大豆myb转录因子基因提高大豆异黄酮生物合成的应用
【专利摘要】本发明涉及一种大豆MYB转录因子基因提高大豆异黄酮生物合成的应用，属于基因工程技术领域。GmMYB9基因大小为1188bp，编码395个氨基酸；酵母单杂交实验结果表明GmMYB9具有转录激活活性，亚细胞定位结果证明GmMYB9定位在细胞核中；实时荧光定量PCR结果表明GmMYB9在大豆未成熟胚向成熟种子发育过程中的表达趋势与异黄酮的积累趋势一致，在高异黄酮品种中的表达量高于异黄酮含量低的品种；转化GmMYB9基因的T2代转基因大豆种子和叶片中的异黄酮含量均有提高，证明GmMYB9基因参与调控大豆异黄酮的生物合成，对培育高异黄酮大豆品种具有重要意义。
【专利说明】
大豆MYB转录因子基因提高大豆异黄酬生物合成的应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，设及大豆MYB转录因子GmMYB9基因提高大豆异黄 酬生物合成的应用。
【背景技术】
[0002] 大豆含有丰富的蛋白质和油脂，是重要的粮食和经济作物。大豆中的异黄酬能够 提高植物防御非生物胁迫的能力，同时在人类的营养和健康方面具有诸多功效。异黄酬合 成途径是植物苯丙烷类代谢途径的分支途径，苯丙烷类代谢在植物中普遍存在，但异黄酬 主要在豆科植物中合成，它的积累受遗传因素和环境因素共同决定。
[0003] 异黄酬代谢途径由多个关键酶共同催化完成，单独调节某一个关键酶无法获得预 期的结果。但是MB转录因子基因通过与异黄酬合成途径关键酶基因的启动子结合，能够调 控多个关键酶基因的表达和mRNA转录的起始，进而参与调控异黄酬的生物合成。因此，研究 大豆的MYB转录因子，分析其在转录水平上对异黄酬生物合成的调控，阐明其相关功能，有 助于进一步了解大豆异黄酬的调控机理。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种大豆MYB转录因子GmMYB9基因提高大豆异黄酬生物合成 的应用。
[0005] 大豆异黄酬含量属于数量性状，是定量遗传类型。近年来，已有研究报道显示位于 数量性状位点（Quanti tative Trait Locus, QTL)附近的基因能够调控相应的数量性状，如 玉米巧粒行数0化附近的FASCIATED EAR2通过调控每穗玉米的巧粒行数来提高玉米产量， 所W我们将目标聚焦在位于大豆异黄酬OTL附近的MYB类转录因子。为了降低遗传因素及环 境因素对大豆异黄酬含量的影响，我们比较分析前人的研究结果，选取不同品种的自交系 在不同年份、不同地点定位到的位于大豆第6号染色体上游、与大豆异黄酬合成相关的2个 QTL，化Y1和qGm06，在qGm06的closet marker下游0.3cM处找到候选MYB转录因子基因 GmMYB9,到目前为止，关于GmMYB9的作用还未见报道。
[0006] 本发明利用gateway技术构建GmMYB9的植物表达载体，通过农杆菌介导的大豆胚 尖遗传转化方法将GmMYB9转入大豆中，获得T2代转基因大豆，用高效液相法化PLC)测量T2代 转基因大豆的叶片及种子中的异黄酬含量，与野生型相比，转基因植株种子异黄酬含量提 高了 1.11倍，叶片异黄酬含量提高了 1.56倍，叶片中的异黄酬含量提升幅度更高，说明 GmMYB9基因主要在叶片中调控异黄酬的生物合成。在前人的研究中，R1-MYB转录因子 GmMYB176能够在发根中调控大豆异黄酬的生物合成;玉米的CRC基因（玉米R2R3-M1^类转录 因子与地LH类转录因子的基因融合序列)在大豆种子中超表达，总异黄酬的含量提高了 3倍 多，若表达CRC的同时抑制与IFS竞争底物的酶基因 F3H(flavanone 3-hy化oxylase)的表 达，异黄酬的含量能提高4倍多。虽然GmMYB9基因在大豆种子中调控异黄酬的生物合成效果 没有玉米的CRC基因明显，但GmMYB9基因能够提高大豆叶片中的异黄酬含量，运在现有的研 究中尚未见到相关报道。由于异黄酬能够提高植物防御非生物胁迫的能力，所w推测在大 豆的复叶期至完熟期的过程中如果遇到非生物胁迫，GmMYB9在大豆叶片中调控异黄酬的生 物合成就会发挥抵御非生物胁迫的功效。
