一种人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种试剂盒，特别是一种人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂合
ΙΤΓΤ.0
【背景技术】
[0002]随着现在科学技术的不断发展，用于人类血液细胞的分离技术不断地发展和优化，目前基于密度梯度法的干细胞分离方法在临床上得到较广的应用。但是不同方法及操作步骤产生的效果不同，各有利弊，总体而言，存在如下几个问题:(1)不能标准化。比如申请号为200610035900.5的“一种干细胞分层液及其用于干细胞分离的方法”需要操作者自己配制工作液，而且需要调节比重，此方法增加了操作者的人为影响因素，不利于干细胞分离的推广和产业化。(2)红细胞去除不干净:比如申请号为200610035900.5的“一种干细胞分层液及其用于干细胞分离的方法”特别是对于脐带血来说，该专利方法除不净红细胞，最终临床应用的时候大大增加了患者产生排异反应的风险；申请号为200910187212.4的“人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒及细胞处理方法”也存在相同的缺点；(3)干细胞得率不高:比如申请号为200610114475.9的“用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒”，其缺点是分离的干细胞得率数量不高，需要进行细胞培养，但是由此增加了细胞污染率，同时体外细胞扩增所产生的细胞功能性不稳定，很难用于临床治疗；另外申请号为200610106875.5的“一种有核细胞体外分离试剂盒及其应用方法”所采用的HIST0PAGUE077的密度1.077的淋巴细胞分离液，经分离后的细胞绝大多数为淋巴细胞，这样直接导致细胞中能够用于治疗的干细胞占少数，影响临床疗效；(4)分离纯化成本太高:比如申请号为200710137781.9的“骨髓脐带血干细胞体外分离试剂盒及其应用方法”的专利，其试剂中添加了 Iin抗体，导致成本大大提高，投入临床使用后，大大增加了患者的经济负担，导致患者看不起病，接受不起细胞治疗，并且使用了 Iin抗体对细胞清洗造成了较大负担，此种物质进入人体后对人体的影响还是个未知数，还有待进一步研宄。(5)没有考虑蛋白沉淀、细胞凝聚因素对后期干细胞应用的风险:采用离心的方式分离纯化干细胞，在操作过程中往往由于脐血、外周血样品质量不同，干细胞在纯化过程中产生凝聚和沉淀，但此沉淀如果没有及时去除，在后期的应用过程中容易造成患者的微血管栓塞，影响治疗效果，严重者可危及患者的生命安全。
【实用新型内容】
[0003]本实用新型所要解决的技术问题就是提供一种操作性强、临床安全性高、便于临床推广的人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒，使其易于存储运输、可产业化、使用方便快捷。
[0004]本实用新型提供一种人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒，包括盒盖、盒体，所述盒体内设置有与盒体尺寸大小相同的衬垫，所述衬垫设置有四个圆柱形凹槽，所述四个圆柱形凹槽分别放置有:装有PBS溶液的试剂瓶，装有密度液的试剂瓶，装有0.9%氯化钠注射液的试剂瓶，装有0.8%氯化氨溶液的试剂瓶，所述四个圆柱形凹槽的直径分别与上述四个试剂瓶的外径相等，其中，PBS溶液为稀释液；0.9%氯化钠液为洗涤液；0.8%氯化氨溶液为除红细胞液。
[0005]进一步地，密度液可以为泛影酸钠-聚蔗糖400#或HIST0PAQUE1077或Ficoll，所述泛影酸钠-聚蔗糖400#是由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.077±0.001的密度液。
[0006]进一步地，装有PBS溶液的试剂瓶、装有密度液的试剂瓶和装有0.9%氯化钠注射液的试剂瓶的表面两侧均分别设有便于手持的圆形凹槽，这样，在取用或观察试剂时，能够便于手持。
