一种青蒿bHLH类转录因子编码序列及克隆方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一种青蒿AaMYC4基因编码序列的克隆及其应用。具体包括基因AaMYC4的克隆、含有该基因的植物表达载体的构建、该基因对青蒿素生物合成途径特有基因启动子的激活作用。上述青蒿AaMYC4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了AaMYC4基因具有能够激活青蒿素生物合成途径特异的ADS，CYP71AV1，DBR2和ALDH1这4个基因启动子表达的特性。本发明中AaMYC4基因可通过RNAi干扰，antisense抑制等方法应用于青蒿品质改良，可提高青蒿中青蒿素的含量。
【专利说明】
-种青富bHLH类转录因子编码序列及克隆方法与应用
技术领域
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，具体设及一种青葛bHLH类转录因子编码序列 AaMYC4及其应用。
【背景技术】
[0002] 植物中新陈代谢分为初生代谢和次生代谢，初生代谢产物（如糖类、脂类和核酸） 存在于所有的植物中，是植物维持细胞生命活动所必需的，而植物次生代谢产物是指植物 中一大类非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其合成与分布具有种属、组织器官 和生产发育特异性。例如，治疗追疾的特效药物成分青葛素只在植物青葛（Artemisia annua L.)植株表面的分泌型腺毛中合成并储存。近年来，随着对中草药成分研究的逐步深 入，发现许多中草药的有效成分均为植物次生代谢产物，例如丹参中的丹参酬，长春花中的 长春生物碱等。
[0003] 大部分植物次生代谢产物其在天然植物中的含量极低，而使用化学合成的方法， 工艺流程复杂、成本太高，并且还有许多植物次生代谢产物的生物合成途径不清晰，无法实 现化学全合成。因此，研究人员开始探索其他的提高植物次生代谢产物含量的方法。考虑到 植物次生代谢产物合成途径复杂，参与反应的基因数量多，且受到发育，环境等多种因素的 影响，对途径上单个基因进行修饰有时难W奏效。而转录因子通常可W调控某个植物次生 代谢产物生物合成途径上的多个酶基因的表达，从而调控该次生代谢产物的生物合成量。
[0004] 目前，在青葛中已有报道发现，转录因子可W有效调控青葛素合成途径特有基因 的表达，从而调控青葛素的生物合成，例如AaORAl转录因子，bHLHl转录因子，AaMYC2转录因 子等等。因此，克隆能调控青葛素生物合成途径特有基因表达的转录因子，对于改良并提高 青葛中青葛素的含量具有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了 W下技术方案，W提高青葛中青葛素 的含量：
[0006] 本发明提供了一种青葛bHLH类转录因子编码序列，该编码序列记为AaMYC4， AaMYC4的核巧酸序列如沈Q ID N0.1所示。
[0007] 本发明还提供了一种青葛地LH类转录因子编码序列，AaMYC4编码的氨基酸序列如 沈Q ID NO.2所示。
[000引本发明还提供了一种多肤，该多肤的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]本发明还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体包含如SEQ ID NO. 1所示的 核巧酸序列的开放阅读框序列，所述开放阅读框序列如SEQ ID NO.3所示。其构建方法包括 W下步骤：
[0010] 步骤1、根据SEQ ID N0.1序列设计扩增AaMYC4基因开放阅读框序列，扩增引物如 下：
[0011] 正向引物P3:5 ' -CACCATGTTATTACTAAACTCAACC-3 '
[0012] 反向引物P4:5 ' -ATCCAAGCACATTTTGTTGAG-3 ' ；
[001 ；3 ] 步骤2、将PCR扩增产物回收纯化后连接祀NTR-T0P0载体；
[0014] 步骤3、将连接入AaMYC4基因的祀NTR-T0P0载体与祀earlygatel04植物表达载体 通过LR反应的方式构建含有目的基因的祀earlygatel04-AaMYC4植物表达载体。
[0015] 本发明还提供了一种重组表达转化体，该重组表达转化体包含如SEQ ID NO. 1所 示的核巧酸序列的开放阅读框序列，所述开放阅读框序列如SEQ ID NO.3所示。
[0016] 进一步地，上述重组表达转化体的宿主菌株为农杆菌。
[0017] 本发明还提供了上述青葛地LH类转录因子编码序列AaMYC4在提高青葛素含量中 的应用。
[001引本发明还提供了上述青葛地LH类转录因子编码序列AaMYC4的克隆方法，该克隆方 法包括W下步骤：
[0019] 步骤1、总RNA的提取与纯化，采用各种通用的植物总RNA提取试剂盒提取并纯化获 得青葛叶片总RNA;
[0020] 步骤2、用反转录酶将青葛叶片总RNA反转成cDNA;