[0007] 本发明所提供的大豆MYB转录因子GmMYB9,编码基因如SEQ ID No.l所示，它是由 395个氨基酸残基组成的蛋白质，序列如SEQ ID No.2所示，属于典型的R2R3型大豆MYB转录 因子。
[0008] 本发明所提供的大豆MYB转录因子GmMYB9基因在提高大豆异黄酬生物合成中的应 用。
[0009] 本发明所提供的大豆MYB转录因子GmMYB9基因在提高大豆叶片中异黄酬生物合成 中的应用。
[0010] 利用任何一种能够引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的GmMYB9 编码基因导入植物细胞，可获得异黄酬含量提高的转基因细胞系及转基因植株。使用本发 明的基因构建植物表达载体时，在其转录起始核巧酸前可加上任何一种增强启动子或诱导 型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加 工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、蛋光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆 大霉素、卡那霉素等）。携带有本发明GmMYB9的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病 毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织， 并将转化的植物组织培育成植株。被转化的宿主既可W是单子叶植物，也可W是双子叶植 物。本发明的基因对改良豆科植物异黄酬代谢，特别是培育高异黄酬大豆品种具有重要意 义。
【附图说明】
[0011] 图 1 是GmMYB9的PCR扩增结果图，M.DNA Marker(DL2000)，l.PCR结果；
[0012] 图2是GmMYB9在酵母系统中的激活能力分析图；
[0013] 图3是亚细胞定位载体转化农杆菌菌液PCR图，M.DNA Marker(DL2000)，1-2PCR结 果；
[0014] 图4是GmMYB9的亚细胞定位结果图；
[001引图5是GmMYB9在大豆不同组织中的表达图；
[0016] 图6是连接C服8启动子序列的PCAMBIA1301载体转化农杆菌电泳图，M.DNA Marker (DL2000)，1-2PCR 结果；
[0017]图 7 是烟草叶片 GUS 活性分析图，A:CK;B:CaMV 35S;C:CHS8promoter;D: CHS8promoter+GmMYB9；
[0018] 图8是植物表达载体转化农杆菌菌液PCR电泳图，M.DNA Marker(DL2000)，1-4PCR 结果；
[0019] 图9是部分T〇、Ti、T2代转基因植株的PCR检测结果图，M:DNA Marker(DL2000) ;P:阳 性质粒;N:野生型大豆；1-14:转基因大豆；
[0020] 图10是部分T2代转基因植株的Southern blot检测结果图，P:阳性质粒;WT:野生 型大豆；1-3:转化pCB35SRlR2-GFP-GmMYB9载体的植株；
[0021] 图11a是野生型与T2代转基因植株的种子异黄酬含量图，WT:野生型大豆；1-3:转 化 pCB35SRlR2-GFP-GmMYB9 载体的植株；
[0022]图Ub是野生型与转化基因 GmMYB9的T2代转基因植株的新鲜叶片异黄酬含量图， WT:野生型大豆；1-3:转化pCB35SRlR2-GFP-GmMYB9载体的植株；
[002引图12是GmMYB9在转基因植株中的表达量图，WT:野生型大豆；1-3:转化 pCB35SRlR2-GFP-GmMYB9 载体的植株；
[0024] 图13是转GmMYB9基因 T2代叶片中异黄酬合成关键酶基因的表达量分析图；WT:野 生型大豆；1-3:转化pCB35SRlR2-GFP-GmMYB9载体的植株。
【具体实施方式】
[0025] 实施例1、大豆GmMYB9基因的克隆
