英国化Oid公司，复方新诺明 (30蛇）、氯霉素(3化邑）。
[0031] 1.2 方法
[0032] 仪器鉴定:将台州市立医院ICU病人血液培养阳性的菌株转种到血平板上分离培 养(在35°C含5%C02解育箱中培养16-1化），然后将分离的纯细菌按操作程序在VITEK 2上 机作细菌鉴定与药敏试验。
[0033] 补充药敏试验:将0.5麦氏单位的菌液涂抹在MH平板上，按操作程序贴上复方新诺 明和氯霉素纸片，在35°C含5%C02解育箱中培养16-18h后，按化SI2015标准鉴定药敏结果。
[0034] 1.3 结果
[0035] 1.3.1仪器鉴定结果
[0036] 经VITEK 2微生物分析仪鉴定为阴沟肠杆菌，鉴定概率为99 %，将其命名为 E化2236。
[0037] 1.3.2药敏实验结果
[0038] 药敏实验结果表明，E化2236菌株对于W下药物产生抗性:阿米卡星、氨节西林、氨 节西林/舒己坦、氨曲南、头抱挫嘟、头抱化朽、头抱替坦、头抱他定、头抱曲松、厄他培南、庆 大霉素、亚胺培南、赃拉西林/他挫己坦、妥布霉素、SMZ、头抱赃酬/舒己坦、复方新诺明、氯 霉素。
[0039] 2、整合子Inl288的分离和鉴定
[0040] 2.1 方法
[0041 ] 2.1.化化2236菌株的质粒提取
[0042]采用化KaRa的质粒少量提取试剂盒，按照说明书操作步骤提取细菌质粒DNA，作为 PCR模板，-20°C冰箱保存备用。
[0043] 2.1.2整合子的获取
[0044] (1)将清洁干燥并经灭菌的0.5mL eppendoW管编号，用微量移液枪分别加入 E化2236质粒DNA liig和10 X限制性内切酶反应缓冲液化L(Fermentas)，再加入重蒸水使总 体积19化，将管内溶液混匀后加入化L酶液(Fermentas)，用微量离屯、机甩一下，使溶液集中 在管底。
[0045] (2)混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上(插在泡沫塑料板上）， 37 °C水浴保溫2-化，使酶切反应完全。
[0046] (3)每管加入化L O.lmol/L邸TA(p册.0)，混匀，W停止反应。
[0047] (4)将酶切后的产物经过琼脂糖凝胶电泳进行分离。
[004引 2.1.3整合子的鉴定
[0049] (1)将经琼脂糖凝胶电泳分离得到的最后长度为3,763bp的DNA片段回收。
[0050] (2)使用常规方法，将步骤（1)回收的DNA片段与PMD19-T载体连接，然后热激转化 法转入感受态细胞E. coli T0P10中，W蓝白斑实验挑选阳性转化子，测序。
[0051 ] (3)利用ContigE邱ress Program软件进行序列拼接，分析其结构，鉴定出序列如 沈Q ID NO. 1所示。
[0052] 2.2 结果
[0053] 测序结果拼接后分析显示，长度为3，763bp的DNA片段属于I类整合子，该整合子包 括I型整合子的基本结构和多个基因盒，序列如SEQ ID NO. 1所示，结构示意图如图1所示。
[0054] 实施例2质粒转导实验研究整合子Inl288的功能
[0化5] 1、方法
[0056] (1)供体菌为ECL2236菌株，受体菌为E.coli J53 AzK(对叠氮化钢耐药）。将供体 菌、受体菌分别接种于LB平板上，35°C过夜培养。挑取单个菌落分别接种于4mL的LB肉汤中， 37 °C 22化/min摇菌培养至对数生长期。各取0.5血供、受体菌于4mL的LB肉汤中，37 °C静止过 夜培养。接合子W膜大豆琼脂（TSA)平皿筛选，平板中含叠氮化钢（300mg/L)和阿米沙星 (0.06mg/L)。置35°C解育18-2地。提取耐药菌株的质粒(步骤同实施例1)，WPCR法进行整合 子Inl288序列的检测。
[0化7] 扩增整合子Inl288序列的引物如表1所示：
[0化引表1引物序列
[0化9]
[006C
[0061] PCR的反应体系（50化）：Mg2+2.5mmol/L，引物30pmol/L，dNTP 0.2mmol/L，2.5U Tap 酶及化L DM模板。
[0062] 扩增条件：
[0063] 94°C预变性3min，然后94°C变性lmin，50-59°C合适溫度下退火lmin，72°C延伸 lmin，30个循环，最后72°C延长至lOmin。
[0064] 将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收所有扩增的DNA片段，W常规方法将扩 增片段分别与PMD19-T载体连接，然后热激转化法转入感受态细胞E. C01 i T0P10中，W蓝白 斑实验挑选阳性转化子，测序。
[0065] (2)将阳性菌株进行药敏实验，步骤同实施例1。
[0066] 1.2 结果
[0067] 药敏实验结果显示，整合子Inl288序列表达阳性菌株的药敏反应同ECL2236菌株 相同，代表整合子Inl288序列接合转移成功，且该整合子导致了接合细菌产生了下列药物 的耐药性:阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、复方新诺明、SMZ、氯霉素。