[0007]进一步地，装有PBS溶液的试剂瓶规格为250mL，装有密度液的试剂瓶规格为150mL，装有0.9%氯化钠注射液的试剂瓶规格为250mL，装有0.8%氯化氨溶液的试剂瓶规格为50mL，上述试剂瓶瓶体表面均设有相应的体积刻度。
[0008]进一步地，所述衬垫为纸衬垫或海绵衬垫或泡沫衬垫。
[0009]本试剂盒包含分离纯化试剂盒的所有溶液，无需使用者另外准备溶液，省去使用者的准备工作，也避免使用者人为的污染或者第三方污染引入，适用于人类骨髓、脐带血、外周血的干细胞分离，对于不同的样品，试剂组成相同，避免了国内现有的一些专利只能分离人类骨髓和脐带血，不能分离外周血的问题。
[0010]另外，本实用新型可根据样品体积的需要，按比例加入不同体积的试剂溶液进行操作即可，适用于临床小批量样品的操作或者大批量操作，避免了样品的浪费，是临床上迫切需要的一种分离细胞的试剂盒。
【附图说明】
[0011]图1为本实用新型试剂盒示意图；
[0012]图2为本实用新型实施例规格为150mL的试剂瓶正视图；
[0013]图3为本实用新型实施例规格为150mL的试剂瓶侧视图。
[0014]其中，1-盒盖，2-盒体，3-衬垫，4-圆柱形凹槽，5-装有PBS溶液的试剂瓶，6_装有密度液的试剂瓶，7-装有0.9 %氯化钠注射液的试剂瓶，8-装有0.8 %氯化氨溶液的试剂瓶，9-圆形凹槽。
【具体实施方式】
[0015]下面详细描述本实用新型的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本实用新型，而不能理解为对本实用新型的限制。
[0016]一种人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒，包括盒盖1、盒体2，所述盒体2内设置有与盒体2尺寸大小相同的纸衬垫3，所述纸衬垫3设置有四个圆柱形凹槽4，所述四个圆柱形凹槽4分别放置有:装有PBS溶液的试剂瓶5，装有密度液的试剂瓶6，装有0.9%氯化钠注射液的试剂瓶7，装有0.8%氯化氨溶液的试剂瓶8，所述四个圆柱形凹槽4的直径分别与所述试剂瓶5、试剂瓶6、试剂瓶7、试剂瓶8的外径相等，所述试剂瓶6装有的密度液为Ficoll溶液，所述试剂瓶5、试剂瓶6、试剂瓶7的表面两侧均分别设有便于手持的圆形凹槽9。
[0017]其中，试剂瓶5规格为250mL，所述试剂瓶6规格为150mL，所述试剂瓶7规格为250mL，所述试剂瓶8规格为50mL。
[0018]利用上述试剂盒分离10ml脐带血干细胞方法步骤如下:
[0019](I)取试剂瓶5中的稀释液100ml，按1:1比例稀释脐血，混匀，可4度保存备用；
[0020](2)取20个15ml的离心管，用1ml移液管从试剂瓶6中吸取4ml密度液加入各官中备用；
[0021](3)用1ml的移液管吸取脐血各10ml，沿离心管壁缓慢叠加于密度液液面上，保持清楚的界面；
[0022](4)水平离心，转速2114rpm，离心时间25分钟，温度21度；
[0023](5)取四个50ml离心管，各加入35ml试剂瓶7中的洗涤液，备用；
[0024](6)步骤4离心后，离心管内样品溶液分为四层，用巴氏吸管吸取第三层(白色云雾层狭窄带)平均分于步骤5中的四个离心管中，混匀；水平离心1674rpmX20分钟，温度21度；
[0025](7)用25ml移液管吸去上清，用1ml移液管从试剂瓶7中吸取5ml的洗涤液于一离心管中，重悬细胞，并依次将四管细胞汇集到一个50ml离心管中，轻柔吹打混匀；
[0026](8)若步骤7中红细胞过多，则在离心管中缓慢加入15ml试剂瓶8中的除红细胞液，混匀，反应6分钟，其中每隔2分钟混匀一次；水平离心1674rpmX 10分钟，温度21度；
[0027](9)用1ml移液管吸去上清，加入20ml试剂瓶7中的洗涤液，混匀；水平离心，转速1674rpm，离心时间20分钟，温度21度；
[0028](10)若重悬的细胞出现明显可见大颗粒沉淀，可采用过滤器进行过滤；再将过滤液进行离心；水平离心，转速1674rpm，离心时间20分钟，温度21度；