[0026] 用RNAiso Plus(购自hKaRa)提取大豆品种Williams 82的20d胚总RNA，经1%琼 脂糖电泳检测RNA的完整性。cDNA的合成按照Reverse Transc;rip1:ase M-MLA^RNase H-)的 说明书进行。根据GmMYB9的全长序列设计引物，引物为：
[00打]GmMYB9-F:AACAACATAGAGAGCCATAATACCC
[0028] GmMYB9-R：CATAGACTCCTCTTTCAAACACCTC
[0029] 按照表1反应体系进行PCR扩增：
[0030] 表1PCR扩增反应体系
[0031]
[0032] PCR反应程序为：95。[4111111;94。[303,57。[503,72。[903,30个循环；72。(：延伸 1 Omin。经PCR扩增得到GmMYB9基因，如图1所示，由1188个碱基对组成，读码框自5 '端第1位 到第1188位碱基，编码一个由395个氨基酸残基组成的蛋白质，其中自氮端第13-63和66- 114个氨基酸残基保守结构域是典型的结合域。
[0033] 实施例2、大豆GmMYB9基因在酵母中的表达
[0034] 在基因的5'端和3'端分别设计含EcoR I和Sal I酶切位点的引物，W测序鉴定正 确的pMD18-T-GmMYB9的质粒为模板，进行PCR扩增，PMD18-T购自hKaRa公司。引物如下（用 下划线标出酶切位点）：
[003引 GmMYB9-HF:5，-CCGGAATTCATGGGAAGGAGTCCTTGC-3,，EcoR I
[0036] GmMYB9-HR:5，-ACGCGTCGACCTACAGATACTGAATGTA-3，，Sal I
[0037] 将扩增产物经琼脂糖凝胶DM纯化回收试剂盒(购自BioTeke公司）纯化后，用EcoR 巧口Sal I双酶切，回收纯化后，与同样用EcoR I和Sal I双酶切的pG服T7(购自clontech)载 体连接。连接产物转化埃希氏大肠杆菌化.coli)DH5a，经验证后，转入酵母AH109(购自 clontech)中表达。
[003引酵母感受态制备及转化方法参照MatchmakerTMQne-HybridLibrary Construct ion&Screenin 邑 Kit (clontech)说明书进行。
[0039] 重组质粒pG服T7-GmMYB9转入酵母AH109后，能够在含有5mM 3-AT的营养缺陷型培 养基SD/-化p/-Hi s/-Ade (图2)上生长，说明GmMYB9具有转录激活活性，是转录激活子。
[0040] 实施例3、大豆GmMYB9基因的亚细胞定位研究
[0041 ] 去掉GmMYB9的终止密码子，采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)的方法构建GmMYB9与绿色 巧光蛋白基因 eGFP的融合基因，在5 '端和3 '端分别设计含Xba I和SacI酶切位点的引物，W 鉴定正确的pMD18-T-GmMYB9及peGFP-Xl为模板，分别W0-F3和0-R3、0-F4和0-R4为成对引 物进行普通PCR扩增，PCR产物回收后做好标记。引物如下（用下划线标出酶切位点）：
[0042] GmMYB9-S0E-F(0-F3):5'-GCTCTAGAATGGGAAGGAGTCCTTGC-3',Xba I
[0043] GmMYB9-S0E-R(0-R3):
[0044] 5 ' -CACCAT狂助扛C迟岛;乂X右m岛QiCAGATACTGAATGTACTT-3 '（波浪线代表连
[0045] 接目的基因与报告基因之间的Li址er)
[0046] eGFP-S0E-F(0-F4):
[0047] 5，-gtatctgCCA-OX迫 ICQ￡￡A￡'￡atggtgagcaagggcgag-3 '
[0048] eGFP-S0E-R(0-R4):5 '-CGAGCTCTTACTTGTACAGCTCGTC-3'，SacI
