鼠疫菌Southern印记杂交检测方法
【专利摘要】鼠疫菌Southern印记杂交检测方法，其特征在于：包括以下步骤：鼠肝脏DNA的获取，探针引物的制备，基因组DNA酶切，酶切产物的电泳，转膜，杂交和洗膜、信号检测。本发明的应用能有效的避免鼠疫菌检测过程中假阳性的出现，能准确判断样本的阴阳性，避免传统方法中的分离培养、鼠疫噬菌体裂解试验和动物实验等的繁琐步骤，能够快速、准确的判断样本，可广泛用于口岸不同媒介生物监测点的鼠类样品检测。
【专利说明】
鼠疫菌Southern印巧杂交检测方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种生物病原体的检测技术手段，特别是一种应用Southern印记杂交 法快速检测鼠疫菌的方法。
【背景技术】
[0002] 目前，鼠疫菌的监测方法主要为W下几种：
[0003] 鼠疫菌检测的经典方法-常规检测方法检测鼠疫菌，检测步骤主要包括显微镜涂 片检查、分离培养、鼠疫隧菌体裂解试验和动物实验，包括涂片后进行革兰染色、Wayson染 色或免疫巧光法观察，分别从细菌形态鉴定、F1抗原检测、毒力判定几个方面全方位的鉴定 了鼠疫菌，运种方法有利于研究者对鼠疫疫源地和流行强度的研究，但是运种方法耗时长、 过程复杂、需要研究者具有较丰富的研究经验。
[0004] 免疫学检测法的研究基础仍是针对芙膜抗原-F1抗原展开的实验研究。国内主要 采用的方法是间接血凝试验（IHA)和反向血凝试验(RIHA)，但是由于其敏感性和特异性相 对较低，操作复杂的特点，很少用于口岸的检测检验，至今为止，IHA是国内外一致公认鼠疫 追溯诊断的有效方法，也是我国应用最为广泛的一种血清学诊断方法。但是IHA不能对鼠疫 患者进行早期诊断，而且有报道IHA出现假阳性结果;RIHA基层应用较多，但此种方法受到 试剂、溶液酸碱度等的影响，使得特异性受到一定限制。近年来，国外兴起的快速诊断技术- 胶体金免疫层析法（Immunochromatogra地y Assay)应用于鼠疫的快速诊断效果较好，在医 学检验中得到了广泛应用，其敏感性和特异性都超过了化ISA等诊断手段。
[0005] 聚合酶链反应(PCR)检测是时下比较热口的分子生物学技术，广泛应用于很多领 域中，随着现代分子生物学技术的发展，鼠疫研究领域中PCR逐步得到应用与完善。PCR作为 检测手段，引物设计非常重要，选择合适的鼠疫耶尔森氏菌特异的DNA祀序列是决定试验系 统特异性和灵敏性的关键所在。但是由于PCR检测受到实验条件、仪器储备等多方面的限制 W及容易导致结果假阳性的出现，使得该技术在鼠疫检测中的应用较少，不能全面的推广。
[0006] 全自动微生物分析系统(AMS)是一种由传统生化反应及微生物检测技术与计算机 技术相结合，运用概率最大近似值模型法进行自动微生物检测的技术，该系统具有准确、快 速、操作简单、用材节约、自动化强等优点，因其技术要求高，操作条件受到限制，一直未能 在实际应用中得到推广。
[0007] Southern印记杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。其基本原理 是:具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂 交过程是高度特异的。Southern印记杂交技术十分灵敏，在理想的条件下，用放射性同位素 标记的特异性探针和放射自显影技术，即便每条电泳带仅含化神NA也能被清晰地检测出 来。
[000引在1978年，简悦威等医学家在镶状细胞贫血症的基因诊断中就采用过Southern杂 交的方法，取得了基因诊断的突破。2005年，杨娥等人采用Southern印记杂交技术检测 HPV1抓NA在宫颈癌组织中的物理状态;2007年，郭新梅等人采用Southern印记杂交技术检 测木糖异构酶基因是否整合入转基因植株中；2014年，张伟溪等人采用Southern印记杂交 检测证实外源基因 W单拷贝方式整合到5个转基因株系体内，并取得了较好的实验结果。多 年来，Southern印记杂交技术因其特异性强，灵敏性高的特点，多用在检测遗传病诊断、外 源基因检测、DNA图谱分析、PCR产物分析等方面。但在鼠疫菌检测方面并未找到相关的文献 及技术操作。