[0029](11)用1ml移液管吸去上清，加入20ml试剂瓶7中的洗涤液，混匀；水平离心，转速1674rpm，离心时间20分钟，温度21度；
[0030](12)用1ml移液管吸去上清，根据需要加入5ml或者20ml试剂瓶7中的洗涤液重悬细胞，保存备用。
[0031]通过本实用新型试剂盒，无需自行称量配制或另行购买，使用方便，操作简单，省时省力，提高工作效率。能够分离人类骨髓或脐带血或外周血中的干细胞，将试剂盒中4种试剂组合应用，并通过试剂瓶6中的试剂密度梯度离心，根据各种细胞密度差异将它们分散于自上而下的试剂层次，去除人类骨髓或人类脐带血或外周血中的血浆，血小板，血红蛋白，粒细胞和大部分红细胞等，经过本实用新型分离的干细胞回收率能够达到85%以上；
[0032]尽管已经示出和描述了本实用新型的实施例，本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本实用新型的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本实用新型的范围由权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1.一种人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒，包括盒盖(I)、盒体(2)，其特征在于，所述盒体⑵内设置有与盒体⑵尺寸大小相同的衬垫(3)，所述衬垫(3)设置有四个圆柱形凹槽(4)，所述四个圆柱形凹槽(4)分别放置有:装有PBS溶液的试剂瓶(5)，装有密度液的试剂瓶出)，装有0.9%氯化钠注射液的试剂瓶(7)，装有0.8%氯化氨溶液的试剂瓶(8)，所述四个圆柱形凹槽(4)的直径分别与所述试剂瓶(5)、试剂瓶￠)、试剂瓶(7)、试剂瓶(8)的外径相等。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂瓶(6)装有的密度液为泛影酸钠-聚蔗糖400#或HIST0PAQUE1077或FicolI，所述泛影酸钠-聚蔗糖400#是由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.077±0.001的密度液。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂瓶(5)、试剂瓶￠)、试剂瓶(7)的表面两侧均分别设有便于手持的圆形凹槽(9)。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂瓶(5)规格为250mL，所述试剂瓶(6)规格为150mL，所述试剂瓶(7)规格为250mL，所述试剂瓶⑶规格为50mL，所述试剂瓶(5)、试剂瓶￠)、试剂瓶(7)、试剂瓶(8)瓶体表面均设有相应的体积刻度。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述衬垫(3)为纸衬垫或海绵衬垫或泡沫衬垫。
【专利摘要】本实用新型提供一种人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒，包括盒盖、盒体，所述盒体内放置有：装有PBS溶液的试剂瓶，装有密度液的试剂瓶，装有0.9％氯化钠注射液的试剂瓶，装有0.8％氯化氨溶液的试剂瓶，所述四个圆柱形凹槽的直径分别与上述四个试剂瓶的外径相等，其中，PBS溶液为稀释液；0.9％氯化钠液为洗涤液；0.8％氯化氨溶液为除红细胞液，本试剂盒，无需使用者另外准备溶液，省去使用者的准备工作，也避免使用者人为的污染或者第三方污染引入，适用于人类骨髓、脐带血、外周血的干细胞分离。
【IPC分类】C12M1/00
【公开号】CN204625610
【申请号】CN201520291702
【发明人】姚惟琦, 武栋成
【申请人】武汉汉密顿生物科技股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月7日