[0049] W回收的GmMYB9和eGFP作为模板，0-F3和0-R4为引物，选用高保真酶Primer Star (购自TaKaRa)进行SOE-PCR，W获得GmMYB9: eGFP融合基因。反应体系如表2所示：
[00加]表2S0E-PCR扩增体系
[0化1 ]
[0052] 反应程序为:94°C5min
[0053] 95°C 10s,68°C-1 °C/cycle 20s,68°C3min,lOcycles
[0054] 95°C10s
[0055] 46°C20s,68°C3min,22cycles
[0056] 68°C10min
[0化7] 10°C forever
[005引将扩增产物经琼脂糖凝胶DM纯化回收试剂盒(购自BioTeke公司）纯化后，用Xba I和SacI双酶切，回收纯化后，与同样用Xba I和SacI双酶切的pBI121(本实验室保存)载体 连接。连接产物转化埃希氏大肠杆菌化.coli)D册a,经验证后，转入根癌农杆菌邸A105(本 实验室保存）中表达。
[0059] 根癌农杆菌EHA105感受态的制备采用常规的化Cl2法。
[0060] 重组质粒981121-6111]\^9:66。?转入根癌农杆菌6齡105后（图3)，转化洋葱表皮细 胞，制作临时装片，在激光共聚焦显微镜下观察GmMYB9的定位情况，结果表明GmMYB9定位在 细胞核中（图4)。
[0061 ] 实施例4、大豆GmMYB9基因的组织特异性表达
[0062] 分别提取大豆Williams 82根、茎、叶、花、芙及20(1、30(1、40(1、50(1未成熟胚，大豆 Williams 82成熟种子、大豆星鉴35成熟种子的总RNA，并反转录成cDNA，方法同实施例1。利 用实时巧光定量PCR对GmMYB9基因在大豆Williams 82不同组织及大豆星鉴35成熟种子中 的表达情况进行检测。按照SYBR Premix Ex化q(购自TaKaRa)说明书，在实时巧光定量PCR 仪ABI 7500中进行。W大豆0-tubulin为内参基因，引物如下：0-Tublin-F:5'- GGAAGGCTTTCTTGCATTGGTA-3'
[0063] P-I'ubl in-R: 5' -AGTGGCATCCTGGTACTGC-3'
[0064] GmMYB9-Q-F:5'-TAAGCCAAGAAGAAGAGCAGAC-3'
[00化]GmMYB9-Q-R:5'-CGTTATCAGTTCGCTTTGGTA-3 '
[0066] PCR反应体系如表3:
[0067] 表3实时巧光定量PCR反应体系
[006引
[0069] 反应程序为:95 °C 30s; 95 °C 5s，60 °C ：Ms，72 °C 30s，40 个循环。
[0070] 采用法分析数据，确定基因的相对表达量。试验共设3次技术重复，3次生物 学重复。
[0071] 结果（图5)表明GmMYB9基因在大豆Williams 82各组织部位均有表达，在叶片中的 表达量最高，是成熟种子中的10倍。随着大豆未成熟胚生长时间的延长，GmMYB9基因的表达 量也随之升高，运与前人研究的异黄酬在大豆未成熟胚中的积累趋势一致。同时在不同品 种大豆种子中的表达量也不同，在异黄酬含量较高的Williams82中的表达量要高于异黄酬 含量较低的星鉴35,表明GmMYB9基因在大豆异黄酬合成途径中可能具有调控作用。
[0072] 实施例5、大豆GmMYB9基因对CHS8基因的调控作用
[0073] 植物表达载体的构建方法与实施例2方法相同。将GmMYB9亚克隆于植物表达载体 PCAMBIA1301中，用C服8的启动子(C服8P)替换PCAMBIA1301的CaMV35S启动子构建表达载体 PCAMBIA1301-C服8P，鉴定正确后，转化农杆菌EHA105(图6)。
[0074] 采用农杆菌介导法转化烟草叶片。用去掉针头的1ml注射器，将分别含有 PCAMBIA1301 空载体，PCAMBIA1301-CHS8P 载体，及 PCAMBIA1301-CHS8P 与 PCB35SR1R2-GFP- GmMYB9两种载体质粒的农杆菌EHA105的重悬液及不含载体的重悬液(菌体重悬后0D600约 为0.2)，从烟草叶片背部缓慢注入，用记号笔做好标记，侵染后，在16h光照、她黑暗光周期， 22°C条件下，保湿培养2d。