【发明内容】
[0009] 发明的目的在于提供一种采用Southern印记杂交技术建立一种边境口岸鼠疫检 测的新方法，广泛用于口岸不同媒介生物监测点的鼠类样品检测。本发明的应用能有效的 避免鼠疫菌检测过程中假阳性的出现，能准确判断样本的阴阳性，避免传统方法中的分离 培养、鼠疫隧菌体裂解试验和动物实验等的繁琐步骤，能够快速、准确的判断样本。
[0010] 本发明的目的是运样实现的：鼠疫菌Southern印记杂交检测方法，其特征在于:包 括W下步骤：鼠肝脏DNA的获取，探针引物的制备，基因组DNA酶切，酶切产物的电泳，转膜， 杂交和洗膜、信号检测。
[0011] 本发明的目的还可W运样实现：
[0012] 所述的探针引物的制备为:实验通过NCBI查阅鼠疫菌特异基因 Pla的序列，设计引 物，通过聚合酶链反应(PCR反应)从去毒的鼠疫菌基因组片段质粒上扩增基因 Pla的部分序 列并测序;采用Dig-加 TP在Klenow酶的作用下，经随机引物PCR扩增可渗入到新合成的DNA 分子中，从而完成DNA探针的标记。
[001引所述的探针引物的具体制备方法为：
[0014] 1)探针序列：
[0015] CGATTACTGATGTAATTATGGGGTTTCCGATTGATACGGAGATGGAGAAAGACAGTGAATATTCAAATA AGATCCGCCAGGAAAGTAAAATTTCAAAAACTGAAGGGACCGTGTCTTACGAACAGAAAATAACTGTTGAAACAGGT CAGGAAAAAGACGGTGTGAAAGTCTACCGTGTCATGGTTCTTGAGGGAACGATTGCCGAATCTATTGAACATCTCGA TAAGAAAGAGAACGAAGACATTCTGAATAATAACCGAAATCGCATCGTCCTAGCGGACAACACTGTCATTAACTTTG ACAATATTAGTCAACTGAAGGAATTTTTACGTCGTTCGGTAAATATTGTTGACCACGATATTTTCTCCAGTAATGGT TTTGAAGGGTTTAATCCGACAAGTCATTTTCCGTCTAATCCTAGTAGCGATTATTTTAACAGTACCGGTGTTACATT CGGTTCCGGGGTTGACCTTGGTCAGCGCCAA
[0016] 2)探针的标记：
[0017] 本探针用地高辛标记技术，用化学方法把类固醇类半抗原地高辛分子连接在加 TP 上(Dig-加 TP);用随机引物及DNA多聚酶，W探针DNA为模板，合成互补DNA，化学修饰过的 加 TP同时渗入到标记的DNA探针中；杂交后用碱性憐酸酶标记的抗地高辛单抗与标记探针 DNA中的Dig-加 TP结合，加入显色底物，在碱性憐酸酶作用下，转变成蓝色的化合物；
[001引3)探针的制备方法：
[0019]随机引物标记的DNA带有地高辛-11-加 TP，运一标记采用的是地高辛高效引物试 剂，运是一种含有随机六碳糖，dNTP混合物的5 X浓度标记混合物，其中dNTP混合物包括碱 性标记的地高辛-11-加 TP，标记级的Klenow酶和适合的反应缓冲液;利用PCR技术扩增鼠疫 菌PLA基因的特异性片段，进行纯化并用roche试剂盒标记探针;具体步骤如下：
[0020] a)向一个反应管仲中加入化g模板DNA和高压灭菌的双蒸水，终体积达l&iL
[0021 ] b)沸水浴10分钟W变性DM,然后迅速插入冰水混合物中；