[0021] 步骤3、W上述cDNA为模板，通过设计基因特异引物，采用PCR的方法扩增，获得PCR 产物，基因特异引物为：
[0022] 正向引物P1:5 ' -TATAAAACATGCGGCATTATTGC-3 '
[0023] 反向引物P2:5 ' -TCACTATTACGTCATTCCACCAC-3;
[0024] 步骤4、PCR产物回收纯化测序，获得如SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列。
[0025] 本发明还提供了一种快速检测AaMYC4编码的氨基酸序列的生物学功能的方法，该 方法包括W下步骤：
[0026] 步骤1、根据SEQ ID N0.1序列设计扩增AaMYC4基因开放阅读框序列，扩增引物如 下：
[0027] 正向引物P3:5 ' -CACCATGTTATTACTAAACTCAACC-3 '
[0028] 反向引物P4:5 ' -ATCCAAGCACATTTTGTTGAG-3 ' ；
[0029] 步骤2、将PCR扩增产物回收纯化后连接祀NTR-T0P0载体；
[0030] 步骤3、将连接入AaMYC4基因的祀NTR-T0P0载体与祀earlygatel04植物表达载体 通过LR反应的方式构建含有目的基因的祀earlygatel04-AaMYC4植物表达载体；
[0031] 步骤4、将青葛中青葛素合成途径特有ADS基因的启动子ProADS连接入 pGreenII0800-LUC载体，构建植物双巧光素检测报告载体pGreenllOSOO-ProADS;
[0032 ]步骤5、将青葛中青葛素合成途径特有CYP71 AVI基因的启动子ProCYP? 1 AVI连接入 pGreenII0800-LUC载体，构建植物双巧光素检测报告载体pGreenII0800-ProCYP71AVl;
[0033] 步骤6、将青葛中青葛素合成途径特有DBR2基因的启动子ProDBR2连接入 pGreenII0800-LUC载体，构建植物双巧光素检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2;
[0034] 步骤7、将青葛中青葛素合成途径特有ALDH1基因的启动子ProALDHl连接入 pGreenII0800-LUC载体，构建植物双巧光素检测报告载体pGreenllOSOO-ProALDHl;
[0(X3日]步骤8、将pEearlygatel04-AaMYC4植物表达载体和植物双巧光素检测报告载体 pGreenII0800-ProADS、pGreenII0800-ProCYP71AVl、pGreenII0800-ProDBR2和 pGreenllOSOO-ProALD化分别转化入农杆菌中，获得包含目的载体的农杆菌工程菌株；
[0036] 步骤9、将包含祀earlygatel04-AaMYC4植物表达载体的农杆菌工程菌株和包含植 物双巧光素检测报告载体的农杆菌工程菌株混合后，通过注射侵染的方式注射到生长5周 的烟草叶片中；
[0037] 步骤10、取注射后培养2天的烟草叶片，用液氮速冻后研磨成粉末；
[0038] 步骤11、采用？'〇111日旨日-〇11日^山^'日^3日检测试剂盒检测巧光强度，确定4日1￥〔4基 因与青葛素合成途径特有基因启动子的激活作用。
[0039] 进一步地，上述步骤8中，宿主菌为农杆菌GV3101菌株；上述步骤9中，包含 祀earlygatel04-AaMYC4植物表达载体的农杆菌工程菌株和包含植物双巧光素检测报告载 体的农杆菌工程菌株混合比例为按3:1浓度混合。
[0040] 在本发明中，克隆AaMYC4基因可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括 质粒、粘粒等。在本发明中构建AaMYC4植物表达载体，也可选用本领域已知的各种载体，如 市售的pCAMBIA系列载体;在本发明中构建启动子双巧光素报告载体，也可选用本领域已知 的各种其他载体，如市售的Promega公司的载体;本发明中所设及的农杆菌为根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101，该菌株可W从市场上公开购买。
[0041] W下将结合附图对本发明作进一步说明，W充分说明本发明的目的、技术特征和 技术效果。
【附图说明】
[0042] 通过阅读参照W下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[00创图1示出了在一个较优实施例中，烟草瞬时转化AaMYC4基因显著抑制ADS， CYP71AV1，DBR2和ALD化运4个基因启动子的表达活性。
【具体实施方式】
[0044] 下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在W本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克 隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