[0075] GUS巧光测定
[0076] 5.1GUS 酶提取
[0077] 1)取0.1 g烟草叶片，去掉主叶脉，放入研鉢中，加入液氮研磨成粉末；
[0078] 2)将研磨好的粉末放入预先称重且过液氮预冷的离屯、管中，再次称重，记录加样 前和加样后离屯、管的重量(两次差值即为样品重量），向离屯、管中加入60化1的酶提取缓冲 液，满旋混匀；
[00 巧]3)4。[，12000巧111离屯、10111111，取上清，-80。(：保存备用。
[0080] 5.1化a壯ord法测定GUS提取液的蛋白含量
[0081 ] 1)按照表4配置BSA浓度梯度液，按照1:5的比例与考马斯亮蓝G250溶液混匀，室溫 放置5min，在波长595nm处测定吸收值，W蛋白浓度为横坐标、吸收值为纵坐标制作标准曲 线：
[0082] 表4BSA梯度溶液
[0083]
[0084] 2)吸取GUS提取液，补水至4ml，混匀后吸出1ml，加入考马斯亮蓝G250溶液 5ml，混匀后室溫放置5min，在波长595nm测定吸收值，根据回归方程计算样品中蛋白含量。
[0085] 5.3巧光测定
[0086] 1)标准曲线的制作:配制10皿4-MU母液，用反应终止液对其进行线性稀释，浓度 依次为 1000皿〇1/1、500醒〇1/1、250皿〇1/1、125加1〇1/1、62.5皿〇1/1，在激发光365醒、发射 光455nm，狭缝3nm条件下用巧光分光光度计测定各巧光强度，制作标准曲线；
[0087] 2)取6支1.5mL离屯、管，各加入90化1反应终止液，编号；
[008引 3)取1支1.5mL离屯、管，加入ImL在37°C预热的检测液2mmol/LMUG，加入适量GUS提 取液测定的蛋白浓度为依据），迅速充分混合，取出10化1加入1号管中，记录此时反应时 间为0,严格计时；
[0089] 4)反应管放入37 °C水浴保溫进行酶反应，分别于5、10、15、30、60min时各取出10化 1加入装有90化1反应终止液的2-6号管中混匀，分别为酶反应5、10、15、30、60min时的样品， 在激发光365nm，发射光455nm，狭缝3nm条件下测定各巧光强度，通过标准曲线读取2-6号管 中4-MU含量。
[0090] 5.4GUS酶活性计算
[0091 ] 1)酶活力单位定义:每分钟水解4-MUG生成Inmol或Img、化g、lng 4-MU的酶量为一 个活力单位，根据定义求出各样品的酶活力；
[0092] 2)GUS基因表达活性每毫克蛋白的酶活力表示，W每毫克蛋白每分钟催化MUG 生成Ipmol 4-MU作为GUS的一个活性单位。
[0093] 巧光测定结果（图7)显示，侵染重悬液的烟草叶片巧光值较低;侵染含有CaMV35S 启动子与CHS8启动子的PCAMBIA1301质粒载体的烟草叶片的GUS巧光值提高；共侵染 PCAMBIA1301-CHS8P与pCB35SRlR2-GFP-GmMYB9质粒载体的烟草叶片的GUS巧光值比单独侵 染pCAMBI A1301-CHS8P质粒载体的要高。运就表明，转入了 GmMYB9基因确实对CHS8基因有调 控作用，使共转化的烟草叶片GUS巧光活性升高。而CHS8基因是植物异黄酬合成途径中的关 键酶。
[0094] 实施例6、GmMYB9在大豆中的表达及对异黄酬生物合成途径调控的分析
[0095] 利用gateway技术构建植物表达载体pCB35SRlR2-GFP-GmMYB9,参照invi化ogen公 司提供的方法。采用农杆菌介导的大豆胚尖遗传转化将植物表达载体PCB35SR1R2-GFP- GmMYB9(图8)转化大豆吉林35,并对转基因植株进行PCR、Southern blot鉴定，同时检测阳 性植株中目的基因表达量、大豆异黄酬含量及异黄酬合成路径上关键酶基因的表达量，具 体方法及结果如下：
[0096] 6.1大豆胚尖的遗传转化及筛选