[0022] C)充分混合DIG-High Prime,并取化L加入到变性DNA中，混合并简单离屯、；37°C解 育1小时或者过夜；
[0023] d)65°C加热10分钟终止反应。
[0024] 所述的基因组DNA酶切条件为37°C，1小时，酶切体系如下：
[0025]
[0026] 所述的转膜为:将酶切好的样本基因组进行电泳，利用真空累将胶内DNA片段转印 到带有正电荷的尼龙膜上。
[0027] 所述的杂交为:对已标记的探针进行变性并将其混入杂交液中，将转印膜放入杂 交液中浸泡地。
[002引所述的洗膜为:用足够的2XSSC 0.5%SDS连续振荡洗涂两次，每次5分钟。
[0029] 所述的信号检测为:对杂交膜进行显色处理，采用图像仪曝光后观察结果。
[0030] 本发明的技术效果是：鼠疫菌具有较强的传染性，获得其样品比较困难，也导致了 其鉴定比较困难。将Southern印记杂交技术应用于鼠疫检测的研究，在该菌种的研究应用 中为首次。依据鼠疫菌本身的菌种特点，在本发明中设计了特异性较强的探针引物，回避掉 在W往PCR研究中采用两个基因同时检测确定阳性的问题。同时依据菌种特点在Southern 印记杂交检测实验步骤中对所设及到的时间、溫度等条件作出了明确的限制。
[0031] 本发明的应用能有效的避免鼠疫菌检测过程中假阳性的出现，能准确判断样本的 阴阳性，避免传统方法中的分离培养、鼠疫隧菌体裂解试验和动物实验等的繁琐步骤，能够 快速、准确的判断样本，可广泛用于口岸不同媒介生物监测点的鼠类样品检测。
【附图说明】
[0032] 图1本发明检测方法技术路线图
[0033] 图2利用特异性引物PCR方法检测样本的电泳图
[0034] 图3对杂交膜进行显色处理后采用图像仪曝光后显示出的pla杂交片段图
【具体实施方式】
[0035] 本发明鼠疫菌Southern印记杂交检测方法，具体操作步骤如下：
[0036] 一、采用宝生物DNA提取试剂盒(No. 9765)提取鼠肝脏组织获取总DNA。
[0037] 二、探针引物的制备
[003引 鼠疫菌引物探针序列为自行设计，通过R0C皿的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Stader Kit II试剂盒进行探针标记。采用紫外交联仪固定DNA探针，用杂 交检测方法进行信号检测，确定探针浓度。
[0039] 鼠疫杆菌有很强的传染性，能引起烈性传染病，属我国法定甲类传染病之一。鼠疫 在世界历史上曾有过多次大流行，死亡众多，曾经是危害人类最严重的烈性传染病之一。尽 管人间鼠疫在许多国家现已不再是一个严重问题，但一些疫源地还连续发现零星暴发。然 而其病源鉴定比较困难，准确率不高。然而基因杂交技术的准确性非常高。本实验利用鼠疫 菌的特异性基因，制作特异性探针，利用DNA杂交技术鉴定病源。即将Southern blot应用在 鼠疫菌的检测鉴定上，将其简化形成试剂盒的形式，应用于边防检疫口岸。
[0040] 1)探针序列：
[0041 ] CGATTACTGATGTAATTATGGGGTTTCCGATTGATACGGAGATGGAGAAAGACAGTGAATATTCAAATA AGATCCGCCAGGAAAGTAAAATTTCAAAAACTGAAGGGACCGTGTCTTACGAACAGAAAATAACTGTTGAAACAGGT CAGGAAAAAGACGGTGTGAAAGTCTACCGTGTCATGGTTCTTGAGGGAACGATTGCCGAATCTATTGAACATCTCGA TAAGAAAGAGAACGAAGACATTCTGAATAATAACCGAAATCGCATCGTCCTAGCGGACAACACTGTCATTAACTTTG ACAATATTAGTCAACTGAAGGAATTTTTACGTCGTTCGGTAAATATTGTTGACCACGATATTTTCTCCAGTAATGGT TTTGAAGGGTTTAATCCGACAAGTCATTTTCCGTCTAATCCTAGTAGCGATTATTTTAACAGTACCGGTGTTACATT CGGTTCCGGGGTTGACCTTGGTCAGCGCCAA