[0045] 实施例1、实施例1青葛AaMYC4基因的克隆
[0046] 1、青葛在人工气候室培养，生长条件为光周期1她/化(光亮/黑暗），25°C;
[0047] 2、青葛叶片总RNA的提取。取100毫克左右幼嫩的青葛叶片组织材，置于液氮中充 分研磨至粉末状，按照植物总RNA提取试剂盒(天根生化，北京)说明书的方法，提取叶片总 RNA。将获得的植物总RNA取化L进行琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的质量，然后在化no化op (Thermo Fisher,美国）分光光度计上测定总RNA的浓度。
[004引3、基因的克隆。W提取的总RNA为模板（500ng)，按照反转录试剂盒PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(hKaRa，大连）说明书的方法，反转录生产第一链cDNA; 通过设计的特异引物，W cDNA为模板进行PCR扩增，特异引物序列如下：
[0049] 正向引物P1:5 ' -TATAAAACATGCGGCATTATTGC-3 '
[0050] 反向引物P2:5 ' -TCACTATTACGTCATTCCACCAC-3 '
[0051 ] PCR反应总体积为50化，反应体系为:5化10XK0D缓冲液，5化dNTPs，化L MgS04， 1化正向引物，1化反向引物，化L cDNA模板，化L K0D酶，d地20补齐至50化。
[0052] PCR 扩增条件，预变性 95°C3min，35 个循环：95°C，30sec;54°C，30sec;68°C， lOOsec，最后 68°C 延伸 5min。
[0053] 将PCR产物经回收纯化后，连接平末端载体化B(天根生化有限公司产品）并测序， 获得pLB-AaMYC4质粒载体。
[0054] 通过上述步骤，获得了青葛中AaMYC4基因的序列如SEQ ID N0.1所示，并推导出其 蛋白编码序列如SEQ ID NO.2所示。
[00巧]实施例2、包含AaMYC4基因的植物表达载体的构建 [0化6] 1、中间载体祀NTR-T0P0-AaMYC4的构建。
[0057]根据SEQ ID NO. 1序列信息设计扩增AaMYC4基因开放阅读框序列，扩增引物如下： [0 化引 正向引物P3:5 ' -CACCATGTTATTACTAAACTCAACC-3 '
[0059] 反向引物P4:5 ' -ATCCAAGCACATTTTGTTGAG-3 '
[0060] 祀NTR/D-T0P0载体购置于Invihogen公司，为该公司Gateway克隆技术的入口载 体，按照该产品说明书的要求，在正向引物ATG碱基前添加 CACC四个碱基。W pLB-AaMYC4质 粒为模板，用平末端高保真酶K0D进行PCR扩增，PCR产物回收纯化后通过Gateway克隆技术 的方法连接到祀NTR-T0P0载体，具体方法按照Invi化ogen公司祀NTR/D-T0P0克隆试剂盒说 明书进行。
[0061 ] 2、包含目的基因的植物表达载体构建。按照Invitrogen公司LR Clonase II Enzyme试剂盒将将中间载体祀NTR-T0P0-AaMYC4与祀earlygatel04植物表达载体进行LR反 应，反应体系按试剂盒说明书配制，放置于25°C金属浴反应3小时后转化大肠杆菌D册a感受 态，进行阳性克隆PCR验证，最终获得包含有目的基因的pEearlygatel04-AaMYC4植物表达 载体。
[00创实施例3.青葛素合成途径特异基因启动子双巧光素报告载体的构建
[0063] 1、PCR扩增青葛素合成途径特异基因的启动子。根据NCBI数据库中青葛ADS基因的 启动子(GenBank: DQ448297.1)序列信息，设计ADS基因启动子扩增特异引物，正反特异引物 分别含有Kpn I和Pst I酶切位点，引物序列如下：
[0064] ProADS F 5，-gg化ccACCGGGGACCTCTAGAGATC-3,，
[00化]ProADS R 5，-ctgcagGATTTTACAAACTTTGAA-3，。
[0066] 同样的，根据NCBI数据库中青葛CYP71AV1基因的启动子(GenBank:FJ870128.1)序 列信息，设计分别含有Kpn I和Pst I酶切位点的CYP71AV1启动子特异引物，引物序列如下：
[0067] ProCYP F 5'-ggtaccATGGGTCAATTTCGGGTTG-3'，
[006引 ProCYP R 日'-ctgcagTGCTTTTAGTATACTCTTC-3'；
[00例根据NCBI数据库中青葛DBR2基因的启动子(GenBank:KC118524.1)序列信息，设计 分别含有Kpn I和Pst I酶切位点的DBR2启动子特异引物，引物序列如下：
[0070] ProDBR2F5'-gg^ccAAGATGAGATAGGGAACTAAC-3'，
[0071 ] ProDBR2R 5 '-ctgcagTATTGAGTTTGATGTTGACC-3 '；