[0097] 1)种子消毒:挑取巧粒饱满、表面光滑的大豆吉林35种子平铺于干净的培养皿中， 在通风楓内，将培养皿敞开放在干燥器中，将装有52ml水和44ml次氯酸钢的250ml烧杯也放 入干燥器中，沿烧杯内壁缓慢加入4ml浓盐酸，迅速合上干燥器的盖子密封，灭菌12h。灭菌 结束后，用保鲜膜密封培养皿的接缝处，置于超净工作台中打开培养皿，吹20-30min去除多 余的氯气；
[0098] 2)挑取含有pCB35SRlR2-GFP-GmMYB9载体的农杆菌单克隆于2ml附加50mg/L rif 和50mg/L Km的液体YEP培养基中，28°C160巧m振荡培养24h;
[0099] 3)取1ml上述菌液倒入200ml含同样抗生素的液体YEP中，28 °C 25化pm振荡培养至 0〇6〇日=0.6左右；
[0100] 4)将培养后的菌液转入50mL无菌离屯、管中，室溫5000rpm离屯、lOmin弃上清、收集 菌体，将菌体重悬于附加0.02% si lwet77的1/2MS液体培养基中（pH 5.4)，冰浴化活化菌 液；
[0101] 5)将灭菌后的大豆转入附加 2mg/L 2,4-D的液体MS培养基中，25°C暗培养12-1化；
[0102] 6)在超净工作台中，用手术刀和綴子分离大豆胚尖，放置于活化好的菌液中，真空 侵染15min，将侵染后的胚尖置于附加5mg/L 6-BA的1/2MS固体培养基上(P册.4)，25°C黑暗 条件共培养2-3d;
[0103] 7)将共培养后的大豆胚尖转入附加 0.6mg/L Basta、250mg/L Cef的1/2MS固体诱 芽筛选培养基中（pH 5.7-5.8)，25°C/22°C16/她光照/黑暗条件下培养，2周后将胚尖转移 到新的诱芽筛选培养基中；
[0104] 8)经过4周筛选后，用剪刀剪取幼芽部分转入附加0.5mg/L IBA、100mg/L Cef的3/ 8MS固体生根培养基中；
[0105] 9)4周后，将生根的幼苗炼苗2-3d，洗净根部的培养基移入装有大田±:草炭:赔石 (1:1:1)的营养鉢中，在28°C/22°C16/她光照/黑暗条件的人工气候室中培养。
[0106] 6.2转基因植株的PCR检测
[0107] 1)提取转化植株的叶片总DNA，方法参照加 iversal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(购自TaKaRa)说明书进行。
[0108] 2)将大豆叶片总DM稀释30倍，取化1作模板，W未转化的野生型大豆为阴性对照， 质粒pCB35SRlR2-GFP-GmMYB9为阳性对照，Wbar-F、bar-R为引物进行PCR扩增验证，引物序 列如下：
[0109] bar-F:5 '-AAACCCACGTCATGCCAGCTC-3 '
[0110] bar-R:5 '-CGACAAGCACGGTCAACTTC-3 '
[011。 3)收获PCR检测为阳性的植株种子，即To代种子，
[0112] 4)将To代种子种植后在人工气侯室中培养，按上述方法继续筛选后收获Ti代种子；
[0113] 5)将Ti代种子种植在吉林大学植物科学学院转基因安全释放基地，对T2代植株及 其种子做进一步研究。
[0114] 图9为GmMYB9在部分T〇、Ti、T2代转基因大豆中的PCR鉴定结果。结果表明，GmMYB9基 因已经整合到大豆基因组中。
[0115] 6.3T2代转基因植株的Southern blot检测
[0116] 首先对种植在转基因安全释放基地中的T2代植株叶片进行PCR检测，记录好阳性 植株。然后提取阳性植株的叶片总DNA，参照Soutern杂交试剂盒DIG High Prime DNA Lableling and Detection Starter Kit I(购自罗氏公司）的方法对T2代植株进行 Southern blot检测。图10为部分T2代植株的Southern blot检测结果，进一步证明GmMYB9 基因已经整合到大豆基因组中，并且能够在大豆中稳定遗传。
[0117] 6.4转基因大豆植株异黄酬含量的检测