[0042] 2)探针的标记：
[0043] 本探针用的是地高辛标记技术，用化学方法把类固醇类半抗原地高辛分子连接在 加 TP上化ig-加 TP)。用随机引物及DNA多聚酶，W探针DNA为模板，合成互补DNA，化学修饰过 的加 TP同时渗入到标记的DNA探针中。杂交后用碱性憐酸酶标记的抗地高辛单抗与标记探 针DNA中的Dig-加 TP结合，加入显色底物，在碱性憐酸酶作用下，转变成蓝色的化合物。
[0044] 3)探针的制备方法：
[0045] 随机引物标记的DNA带有地高辛-11-加 TP，运一标记采用的是地高辛高效引物试 剂，运是一种含有随机六碳糖，dNTP混合物的5 X浓度标记混合物，其中dNTP混合物包括碱 性标记的地高辛-11-加 TP，标记级的Klenow酶和适合的反应缓冲液。利用PCR技术扩增鼠疫 菌PLA基因的特异性片段，进行纯化并用roche试剂念标记探针。
[0046]
[0047] S、基因组DNA酶切
[004引对鼠肝脏组织DNA进行酶切，酶切条件为37°C，化，酶切体系如下：
[0049]
[0050] 四、电泳
[0051 ] 对酶切鼠肝脏组织DNA进行电泳：1%浓度琼脂糖凝胶，100ml TBE buffer中加入 lOiil lOmg/ml漠化乙锭化B)，将凝胶放置其中染色30分钟，照相。
[00对五、转膜
[0053] 1.将胶裁成9.8cm X 8.0cm大小，于平皿中用蒸馈水冲洗一次；
[0化4] 2.加入100ml 0.25mol/L的盐酸脱嚷岭，室溫振荡15min，至漠酪蓝完全变成黄色。
[0055] 3.用蒸馈水冲洗2次。加入变性液（1.5mol/L化Cl、0.5mol/L NaOH)室溫振荡 30min;至漠酪蓝完全恢复到原来的蓝色。
[0056] 4.用蒸馈水冲洗2次。加入中和液（1.5111〇1/1化(：1、1.〇111〇1/1化13-(：1，抑7.4)室 溫振荡2次，每次15min;
[0057] 5.用蒸馈水冲洗2次。加入2 X SSC平衡凝胶和尼龙膜5min;
[0化引 6、虹吸印记法转膜26小时：
[0059] 1)在方盘上放置平板，其上放置滤纸，滤纸两端搭入盘内浸入2XSSC中，用玻璃棒 赶走滤纸和平板之间的气泡。
[0060] 2)将凝胶倒置于平台上，正面朝下，切掉右下角，并用保鲜膜封闭四周W防止吸水 纸接触凝胶的边缘从而接触平板造成液流的短路。
[0061 ] 3)将尼龙膜放于胶上，赶走气泡。
[0062] 4)膜上放两张滤纸，其上再放20层吸水纸。
[0063] 5)吸水纸上放一平板，其上放500g左右的重物，目的是建立液体从液池经凝胶向 尼龙膜的上行通路，W洗脱凝胶中的DNA并使其聚集到尼龙膜上。
[0064] 6)室溫下过夜转膜，持续16小时W上，期间换纸2-3次。
[0065] 7)完成转膜后，胶染色，观察转膜效果。并标记好序号、加样孔位置和对应分子量 标准的位置，尼龙膜和凝胶直接接触的一面为正面。
[0066] 8)用2XSSC漂洗尼龙膜一次，滤纸吸干，紫外交联仪下照射固定DNA(500化J/cm2) 5min〇
[0067] 六、杂交
[006引1)预杂交:取8.0ml 65°C预热的Hyb高效杂交液化yb-100)，加入杂交管中，排尽气 泡，65 °C杂交炉中预杂交化(8-15转/分）。
[0069] 2)探针变性:将已标记好的探针沸水浴中变性10分钟，立即放冰水浴冷却1 Omin。
[0070] 3)杂交:排尽预杂交液，在8.0ml新Hyb高效杂交液化yb-100)加入4.化1新变性好 的探针，混匀。65 °C杂交仪中杂交过夜。
[0071] 屯、洗膜、信号检测