[0072] 根据NCBI数据库中青葛ALDHl基因的启动子(GenBank:KC118522.1)序列信息，设 计分别含有Kpn I和Pst I酶切位点的ALD化启动子特异引物，引物序列如下：
[0073] ProALDHlF 5'-ggtaccATGAACCATTAGAAGGGAAGG-3'，
[0074] ProALDHlR 5'-ctgcagCTTTGTTTTTTATGAAA-3'；
[0075] W青葛基因组DM为模板，PCR扩增上述4个启动子片段，回收纯化。
[0076] 2.启动子PCR产物连接入双巧光素报告载体。将上述PCR产物用Kpn I和Pst I双酶 切，回收酶切片段，将4个酶切回收后的片段连入用Kpn I和Pst I双酶切后回收的 pGreenII0800-LUC载体片段，构建植物双巧光素检测报告载体pGreenllOSOO-ProADS、 pGreenII0800-ProCYP71AVl、pGreenII0800-ProDBR2和pGreenllOSOO-ProALDHl。
[0077] 实施例4.烟草瞬时转化检测基因与启动子激活作用
[0078] 1、农杆菌工程菌株的获得，将祀earlygatel04空载体、pEearlygatel04-AaMYC4表 达载体和4个启动子双巧光检测报告载体通过冻融法转化入根癌农杆菌GV3101菌株中，获 得包含有空载体的农杆菌工程菌株、包含有AaMYC4基因的农杆菌工程菌株和4个包含有启 动子的农杆菌工程菌株。
[0079] 2、农杆菌工程菌株的扩大培养与处理。将上述6个农杆菌工程菌株在包含50mg/L 利福平+20mg/L庆大霉素巧Omg/L卡那霉素 S种抗生素的LB培养液中扩大培养(5mL)，28°C， 220转/分钟，培养过夜。第二天测定菌液浓度，当农杆菌菌液浓度达到0D600值在20D~ 2.50D左右后停止培养。离屯、，收集农杆菌，然后用lOmM浓度MgCl2溶液重悬浮菌体，调整重 悬浮菌液0D值为0.6。向重悬浮菌液中添加乙酷下香酬，其浓度为200mM。将上述重悬浮农杆 菌菌液静置3小时。
[0080] 3、注射侵染法瞬时转化烟草。将上述静置处理后的包含有空载体的农杆菌工程菌 株与4个包含有启动子的农杆菌工程菌株分别按3:1浓度比例混合，作为对照组;将包含有 目的基因 AaMYC4表达载体的农杆菌工程菌株与4个包含有启动子的农杆菌工程菌株也分别 按3:1浓度比例混合，作为实验组。通过1ml的注射器，将混合后的农杆菌菌夜注射到生长5 周左右的烟草叶片中，黑暗培养1天然后转到光下培养。
[0081 ] 4、Dual-Luciferase检测。用直径为1.0cm的圆形打孔器，取注射后培养2天的烟草 叶片，用液氮速冻后研磨成粉末；采用Promega Dual-Luciferase检测试剂盒检测巧光强 度，按Promega公司说明书的方法操作。
[0082] 本发明中AaMYC4基因能够显著抑制青葛素生物合成途径中ADS，CYP71AV12，DBR2 和ALDHl运4个重要的结构基因启动子的表达，与对照组相比，AaMYC4能显著抑制DBR2启动 子表达活性至对照组的11. 1 %左右，能够显著抑制ALDH1启动子表达活性至对照组的 20.8%左右，能够显著抑制ADS启动子表达活性至对照组的25.0%左右，CYP71AV1运个启动 子的表达也有一定的抑制能力。通过本发明为进一步利用该基因在青葛中RNAi抑制表达进 而提高青葛中青葛素的含量提供了有力的实验证据。
[0083] W上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创 造性劳动就可W根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员 依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可W得到的技术 方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种青蒿bHLH类转录因子编码序列，其特征在于，所述编码序列记为AaMYC4,所述 AaMYC4的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。2. -种青蒿bHLH类转录因子编码序列，其特征在于，所述AaMYC4编码的氨基酸序列如 SEQIDN0.2**。3. -种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4. 一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷 酸序列的开放阅读框序列，所述开放阅读框序列如SEQ ID NO.3所示。5. -种重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体包含如SEQ ID NO. 1所示的 核苷酸序列的开放阅读框序列，所述开放阅读框序列如SEQ ID NO.3所示。6. 根据权利要求1或2所述的青蒿bHLH类转录因子编码序列AaMYC4在提高青蒿素含量 中的应用。