[0118] T2代转基因植株的种子收获后，用高效液相法化PLC)测量PCR及Southern blot检 测均呈阳性植株的种子及叶片异黄酬含量。结果如（图11a、图Ub)表5、表6所示，与野生型 相比，转基因植株种子异黄酬含量只提高了 1.11倍，变化非常小，转基因植株叶片异黄酬含 量提高了 1.56倍，提升的幅度要高于种子中的异黄酬，说明GmMYB9基因主要在叶片中调控 异黄酬的生物合成。
[0119] 表5野生型与T2代转基因植株的种子异黄酬含量 「01201
[0123] 6.5转基因植株中61111￥89的表达量检测
[0124] 提取GmMYB9转基因 T2代阳性植株及野生型的叶片RNA，反转录成cDNA后，W GmMYB9-Q-F、GmMYB9-Q-R为引物，利用实时巧光定量PCR检测GmMYB9在转基因植株及野生型 中的表达量。结果如图12所示，与野生型相比，GmMYB9在转基因株系中表达量均有显著提 高，说明GmMYB9成功转入大豆中，并能稳定遗传。
[0125] 6.6转基因植株中异黄酬合成途径上各关键酶基因的表达分析
[0126] 分别提取野生型及转GmMYB9基因 T2代叶片的总RNA，反转录成cDNA作模板，利用实 时巧光定量PCR检测异黄酬合成途径中的关键酶基因 PALI (Phenylalanine ammonia- lyase)、C服8、IFS2、CHI(chalcone isomerase)及F3H的表达情况，各酶基因所需引物如下： [01 打]GmPAU-F: 5' -TCAGAGTCAGCGAGAGAAGGAG-3,
[0128] GmPALl-R:5'-GGTGGTGACGCCGTAACTG-3 '
[01 巧]GmC服8-F:5'-ATCCGCCAGGCACAAAGG-3 '
[0130] GmC服8-R:5'-TGAAGTAGTAGTCAGGATAGGTGCT-3 '
[0131] GmIFS2-F:5'-AAGCCTCGTCTTCCCTTCATAG-3 '
[01 扣]GmIFS2-R:5'-CAAAGTAGAGAGAGAATAAGGGACC-3,
[0133] GmCHI-F:5'-TGTATCAGCGGCGGTCTTG-3 '
[0134] GmCHI-R:5'-TCAATACCGCAGGCAATCG-3 '
[0135] GmF3H-F:5'-TTCATTGTCTCCAGCCATCTCC-3'
[0136] GmF3H-R:5，-CGCTGTATTCCTCAGTCACCG-3 '
[0137] 结果如图13所示，我们可W看到在转GmMYB9基因的T2代叶片中，与野生型相比， PALI的表达量略有降低，IFS2的表达量略有升高，但都不具有统计学意义;F3H的表达量几 乎没有变化;CHS8和CHI的表达量在各转基因株系中的表达量都达到了极显著水平，说明 GmMYB9通过上调异黄酬合成路径上关键酶基因 CHS8和CHI的表达量来调控异黄酬的生物合 成。
【主权项】
1. 大豆MYB转录因子GmMYB9基因在提高大豆异黄酮生物合成中的应用。2. 大豆MYB转录因子GmMYB9基因在提高大豆叶片中异黄酮生物合成中的应用。3. 如权利要求1所述大豆MYB转录因子GmMYB9基因在提高大豆异黄酮生物合成中的应 用，所述大豆MYB转录因子GmMYB9的序列如SEQIDNo.2所示。4. 如权利要求1所述大豆MYB转录因子GmMYB9基因在提高大豆异黄酮生物合成中的应 用，所述大豆MYB转录因子GmMYB9的编码基因如SEQ ID No.l所示。5. 如权利要求2所述大豆MYB转录因子GmMYB9基因在提高大豆叶片中异黄酮生物合成 中的应用，所述大豆MYB转录因子GmMYB9的序列如SEQIDNo.2所示。6. 如权利要求2所述大豆MYB转录因子GmMYB9基因在提高大豆叶片中异黄酮生物合成 中的应用，所述大豆MYB转录因子GmMYB9的编码基因如SEQ ID No.l所示。
【文档编号】A01H5/00GK106047889SQ201610389577
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】王庆钰, 赵明珠, 闫帆, 王英, 李景文, 王天亮, 郭文云, 申梓邑, 何禹璇, 程浩
【申请人】吉林大学