[0072] l)杂交后室溫下，20mL2XSSC/0.1%SDS洗膜2X5min。
[0073] 2)50°C，20mL0.1 XSSC/0.1 %SDS洗涂2X 15min。（洗液需要先预热到50°C)
[0074] 3)再将膜置于20mL洗涂缓冲液中平衡2-5min。
[0075] 4)将膜在lOmL阻断液中阻断30min(在摇床上轻轻摇动）。
[0076] 5)封闭完成后倒出阻断液，加入稀释好的lOmL抗体溶液，浸膜至少30min。
[0077] 6)去除抗体溶液，用20mL洗涂缓冲液缓慢洗膜2次，每次15min。
[0078] 7)去除洗涂缓冲液，在20mL检测液中平衡膜2次，每次2min。
[0079] 8)用检测缓冲液稀释30化L NBT/BCIP化学显色底物，在约15mL新鲜制备的显色
[0080] 液中反应显色，在显色过程中勿摇动。
[0081 ] 9)当达到所需的点或带强度后，用50ml双蒸水或TE缓冲液洗涂5min终止反应，照 相记录结果。
[0082] 本发明应用Southern印记杂交技术对鼠疫菌的检测方法进行了如下实验研究并 取得意想不到的效果。
[0083] 1.鼠疫菌特异性基因 Pla的引物设计及鉴定，实验通过NCBI查阅鼠疫菌特异基因 Pla的序列，设计引物，通过聚合酶链反应(PCR反应)从去毒的鼠疫菌基因组片段质粒（中国 检验检疫科学研究院赠送)上扩增基因 Pla的部分序列并测序。
[0084] Pla引物序列表格 「00851
[0086] 2.初步鉴定样本的有效性，利用上述引物PCR方法检测实际样本，观察是否有特异 性条带的出现，初步对所得样本的有效性进行判断。验证结果电泳图片结果显示如图2所 /J、- 〇
[0087] 3. Southern印记实验的简单过程和图片结果，利用上述特异性引物从去毒的鼠疫 菌基因组片段质粒（中国检验检疫科学研究院赠送)上扩增鼠疫菌特异基因 Pla的部分序 列，纯化产物，并用地高辛标记此片段制备杂交探针，利用DNA杂交技术使探针与所收集样 本中的特异性序列结合并显色，从而对所得样本做有效性判断。实验步骤及结果如下：
[00则 （1)测定样本模板浓度:DNA浓度用紫外分光光度计测定，核酸的光吸收值位于波 长260nm处，蛋白质则位于280nm，分别测定后，其0D260/0D280的比值应大于1.8.低于此值， 说明DNA中仍残留较多的蛋白质，此时可用酪、氯仿继续抽提纯化。若比值大于1.9表明DNA 链破坏，断裂严重，已成为小分子，因此操作应轻柔。
[0089] (2)基因组DNA酶切：限制性内切酶(RE)可裂解双链DNA，每种酶的特点是具有高度 特异性的DNA裂解点和不同电离子强度的特殊反应条件。单位(U)RE活性是在37°C1小时内 能将化g DNA所有特异性位点切断的酶用量。若用两种W上不同的内切酶，要注意RE的最适 盐浓度，要由低向高逐级添加适量盐逐个进行DNA切割。
[0090] (3)探针的制备:采用Dig-加 TP在Klenow酶的作用下，经随机引物引物PCR扩增可 渗入到新合成的DNA分子中，从而完成DNA探针的标记。
[0091] (4)转膜，将酶切好的样本基因组进行电泳，利用真空累将胶内DNA片段转印到带 有正电荷的尼龙膜上。
[0092] (5)杂交，对已标记的探针进行变性并将其混入杂交液中，将转印膜放入杂交液中 浸泡地。
[0093] (6)洗膜，用足够的2XSSC 0.5%SDS连续振荡洗涂两次，每次5分钟。
[0094] (7)信号检测，对杂交膜进行显色处理，采用图像仪曝光后观察结果。所得实验结 果见图3。
[00M]从W上Southern印记杂交实验结果可见，目前的实验基础初步确定了本方法在鼠 疫Southern印记杂交检测中的方法具有可行性和有效性。
【主权项】