7. 根据权利要求1所述的青蒿bHLH类转录因子编码序列AaMYC4的克隆方法，其特征在 于，所述克隆方法包括以下步骤： 步骤1、总RNA的提取与纯化，采用各种通用的植物总RNA提取试剂盒提取并纯化获得青 蒿叶片总RNA; 步骤2、用反转录酶将所述青蒿叶片总RNA反转成cDNA; 步骤3、以所述cDNA为模板，通过设计基因特异引物，采用PCR的方法扩增，获得PCR产 物，所述基因特异引物为： 正向引物PI: 5 '-TATAAAACATGCGGCATTATTGC-3 ' 反向引物P2:5 ' -TCACTATTACGTCATTCCACCAC-3; 步骤4、PCR产物回收纯化测序，获得如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。8. 根据权利要求4所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以 下步骤： 步骤1、根据SEQ ID N0.1序列设计扩增AaMYC4基因开放阅读框序列，扩增引物如下： 正向引物P3:5 ' -CACCATGTTATTACTAAACTCAACC-3 ' 反向引物P4:5 ' -ATCCAAGCACATTTTGTTGAG-3 ' ； 步骤2、将PCR扩增产物回收纯化后连接pENTR-TOPO载体； 步骤3、将连接入AaMYC4基因的pENTR-TOPO载体与pEearlygatel04植物表达载体通过 LR反应的方式构建含有目的基因的pEearlygate104-AaMYC4植物表达载体。9. 一种快速检测根据权利要求2所述的AaMYC4编码的氨基酸序列的生物学功能的方 法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 步骤1、根据SEQ ID N0.1序列设计扩增AaMYC4基因开放阅读框序列，扩增引物如下： 正向引物P3:5 ' -CACCATGTTATTACTAAACTCAACC-3 ' 反向引物P4:5 ' -ATCCAAGCACATTTTGTTGAG-3 ' ； 步骤2、将PCR扩增产物回收纯化后连接pENTR-TOPO载体； 步骤3、将连接入AaMYC4基因的pENTR-TOPO载体与pEearlygatel04植物表达载体通过 LR反应的方式构建含有目的基因的pEearlygate104-AaMYC4植物表达载体； 步骤4、将青蒿中青蒿素合成途径特有ADS基因的启动子ProADS连接入pGreenII0800-LUC载体，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProADS; 步骤5、将青蒿中青蒿素合成途径特有CYP71AV1基因的启动子Pr〇CYP71AVl连接入 pGreenII0800-LUC载体，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProCYP71AVl; 步骤6、将青蒿中青蒿素合成途径特有DBR2基因的启动子Pr〇DBR2连接入 pGreenII0800-LUC载体，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2; 步骤7、将青蒿中青蒿素合成途径特有ALDH1基因的启动子ProALDHl连接入 pGreenII0800-LUC载体，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProALDHl; 步骤8、将所述pEearlygate104-AaMYC4植物表达载体和所述植物双荧光素检测报告载 体pGreenII0800-ProADS、pGreenII0800-ProCYP71AVl、pGreenII0800-ProDBR2和 pGreenII0800-Pr〇ALDHl分别转化入农杆菌中，获得包含目的载体的农杆菌工程菌株； 步骤9、将包含所述pEearlygatel04-AaMYC4植物表达载体的农杆菌工程菌株和包含所 述植物双荧光素检测报告载体的农杆菌工程菌株混合后，通过注射侵染的方式注射到生长 5周的烟草叶片中； 步骤10、取注射后培养2天的所述烟草叶片，用液氮速冻后研磨成粉末； 步骤11、采用Promega-Dual-Luciferase检测试剂盒检测焚光强度，确定AaMYC4基因与 青蒿素合成途径特有基因启动子的激活作用。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤8中，宿主菌为农杆菌GV3101菌 株;所述步骤9中，包含所述pEearlygatel04_AaMYC4植物表达载体的农杆菌工程菌株和包 含所述植物双荧光素检测报告载体的农杆菌工程菌株混合比例为按3:1浓度混合。
【文档编号】C12N15/66GK106047897SQ201610680603
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月17日
【发明人】唐克轩, 沈乾, 赵彧, 王玉亮
【申请人】上海交通大学