[0068] 实施例3基因重组实验研究整合子Inl288的功能
[0069] 1、方法
[0070] (1)将实施例2中的PCR产物(核巧酸序列为SEQ ID N0.1)与PMD19-T载体连接，连 接产物加入10化L E.coli JM109的感受态中转化，在含有IPTG、x-gal、Amp的平板上培养， 将IPTG、x-gal、Amp耐药菌株提取质粒测序(步骤同实施例1)，检测整合子Inl288是否插入 基因组中。然后将整合子Inl288序列克隆到pET32a载体中，整合子的插入位点在pET32a载 体上BamHI酶切位点处，按照常规方法制备，得到含整合子Inl288序列的pET32a重组质粒。 将重组质粒转化到感受态E.coli JM109细胞中。
[0071] (2)对构建成功的克隆菌进行耐药性检测
[0072] 采用法国bioMerieux的VITEK 2细菌鉴定及药敏分析系统和药敏平板琼脂扩散方 法(补充药敏纸片)对重组菌E.coli JM109(祀T32a-整合子Inl288)进行耐药性检测。
[007引2、结果
[0074] 药敏实验结果显示，重组菌E.coli JM109(pET32a-整合子Inl288)的药敏反应同 E化2236菌株相同，代表整合子Inl288序列已经成功整合到E.coli JM109的基因组中，且该 整合子导致了重组菌E.coli JM109产生了下列药物的耐药性:阿米卡星、庆大霉素、妥布霉 素、SMZ、复方新诺明、氯霉素。
[0075] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核屯、思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W对本发明进行若干改进 和修饰，运些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 一种整合子，其特征在于，所述整合子序列如SEQ ID NO.1所示，所述整合子命名为 Inl288〇2. -种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒中包含权利要求1所述的整合子。3. 根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的制备过程中使用的载 体质粒为pET32a载体。4. 一种接合细菌，其特征在于，所述接合细菌中含有权利要求1所述的整合子;所述接 合细菌是由ECL2236菌株与E.coliJ53 AzR菌株制备。5. -种重组细菌，其特征在于，所述重组细菌中含有权利要求1所述的整合子;所述重 组细菌是将权利要求2或3所述的重组质粒转入E.coli JM109菌株中制备而成。6. 权利要求1所述的整合子的获取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 在台州市立医院ICU病人血液培养阳性的标本中分离出1株对阿米卡星耐药的细 菌； (2) 将步骤（1)分离的单克隆菌株按操作程序用VITEK 2和药敏平板琼脂扩散方法，同 时补充药敏纸片进行细菌鉴定及药敏试验，经鉴定此菌株为阴沟肠杆菌，命名为ECL2236; (3) 将ECL2236菌株培养扩增，提取所述ECL2236菌株的质粒； (4) 将步骤(3)提取纯化后的质粒使用BamM酶切，琼脂糖凝胶电泳分离得到一段长度 为3，76 3bp的DNA片段，将该DNA片段以常规方法与pMD 19-T载体连接，然后热激转化法转入 感受态细胞E. coli T0P10中，以蓝白斑实验挑选阳性转化子，测序； (5) 利用ContigExpress Program软件进行序列拼接，分析其结构，鉴定出序列如SEQ ID NO. 1所示的序列。7. -种权利要求4所述的接合细菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体操作 步骤如下：将ECL2236菌株与E.coli J53 AzR菌株共培养，通过含有叠氮化钠和ECL2236菌 株耐受药物的平板筛选接合子。8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述ECL2236菌株耐受药物是阿米卡 星。9. 一种权利要求5所述的重组细菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体操作 步骤如下：将整合子Inl288克隆入pET32a载体中，然后将重组质粒转化入野生型E.coli JM109中，通过含有阿米卡星的平板选阳性克隆。
【文档编号】C12N1/21GK106047899SQ201610329149
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】王冬国, 陈佳玉
【申请人】王冬国