1. 鼠疫菌Southern印记杂交检测方法，其特征在于:包括以下步骤：鼠肝脏DNA的获取， 探针引物的制备，基因组DNA酶切，酶切产物的电泳，转膜，杂交和洗膜、信号检测。2. 根据权利要求1所述的鼠疫菌Southern印记杂交检测方法，其特征在于:探针引物的 制备:实验通过NCBI查阅鼠疫菌特异基因Pla的序列，设计引物，通过聚合酶链反应从去毒 的鼠疫菌基因组片段质粒上扩增基因 Pla的部分序列并测序;采用Dig-dUTP在Klenow酶的 作用下，经随机引物PCR扩增可掺入到新合成的DNA分子中，从而完成DNA探针的标记。3. 根据权利要求1或2所述的鼠疫菌Southern印记杂交检测方法，其特征在于:所述的 探针引物的具体制备方法为： 1) 探针序列：2) 探针的标记： 本探针用地高辛标记技术，用化学方法把类固醇类半抗原地高辛分子连接在dUTP上 (Dig-dUTP);用随机引物及DNA多聚酶，以探针DNA为模板，合成互补DNA，化学修饰过的dUTP 同时掺入到标记的DNA探针中；杂交后用碱性磷酸酶标记的抗地高辛单抗与标记探针DNA中 的Dig-dUTP结合，加入显色底物，在碱性磷酸酶作用下，转变成蓝色的化合物； 3) 探针的制备方法： 随机引物标记的DNA带有地高辛-11-dUTP，这一标记采用的是地高辛高效引物试剂， 这是一种含有随机六碳糖，dNTP混合物的5 X浓度标记混合物，其中dNTP混合物包括碱性标 记的地高辛-11-dUTP，标记级的K1 enow酶和适合的反应缓冲液；利用PCR技术扩增鼠疫菌 PLA基因的特异性片段，进行纯化并用roche试剂盒标记探针;具体步骤如下： a) 向一个反应管仲中加入lyg模板DNA和高压灭菌的双蒸水，终体积达16yL; b) 沸水浴10分钟以变性DNA，然后迅速插入冰水混合物中； c) 充分混合DIG-High Prime，并取4yL加入到变性DNA中，混合并简单离心；37°C孵育1 小时或者过夜； d) 65°C加热10分钟终止反应。4. 根据权利要求1所述的鼠疫菌Southern印记杂交检测方法，其特征在于:所述的基因 组DNA酶切条件为37°C，1小时，酶切体系如下： 组份 加量 IQxburter 4,5卩1 HindHI 内切酶 65yl 样品 DNA 25 ng ddH20 补足水至45pU于37°C水浴中酶切20h。5. 根据权利要求1所述的鼠疫菌Southern印记杂交检测方法，其特征在于:所述的转膜 为:将酶切好的样本基因组进行电泳，利用真空栗将胶内DNA片段转印到带有正电荷的尼龙 膜上。6. 根据权利要求1所述的鼠疫菌Southern印记杂交检测方法，其特征在于:所述的杂交 为:对已标记的探针进行变性并将其混入杂交液中，将转印膜放入杂交液中浸泡4h。7. 根据权利要求1所述的鼠疫菌Southern印记杂交检测方法，其特征在于:所述的洗膜 为:用足够的2 X SSC 0.5%SDS连续振荡洗涤两次，每次5分钟。8. 根据权利要求1所述的鼠疫菌Southern印记杂交检测方法，其特征在于:所述的信号 检测为:对杂交膜进行显色处理，采用图像仪曝光后观察结果。9. 根据权利要求3所述的鼠疫菌Southern印记杂交检测方法，其特征在于:所述的基因 组DNA酶切条件为37°C，1小时，酶切体系如下： 组份 加量 1.0.x.buffer_ 4,5 (il HindHI 内切酶 6,5 ii 1 〇 样品 DNA 25 W g ddH20 补足水至45wl，于37SC水浴中酶切20h10. 根据权利要求9所述的鼠疫菌Southern印记杂交检测方法，其特征在于:所述的转 膜为:将酶切好的样本基因组进行电泳，利用真空栗将胶内DNA片段转印到带有正电荷的尼 龙膜上。
【文档编号】C12Q1/04GK106047995SQ201610331104
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月18日
【发明人】靳木子, 郝广福, 邰大鹏, 王莉娜, 云托娅, 白潇
【申请人】靳木子